一种固定化酶载体、固定化酶以及制备方法
阅读说明：本技术 一种固定化酶载体、固定化酶以及制备方法 (Immobilized enzyme carrier, immobilized enzyme and preparation method ) 是由 陈峻青 汤玉琪 于 2021-09-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种固定化酶载体、固定化酶及制备方法。本发明通过壳聚糖的大分子颗粒附着在鸡蛋壳膜的表面并通过共沉淀的方式将磁性Fe-(3)O-(4)均匀沉淀分布在蛋壳膜上,制备出磁性Fe-(3)O-(4)/CS/ESMP作为固定化β-葡萄糖苷酶的酶载体,增加了酶结构的刚性以及耐受性,具有良好的操作稳定性；此外,制备的Fe-(3)O-(4)/CS/ESMP@BG可以重复使用,操作简便。Fe-(3)O-(4)/CS/ESMP@BG在磁场的作用下易于分离收集从而重复回收利用,提高了酶的使用效率,制备的Fe-(3)O-(4)/CS/ESMP@BG可应用于京尼平的生物合成。(The invention discloses an immobilized enzyme carrier, an immobilized enzyme and a preparation method. The invention attaches the macromolecular particles of chitosan on the surface of the eggshell membrane and makes the magnetic Fe in a coprecipitation way 3 O 4 Uniformly depositing and distributing on the eggshell membrane to prepare magnetic Fe 3 O 4 the/CS/ESMP is used as an enzyme carrier of the immobilized beta-glucosidase, so that the rigidity and the tolerance of an enzyme structure are increased, and the operation stability is good; in addition, Fe produced 3 O 4 the/CS/ESMP @ BG can be repeatedly used and is simple and convenient to operate. Fe 3 O 4 the/CS/ESMP @ BG is easy to separate and collect under the action of a magnetic field so as to be recycled, the use efficiency of enzyme is improved, and the prepared Fe 3 O 4 the/CS/ESMP @ BG can be applied to the biosynthesis of genipin.)
技术领域
本发明属于固定化酶技术领域，具体涉及到一种固定化酶载体、固定化酶、制备方法。
背景技术
京尼平是栀子苷的苷元，在茜草科栀子、天竺葵、杜仲等植物中均有发现。据报道京尼平具有抗氧化,抗炎，抗肿瘤，抗抑郁，抗真菌，反血管增生，治疗糖尿病药、免疫抑制剂的作用,用于治疗黄疸、水肿和高血压,并能抑制一些癌细胞的扩散,包括白血病、乳腺癌、前列腺癌和肝细胞癌，这使京尼平广泛应用于生物医学领域。一些研究还报道了京尼平在蛋白质与胶原蛋白、明胶、壳聚糖等聚合物之间产生交联的巨大能力。此外，京尼平由于其较低的细胞毒性，更安全的应用于食品加工。
