具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

一种检测溶酶体极性变化的荧光探针，具有溶酶体定位能力，所述检测溶酶体极性变化的荧光探针的名称为Nap-NH₂，所述检测溶酶体极性变化的荧光探针的结构式为如式(1)：

所述检测溶酶体极性变化的荧光探针对极性具有良好的响应和敏感性，并且以PC12细胞为研究对象，探针Nap-NH₂可以应用于细胞溶酶体自噬过程中，监测由自噬抑制药物在制革残留物诱导细胞炎症过程中的治疗作用，促进了对自噬与炎症的认识。同时，本发明提供的所述检测溶酶体极性变化的荧光探针合成简单，分离纯化方便，产率高。如下为本发明所述检测溶酶体极性变化的荧光探针的制备方法。

上述检测溶酶体极性变化的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)4-溴-1,8-萘二甲酸酐(1)与N-(2-氨基乙基)吗啉(2)于乙醇作为溶剂A中发生取代反应，分离纯化得Nap-Br(3)，该步骤的化学反应式如下：

(2)Nap-Br(3)与4-乙炔基苯胺(4)在CuI环境中，以四氢呋喃和三乙胺的混合溶液作为溶剂B(其中，四氢呋喃和三乙胺的混合体积比为1:1～3)，Pd(PPh₃)₂Cl₂为催化剂进行缩合反应，经分离纯化后得到最终产物Nap-NH₂(5)，即为所述检测溶酶体极性变化的荧光探针。该步骤的化学反应式如下。

步骤(1)中，所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐与N-(2-氨基乙基)吗啉的摩尔比为1.0:1.0～1.5，优选地，摩尔比为1.0:1.3。步骤(1)中，取代反应的温度为40℃。步骤(1)中，取代反应的时间为1～5h；优选地，反应时间为2h。

步骤(2)中，所述Nap-Br与4-乙炔基苯胺的摩尔比为1.0:1.0～1，优选地，摩尔比为1.0:1.1。步骤(2)中，缩合反应的温度为25～30℃，优选地，反应温度为25℃。步骤(2)中，缩合反应的时间为10～24h；优选地，反应时间为12h。

步骤(2)中，CuI、Pd(PPh₃)₂Cl₂与步骤(1)所得Nap-Br的摩尔比为0.003:0.4:1.0。

步骤(1)中，所述分离纯化步骤为：将反应后的体系冷却到室温，抽滤后真空干燥。

步骤(2)中，所述分离纯化步骤为：经柱层析色谱分离得到提纯产物，所述柱层析色谱分离的流动相为体积比为10:1的二氯甲烷和石油醚。

步骤(2)中，在惰性气体保护气氛中进行。

步骤(2)中，优选地，四氢呋喃和三乙胺的混合体积比为2:1。

本发明所述检测溶酶体极性变化的荧光探针的机理如下：在所述检测溶酶体极性变化的荧光探针结构中，萘酰亚胺为双光子荧光团，吗啉基团为溶酶体靶向基团，4-乙炔基苯胺为光学调节手柄。探针分子Nap-NH₂作为一种D-π-A化合物具有较强的极性响应效果。在细胞自噬的过程中，由于溶酶体胞吞的产生，导致溶酶体膜的极性逐渐增大，因此溶酶体的极性呈现变小的状态。对于探针分子Nap-NH₂来说，由于4-乙炔基苯胺结构的存在，使得探针具有极性响应性质，探针的荧光强度随着溶剂极性的减小而逐渐增大。因此，本发明所述检测溶酶体极性变化的荧光探针可以通过对荧光强度的变化来描述溶酶体极性的变化，进而探究细胞自噬与炎症的关系。因此，本发明上述荧光探针能够应用于检测细胞溶酶体极性，将所述检测溶酶体极性变化的荧光探针应用于因细胞自噬引起的溶酶体极性的改变，以探究细胞自噬与炎症之间的关系。

下面将结合具体实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1

(1)称取277mg 4-溴-1,8-萘二甲酸酐(1mmol)和169mg N-(2-氨基乙基)吗啉(1.3mmol)加入到2ml乙醇的圆底烧瓶中，40℃下加热回流2h进行取代反应。取代反应结束后冷却到室温后，抽滤并真空干燥取代产物混合物，即得到Nap-Br。