在现代生物技术和生物医学领域中，酶因其效率高、特异性强等特点而发挥着重要作用。然而，从工业角度来看，游离酶也存在诸多缺点，如重复使用性不理想、催化寿命短、对温度、pH和某些环境因素的操作稳定性低，回收再利用困难，严重阻碍了其在大工业层面的大规模应用。为了解决这一技术问题，有必要对固定化酶的性质进行研究。酶固定化是克服这一限制的有力手段，并提供了生物催化剂的酶特性。然而高效和简单的固定化方法需要进一步的研究。
壳聚糖是第二丰富的天然聚合物，由甲壳素去乙酰化通过碱性处理。由于从螃蟹、虾、对虾、龙虾、小龙虾、磷虾和昆虫的壳中生产甲壳素和壳聚糖，壳聚糖的应用具有商业吸引力。由于其无毒性、生物相容性、良好的生物降解性、对蛋白质的高亲和力、生理惰性使壳聚糖成为理想的酶固定化载体材料。
蛋壳膜是食品工业中大量的废弃物，在高分子工业中是一种很有前途的补强剂候选材料，具有良好的韧性和冲击强度。蛋壳膜的有机基质中约60％的蛋白质分布在胶原蛋白(35％)、葡萄糖胺(10％)、软骨素(9％)和透明质酸(5％)中，而无机部分含有少量的Ca、Mg、Si、Zn和大量的氮。因此，ESM蛋白使其对酸、碱性化合物和蛋白酶稳定。此外， ESM不溶于水，因为它含有大量的半胱氨酸和赖氨酸，它们在蛋白质分子之间形成了分子桥。特别地，对底物和产物具有极好的渗透性，使其成为酶固定化的理想支撑系统。研究结果表明，将酶固定化技术应用于生活垃圾(如ESM)，这不仅是一种很有前景的酶固定材料，而且是一种很有前景的生物技术应用平台。
氧化铁纳米颗粒是工业和生物
技术领域
研究最多的磁性纳米颗粒，由于铁粒子可以是纳米级的，所以它们会变成超顺磁性，从而避免自结块。使用磁性纳米材料作为酶载体制备的固定化酶，不仅稳定性有所提高，还可以通过磁场吸附磁性材料来实现固定化酶的快速分离和回收，达到多次重复使用的目的。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种固定化酶载体，固定化载体由Fe3O4/CS/ESMP组成，并且提前将京尼平作交联剂与Fe3O4/CS/ESMP浸润，使得制备的固定化酶载体更方便取用。本发明进一步提供了固定有β-葡萄糖苷酶的固定化酶，β-葡萄糖苷酶固定在磁性 Fe3O4/CS/ESMP上，提高了酶的刚度以及耐受性。本发明还提供了固定化酶载体以及固定化酶的制备方法。
技术方案：本发明所述的一种固定化酶载体，所述固定化酶载体通过以下方法制备：
(1a)制备壳聚糖溶液；
(1b)制备含有Fe2+以及Fe3+的溶液，将步骤(1a)的壳聚糖溶液加入含有铁离子溶液中，得到混合溶液，壳聚糖在混合溶液中的浓度为0.015-0.025g/mL；随后向所得混合溶液中加入ESMP，壳聚糖以及ESMP的质量比为1-3:1-3，搅拌均匀后，加入氨水进行初步沉淀，再加入氢氧化钠溶液进行二次沉淀，得到颗粒状载体；
(1c)将步骤(1b)所得的载体洗涤后加入京尼平溶液中浸润，得到固定化酶载体。
优选地，步骤(1a)中，所述壳聚糖的脱乙酰度≥85％，粘度为50-400mPa.s。
优选地，步骤(1c)中，所述京尼平溶液的浓度为10-50mmol/L。
优选地，步骤(1b)中，所述Fe2+在混合溶液中的浓度为0.1-0.2mol/L，Fe3+在混合溶液中的浓度为0.2-0.4mol/L。
优选地，所述Fe2+与Fe3+的摩尔比为2:1。
优选地，步骤(1b)中，所述壳聚糖以及ESMP的质量比为1：2。
优选地，步骤(1b)中，将溶液升温至75-85℃，向其中加入氨水作为沉淀剂，进行初步沉淀，使得初步沉淀的温度控制在75-85℃。
优选地，所述氨水的质量百分浓度为25-28％。
优选地，步骤(1b)中，所述氢氧化钠溶液质量百分浓度为8-12％。
优选地，氢氧化钠溶液的溶剂由体积比为1:3的乙醇:水组成。
优选地，步骤(1c)中，载体的交联反应在45-55℃，15-25mmol/L的京尼平溶液中进行，交联时间优选为4-6h；随后用去离子水冲洗，4℃保存。
本发明所述的固定化酶载体的制备方法，包括以下步骤：
(2a)制备壳聚糖溶液；
(2b)制备含有Fe2+以及Fe3+的溶液，将步骤(2a)的壳聚糖溶液加入含有铁离子溶液中，得到混合溶液，壳聚糖在混合溶液中的质量为0.015-0.025g/mL，；随后向所得混合溶液中加入ESMP，壳聚糖以及ESMP的质量比为1-3:1-3，搅拌均匀后，加入氨水进行初步沉淀，再加入氢氧化钠溶液进行二次沉淀，得到颗粒状载体；
(2c)将步骤(2b)所得的载体洗涤后加入京尼平溶液中浸润，得到固定化酶载体。
本发明所述的固定化酶载体的制备方法中的参数限定与固定化酶载体制备中的参数限定相同。
本发明进一步提供了一种固定化酶，该固定化酶为将游离酶溶液与所述的固定化酶载体交联而成。
此处的游离酶可以选择多种，进一步地，所述游离酶为β-葡萄糖苷酶。
本发明所述的一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
(3a)制备壳聚糖溶液；
(3b)制备含有Fe2+以及Fe3+的溶液，将步骤(3a)的壳聚糖溶液加入含有铁离子溶液中，得到混合溶液，壳聚糖在混合溶液中的浓度为0.015-0.025g/mL；随后向所得混合溶液中加入ESMP，壳聚糖以及ESMP的质量比为1-3:1-3，搅拌均匀后，加入氨水进行初步沉淀，再加入氢氧化钠溶液进行二次沉淀，得到颗粒状载体；
(3c)将步骤(3b)所得的载体洗涤后加入京尼平溶液中浸润，得到固定化酶载体；
(3d)将步骤(3c)所得的固定化酶载体与β-葡萄糖苷酶溶液孵育，得到固定化β-葡萄糖苷酶。
本发明中固定化酶的制备方法中的参数限定与固定化酶载体制备中的参数限定相同。
优选地，步骤(3d)中，所述的固定化酶载体与β-葡萄糖苷酶溶液孵育的条件为：将质量比6-8：1的固定化酶载体与β-葡萄糖苷酶在4℃下孵育3-5h，微摇，将β-葡萄糖苷酶固定在固定化酶载体上后，用pH 7.0的磷酸钠缓冲液冲洗至无蛋白检出，在磁场的作用下收集Fe3O4/CS/[email protected]。
本发明所述固定化酶的制备优选的方法为：(a)先制备壳聚糖溶液；
(b)将FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O按照1∶2的摩尔比例混合，加水溶解，将壳聚糖溶液等体积加入含有铁离子溶液中，得到混合溶液，壳聚糖在混合溶液中的浓度为 0.017-0.018g/mL，Fe2+在混合溶液中的浓度为0.1-0.15mol/L，Fe3+在混合溶液中的浓度为0.2-0.3mol/L；随后向所得混合溶液中加入ESMP，壳聚糖以及ESMP的质量比为1： 2，搅拌均匀后，升温至75-85℃，加入质量浓度为25-28％的氨水，搅拌1-2h，进行初步沉淀，随后，室温下再加入质量浓度为8-12％氢氧化钠溶液(溶剂为乙醇与水的体积比为1:3)进行二次沉淀，得到颗粒状载体，得到的颗粒状载体依次用去离子水、乙醇溶液(乙醇与水的体积比为1:1)和去离子水洗涤，直至中性；
(c)将步骤(b)所得的载体洗涤后加入15-25mmol/L京尼平溶液中，升温至 45-55℃，浸润4-6h，得到固定化酶载体；
(d)将质量比6-8：1的固定化酶载体与β-葡萄糖苷酶(β-葡萄糖苷酶溶解在pH 7.0的PBS缓冲溶液中)，在4℃下孵育3-5h，所有样品用pH 7.0的磷酸钠缓冲液冲洗至无蛋白检出，在磁场的作用下收集Fe3O4/CS/[email protected]。