(2)将3.89g化合物Nap-Br(10mmol)，36.79mg Pd(PPh₃)₂Cl₂(0.03mmol)，7.62mgCuI(4mmol)加入圆底烧瓶，用50ml四氢呋喃和50ml三乙胺的混合溶液溶解后鼓氮气15分钟，得到反应体系。继续将1.18g 4-乙炔基苯胺(10.10mmol)溶于50ml四氢呋喃后加入到上述反应体系中，在25℃、CuI环境中、以Pd(PPh₃)₂Cl₂为催化剂进行缩合反应。将混合物回流搅拌12h后缩合反应结束，得到缩合产物混合物，而后旋蒸除去缩合产物混合物中的多种溶剂得到反应体系浓缩液，将所得反应体系浓缩液用柱层析色谱纯化，所述柱层析色谱分离的流动相为体积比为10:1的二氯甲烷和石油醚。将纯化后的产物通过旋蒸的方法除去流动相溶剂，最后真空干燥后得到本发明所述检测溶酶体极性变化的荧光探针Nap-NH₂。本实施例的收率为95％。

本实施例制得的检测溶酶体极性变化的荧光探针的¹H NMR谱如图1，探针的¹³CNMR谱如图2：

¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.66(d,J＝8.3Hz,1H),8.47(d,J＝7.1Hz,1H),8.34(d,J＝7.6Hz,1H),8.01–7.81(m,2H),7.43(d,J＝8.2Hz,2H),6.63(d,J＝8.3Hz,2H),5.86(s,2H),4.14(t,J＝6.5Hz,2H),3.53(s,4H),2.59–2.51(m,2H),2.45(s,4H).

¹³CNMR(101MHz,DMSO)δ163.62,163.31,151.19,133.97,132.57,131.59,130.95,130.65,129.98,128.29,128.24,127.85,122.84,120.86,114.11,107.27,102.84,84.93,66.69,55.98,53.87,37.32.HRMS m/z calc.for C₂₆H₂₃N₃O₃:426.18122；found:426.18127[M+H]⁺.

实施例2

(1)称取277mg 4-溴-1,8-萘二甲酸酐(1mmol)和130mg N-(2-氨基乙基)吗啉(1.0mmol)加入到2ml乙醇的圆底烧瓶中，40℃下加热回流1h进行取代反应。取代反应结束后冷却到室温后，抽滤并真空干燥取代产物混合物，即得到Nap-Br。

(2)将3.89g化合物Nap-Br(10mmol)，36.79mg Pd(PPh₃)₂Cl₂(0.03mmol)，7.62mgCuI(4mmol)加入圆底烧瓶，用100ml四氢呋喃和50ml三乙胺的混合溶液溶解后鼓氮气15分钟，得到反应体系。继续将1.61g 4-乙炔基苯胺(10.50mmol)溶于50ml四氢呋喃后加入到上述反应体系中，在30℃、CuI环境中、以Pd(PPh₃)₂Cl₂为催化剂进行缩合反应。将混合物回流搅拌24h后缩合反应结束，得到缩合产物混合物，而后旋蒸除去缩合产物混合物中的多种溶剂得到反应体系浓缩液，将所得反应体系浓缩液用柱层析色谱纯化，所述柱层析色谱分离的流动相为体积比为10:1的二氯甲烷和石油醚。将纯化后的产物通过旋蒸的方法除去流动相溶剂，最后真空干燥后得到本发明所述检测溶酶体极性变化的荧光探针Nap-NH₂。

本实施例的收率为70％。

实施例3

(1)称取277mg 4-溴-1,8-萘二甲酸酐(1mmol)和195mg N-(2-氨基乙基)吗啉(1.5mmol)加入到2ml乙醇的圆底烧瓶中，40℃下加热回流3h进行取代反应。取代反应结束后冷却到室温后，抽滤并真空干燥取代产物混合物，即得到Nap-Br。

(2)将3.89g化合物Nap-Br(10mmol)，36.79mg Pd(PPh₃)₂Cl₂(0.03mmol)，7.62mgCuI(4mmol)加入圆底烧瓶，用80ml四氢呋喃和50ml三乙胺的混合溶液溶解后鼓氮气15分钟，得到反应体系。继续将1.07g 4-乙炔基苯胺(10.00mmol)溶于50ml四氢呋喃后加入到上述反应体系中，在27℃、CuI环境中、以Pd(PPh₃)₂Cl₂为催化剂进行缩合反应。将混合物回流搅拌18h后缩合反应结束，得到缩合产物混合物，而后旋蒸除去缩合产物混合物中的多种溶剂得到反应体系浓缩液，将所得反应体系浓缩液用柱层析色谱纯化，所述柱层析色谱分离的流动相为体积比为10:1的二氯甲烷和石油醚。将纯化后的产物通过旋蒸的方法除去流动相溶剂，最后真空干燥后得到本发明所述检测溶酶体极性变化的荧光探针Nap-NH₂。