除非另有说明，本发明中所述的“％”为质量百分浓度。
有益效果：(1)本发明利用共沉淀交联法制备出磁性Fe3O4/CS/ESMP作为固定化β-葡萄糖苷酶(BG)的酶载体，利用京尼平作交联剂将β-葡萄糖苷酶固定在磁性 Fe3O4/CS/ESMP，增加了酶的结构刚性；(2)本发明制备的纳米级Fe3O4/CS/[email protected] 与游离BG相比，Fe3O4/CS/[email protected]对温度、pH变化以及有机溶剂的耐受性较强，具有良好的操作稳定性；(3)本发明的固定化酶具有良好的酶负载量和活性回收率， Fe3O4/CS/[email protected]可以重复使用，操作简便，该固定化酶在磁场的作用下易于分离收集从而重复回收利用，提高了酶的使用效率。
附图说明
图1为不同条件下制备的固定化酶载体对酶活性的影响；
图2为游离BG以及Fe3O4/CS/[email protected]最适温度的筛选；
图3为游离BG以及Fe3O4/CS/[email protected]的最佳pH的筛选；
图4为Fe3O4/CS/[email protected]循环利用率结果；
图5为ESMP以及Fe3O4/CS/ESMP的扫描电镜图，其中，A图和B图为ESMP的扫描电镜图，C图、D图、E图、F图为Fe3O4/CS/ESMP扫描电镜图；
图6为Fe3O4/CS/ESMP(A,C)和Fe3O4/CS/[email protected](B,D)的共聚焦显微镜分析，其中，图A和图C为固定化酶载体Fe3O4/CS/ESMP，图B和图D为固定化酶 Fe3O4/CS/[email protected]。
具体实施方式
一、固定化酶载体的制备
1.1ESMP对固定化酶载体的性能影响
将0.5g Fe3O4(制备条件参考MCESM1中的Fe3O4制备方法)与20mL过滤后的壳聚糖溶液(质量浓度为3.5％)室温搅拌1h，向其中滴加10％的氢氧化钠溶液(25％乙醇： 75％水，v/v)，得到的大颗粒依次用去离子水、乙醇溶液(50％乙醇：50％水，v/v)和去离子水洗涤，直至中性。将所得大颗粒在50℃条件下，20mmol/L的京尼平溶液中进行孵育，5h后用去离子水冲洗，将BG与Fe3O4/CS按照质量比为1：8添加到10mL反应器中，加入1mLPBS缓冲液(pH7.0)的β-葡萄糖苷酶在4℃下孵育3h，在磁场的作用下收集Fe3O4/CS/[email protected]。测得酶活为52.4％。
在壳聚糖基水凝胶颗粒的形成过程中，加入ESMP可作为模板部分溶解在氢氧化钠溶液中，改善多孔结构。ESM的形态呈现多层交织的纤维网络结构。由于其特殊的形状，可通过物理和化学交联连接更多的壳聚糖链。因此，ESMP可以改善大颗粒内部结构的连通性，这可以导致大颗粒的多重网格结构和孔隙率的增加。此外，我们认为蛋壳膜中丰富的蛋白质残基可以发挥多位点吸盘的作用，提高壳聚糖基大颗粒对蛋白质分子的捕获能力。因此加入ESMP可增加固定化酶的活性。
1.2不同制备条件对大颗粒的形貌以及相对酶活的影响。
通过以下不同方法制备的固定化酶载体Fe3O4/CS/ESMP被分别命名为MCESM1，MCESM2，MCESM3，MCESM4，MCESM5，MCESM6。
MCESM1：将FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O两种溶液按照1∶2的摩尔比例混合，升温至80℃，搅拌60min，向其中加入28％氨水作为沉淀剂，将混合溶液中的过滤、洗涤、干燥得到纳米级Fe3O4。
将壳聚糖(高粘度，粘度＞400mPa.s)粉溶解在含有2％(w/v)乙酸水溶液中，50℃搅拌4h，得到0.035g/mL的壳聚糖溶液，然后用纱布过滤。同时，将ESMP(粒径小于 80微米)分散在水溶液中，继续搅拌，得到浓度为0.07g/mL ESMP溶液。
将0.5g Fe3O4与20mL过滤后的壳聚糖溶液室温搅拌1h，随后与5mL的ESMP溶液混合搅拌2h后，向其中滴加10％的氢氧化钠溶液(25％乙醇：75％水，v/v)中。得到的大颗粒依次用去离子水、乙醇溶液(50％乙醇：50％水，v/v)和去离子水洗涤，直至中性。
将所得大颗粒在50℃条件下，20mmol/L的京尼平溶液中进行孵育，5h后用去离子水冲洗，4℃保存。
MCESM2：将FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O两种溶液按照1∶2的摩尔比例混合，升温至80℃，搅拌60min，向其中加入28％氨水作为沉淀剂，将混合溶液中的过滤、洗涤、干燥得到纳米级Fe3O4。
将壳聚糖(脱乙酰度≥85％，粘度为50mPa.s)粉溶解在2％(w/v)乙酸水溶液中，50℃搅拌4h，得到0.035g/mL的壳聚糖溶液，然后用纱布过滤。同时，将ESMP分散在水溶液中，继续搅拌，得到浓度为0.07g/mL的ESMP分散水溶液。将0.5g Fe3O4与20mL 过滤后的壳聚糖室温搅拌1h，随后与5mL的ESMP溶液混合搅拌2h后，向其中滴加 10％的氢氧化钠溶液(25％乙醇：75％水，v/v)中。得到的大颗粒依次用去离子水、乙醇溶液(50％乙醇：50％水，v/v)和去离子水洗涤，直至中性。所有大颗粒的交联反应在 50℃、20mmol/L的京尼平溶液中进行。5h后用去离子水冲洗，4℃保存。
MCESM3：取1g上述制备的纳米级Fe3O4与20mL过滤后的0.035g/mL壳聚糖(脱乙酰度≥85％，粘度为50mPa.s)的2％(w/v)乙酸水溶液，室温搅拌1h与5mL的0.07g/mL 的ESMP溶液混合搅拌2h后，向其中滴加10％的氢氧化钠溶液(25％乙醇：75％水，v/v)，得到的大颗粒依次用去离子水、乙醇溶液(50％乙醇：50％水，v/v)和去离子水洗涤，直至中性。所有大颗粒的交联反应在50℃、20mmol/L的京尼平溶液中进行。5h后用去离子水冲洗，4℃保存。
MCESM4：在20mL含FeCl2·4H2O、0.89g、FeCl3·6H2O 2.42g水溶液中，向其中加入20mL过滤后的0.035g/mL壳聚糖(脱乙酰度≥85％，粘度为50mPa.s)的2％(w/v) 乙酸水溶液，室温搅拌1h，在与20mL的0.07g/mL的ESMP溶液混合搅拌2h后，升温至80℃，向其中加入28％氨水作为沉淀剂,搅拌1h，向其中滴加10％的氢氧化钠溶液(25％乙醇：75％水，v/v)，得到的大颗粒依次用去离子水、乙醇溶液(50％乙醇：50％水，v/v)和去离子水洗涤，直至中性。所有大颗粒的交联反应在50℃、20mmol/L的京尼平溶液中进行。5h后用去离子水冲洗，4℃保存。
MCESM5：在20mL含FeCl2·4H2O 0.89g、FeCl3·6H2O 2.42g水溶液中，向其中加入20mL过滤后的0.035g/mL壳聚糖(脱乙酰度≥85％，粘度为50mPa.s)的2％(w/v)乙酸水溶液，室温搅拌1h，向其中加入1.4g ESMP混合搅拌2h后，升温至80℃，向其中加入氨水作为沉淀剂，搅拌1h，向其中滴加10％的氢氧化钠溶液(25％乙醇：75％水， v/v)，得到的大颗粒依次用去离子水、乙醇溶液(50％乙醇：50％水，v/v))和去离子水洗涤，直至中性。所有大颗粒的交联反应在50℃、20mmol/L的京尼平溶液中进行。5h 后用去离子水冲洗，4℃保存。
MCESM6：在20mL含FeCl2·4H2O 0.89g、FeCl3·6H2O2.42g水溶液中，向其中加入20mL过滤后的0.035g/mL壳聚糖(脱乙酰度≥85％)的2％(w/v)乙酸水溶液，室温搅拌 1h，向其中加入1.4g的ESMP混合搅拌2h后，升温至80℃，向其中滴加10％的氢氧化钠溶液(25％乙醇：75％水，v/v)，得到的大颗粒依次用去离子水、乙醇(50％乙醇：50％水，v/v)和去离子水洗涤，直至中性。所有大颗粒的交联反应在50℃、20mmol/L的京尼平溶液中进行。5h后用去离子水冲洗，4℃保存。
将所得载体进行筛选，结果见图1，从图1的结果可以看出，CS、加入顺序以及浓度均对最后的固定酶的活性有影响，最终选择MCESM5的实验条件进行下一步筛选。
1.3结果评价
实施例1：磁性壳聚糖蛋壳膜(Fe3O4/CS/ESMP)的制备，包括以下步骤：
步骤1：将壳聚糖粉溶解在2％(w/v)乙酸水溶液中，50℃搅拌4h，得到0.035g/mL的壳聚糖溶液，然后用纱布过滤。在20mL含FeCl2·4H2O 0.89g、FeCl3·6H2O 2.42g水溶液中，向其中加入20mL过滤后的质量百分浓度为0.035g/mL的壳聚糖(脱乙酰度≥85％，粘度为50mPa.s)的2％(w/v)乙酸水溶液，室温搅拌1h，向其中加入1.4gESMP 混合搅拌2h后，升温至80℃，向其中加入氨水作为沉淀剂，搅拌1h，随后，室温下向其中滴加10％的氢氧化钠溶液(25％乙醇：75％水，v/v)，得到的大颗粒依次用去离子水、乙醇(50％乙醇：50％水，v/v)和去离子水洗涤，直至中性。所有大颗粒的交联反应在 50℃、20mmol/L的京尼平溶液中进行，5h后用去离子水冲洗，4℃保存。
得到的固定化酶载体扫描电镜图见图5，图5中的A图和B图为ESMP的扫描电镜图，图C、图D、图E、图F为Fe3O4/CS/ESMP扫描电镜图，从图中可以看出，ESMP 的形态呈现多层交织的纤维网络结构，如图5中的A图和B图所示。ESMP的存在对壳聚糖链产生了拉动作用，使壳聚糖链的排列更加松散，从而降低了壳聚糖链堆积形成的多孔结构，这有利于提高宏观颗粒的固载能力。从图5中的C图、D图、E图,F图的形状以及表面结构，可以观察到通过共沉淀的方法制备的Fe3O4颗粒大小均匀的负载在ESMP材料表面，并被壳聚糖层覆盖，保持了基本的ESMP的交织的棒状表面形态，这与我们预期结果表现一致，可以看出Fe3O4/CS/ESMP制备的成功。
实施例2：固定化β-葡萄糖苷酶的制备
将实施例1制备的BG与Fe3O4/CS/ESMP按照质量比为1：8添加到10mL反应器中，加入1mLPBS缓冲液(pH 7.0)的β-葡萄糖苷酶在4℃下孵育3h，将β-葡萄糖苷酶固定在交联大颗粒上后，所有样品用pH 7.0的磷酸钠缓冲液冲洗至无蛋白检出，在磁场的作用下收集Fe3O4/CS/[email protected]。
为了进一步确认所制备的Fe3O4/CS/ESMP上目标β-葡萄糖苷酶的存在，我们对Fe3O4/CS/ESMP和Fe3O4/CS/[email protected]进行了共聚焦激光扫描显微镜(CLSM) 分析，用异硫氰酸荧光素酯标记的Fe3O4/CS/[email protected]的共聚焦显微镜分析见图6。从图6中的A图和C图所示的样品形态图像中，很明显，通过BG加载没有显示荧光信号。然而在图6中的B图和D图中，可以观察到异硫氰酸荧光素酯(FITC)标记的β-葡萄糖苷酶在固定后显示出强绿色荧光信号，表明β-葡萄糖苷酶已经通过京尼平成功地交联到Fe3O4/CS/ESMP的表面。
实施例3：Fe3O4/CS/[email protected]的催化性能的测定
如图1所示，游离BG的最佳温度为50℃，而Fe3O4/CS/[email protected]在60℃时显示出最大活性。BG通过京尼平的交联使Fe3O4/CS/[email protected]酶蛋白形成共价键，从而极大地稳定了酶蛋白的空间构象。在更高的温度下，酶的分子结构仍可以保持稳定的结构并保持高活性。测定方法：活性测定：分别将游离β-葡萄糖苷酶，Fe3O4/CS/[email protected]，加入到1mlPBS磷酸缓冲液中(100mmol/L，pH 7)，在30-90℃条件下，测定游离β- 葡萄糖苷酶，Fe3O4/CS/ESMP的酶活，分别以游离β-葡萄糖苷酶，Fe3O4/CS/[email protected] 的最适温度的酶活为100％，计算各个温度条件下游离酶和固定化酶的相对酶活。结果见图2。
如图3所示，游离BG和Fe3O4/CS/[email protected]的最佳pH值为6。而 Fe3O4/CS/[email protected]比游离BG更能适应恶劣的pH条件。Fe3O4/CS/[email protected]在相对碱性条件下的出色性能可以突出其在工业应用中的潜力。通常，通过交联将BG固定在 Fe3O4/CS/ESMP载体上，Fe3O4/CS/[email protected]具有更好的pH适应性，其性能明显优于游离BG。
测定方法：分别将游离β-葡萄糖苷酶，Fe3O4/CS/[email protected]，加入到1mlPBS磷酸缓冲液中(100mmol/L，pH为7)，在pH 3-9条件下，测定游离β-葡萄糖苷酶， Fe3O4/CS/ESMP的酶活，分别以游离β-葡萄糖苷酶，Fe3O4/CS/[email protected]的最适pH 的酶活为100％，计算各个pH条件下游离酶和固定化酶的相对酶活。
如图4所示，Fe3O4/CS/[email protected]具有可回收利用性。使用Fe3O4/CS/[email protected] 作为催化剂可以实现催化剂的重复使用。每次反应后，都可以在磁场作用下轻松分离。使用10个周期后，酶活回收率仍可达到91.4％。固定化酶的最大优点是可以重复使用以提高酶的经济性。因此，使用Fe3O4/CS/[email protected]作为催化剂可以降低生产成本，具有更大的工业化前景。
测定方法：以Fe3O4/CS/ESMP催化pNPG(1mM)作为模板反应，以研究 Fe3O4/CS/[email protected]的操作稳定性。将Fe3O4/CS/[email protected]添加到含有pNPG(1mM， pH＝6)的缓冲溶液中，以在磁场的作用下反应，分离并收集固定化的酶，并用缓冲溶液洗涤3次。以确保不会检测到任何产品痕迹。之后继续与等量的含pNPG(1mM，pH＝6) 的缓冲液反应，并以此方式重复10批，活性保留数据以第一批反应的酶活性为100％为基准。
实施例4：Fe3O4/CS/[email protected]生物催化合成京尼平的方法
取实施例2制备的固定化酶1g，加入到pH为6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，并迅速加入20mg京尼平苷，在50℃下搅拌5h，使其完全反应，并将固定化酶取出，即得京尼平粗品水溶液。采用大孔树脂(HPD700)纯化京尼平的方法，对上述最适条件下产生的京尼平粗品水溶液经大孔树吸附至饱和。吸附完后用无水乙醇进行洗脱，将洗脱液旋蒸得产物。用乙醚反复萃取，萃取液旋转后用丙酮重结晶，晶体经低温干燥获得。
根据本发明的实验结果，用固定化酶催化合成京尼平，催化时间比使用游离β-葡萄糖苷酶稍长，但催化产率能达到92.6％，并催化剂可以多次使用，能够实现生产利益的最大化
上述实施例仅为本发明的部分实施例，并非用来限定本发明的实施范围；即凡依本发明内容所作的均等变化与修饰，都为本发明权利要求所要求保护的范围所涵盖。
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