本实施例的收率为80％。

实施例4

(1)称取277mg 4-溴-1,8-萘二甲酸酐(1mmol)和143mg N-(2-氨基乙基)吗啉(1.1mmol)加入到2ml乙醇的圆底烧瓶中，40℃下加热回流5h进行取代反应。取代反应结束后冷却到室温后，抽滤并真空干燥取代产物混合物，即得到Nap-Br。

(2)将3.89g化合物Nap-Br(10mmol)，36.79mg Pd(PPh₃)₂Cl₂(0.03mmol)，7.62mgCuI(4mmol)加入圆底烧瓶，用35ml四氢呋喃和50ml三乙胺的混合溶液溶解后鼓氮气15分钟，得到反应体系。继续将1.39g 4-乙炔基苯胺(10.30mmol)溶于50ml四氢呋喃后加入到上述反应体系中，在28℃、CuI环境中、以Pd(PPh₃)₂Cl₂为催化剂进行缩合反应。将混合物回流搅拌10h后缩合反应结束，得到缩合产物混合物，而后旋蒸除去缩合产物混合物中的多种溶剂得到反应体系浓缩液，将所得反应体系浓缩液用柱层析色谱纯化，所述柱层析色谱分离的流动相为体积比为10:1的二氯甲烷和石油醚。将纯化后的产物通过旋蒸的方法除去流动相溶剂，最后真空干燥后得到本发明所述检测溶酶体极性变化的荧光探针Nap-NH₂。

本实施例的收率为65％。

实施例5

(1)称取277mg 4-溴-1,8-萘二甲酸酐(1mmol)和182mg N-(2-氨基乙基)吗啉(1.4mmol)加入到2ml乙醇的圆底烧瓶中，40℃下加热回流3.5h进行取代反应。取代反应结束后冷却到室温后，抽滤并真空干燥取代产物混合物，即得到Nap-Br。

(2)将3.89g化合物Nap-Br(10mmol)，36.79mg Pd(PPh₃)₂Cl₂(0.03mmol)，7.62mgCuI(4mmol)加入圆底烧瓶，用25ml四氢呋喃和50ml三乙胺的混合溶液溶解后鼓氮气15分钟，得到反应体系。继续将1.29g 4-乙炔基苯胺(10.20mmol)溶于25ml四氢呋喃后加入到上述反应体系中，在26℃、CuI环境中、以Pd(PPh₃)₂Cl₂为催化剂进行缩合反应。将混合物回流搅拌15h后缩合反应结束，得到缩合产物混合物，而后旋蒸除去缩合产物混合物中的多种溶剂得到反应体系浓缩液，将所得反应体系浓缩液用柱层析色谱纯化，所述柱层析色谱分离的流动相为体积比为10:1的二氯甲烷和石油醚。将纯化后的产物通过旋蒸的方法除去流动相溶剂，最后真空干燥后得到本发明所述检测溶酶体极性变化的荧光探针Nap-NH₂。

本实施例的收率为60％。

实施例6

本发明所述检测溶酶体极性变化的荧光探针在不同极性溶剂中的发射光谱

配置浓度为1mM实施例1所得检测溶酶体极性变化的荧光探针Nap-NH₂的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液待用。测试液中，分别取不同极性的有机溶剂，包括图中的Dioxane(二恶烷)、Dichloromethane(二氯甲烷)、Dimethy formamide(二甲基甲酰胺)、Dimethysulfoxide(二甲基亚砜)、Toluene(甲苯)、Methanol(甲醇)、Chloroform(氯仿)、Tetrahydrofuran(四氢呋喃)、Glycerinum(甘油)，加入探针母液(终浓度为10μM)，进行荧光扫描(激发波长为415nm，检测波段为475-800nm)，测的各体系中相对荧光强度，如图3所示。由图3可知，随着溶剂极性的减小，所述检测溶酶体极性变化的荧光探针Nap-NH₂的荧光强度逐渐增大。

实施例7

本发明所述检测溶酶体极性变化的荧光探针检测因细胞自噬引起的溶酶体极性变化的应用

配置浓度为1mM实施例1所得检测溶酶体极性变化的荧光探针Nap-NH₂的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液待用。

将DMEM(杜尔贝科培养基)中的PC12细胞添加10％(v/v)胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，并在37℃下，5/95(v/v)CO₂/空气的潮湿环境中培养。成像前一天，用0.2％(w/v)胰蛋白酶-EDTA溶液处理，使细胞脱离，悬浮在培养基中。然后将细胞悬浮液转移到共聚焦培养皿中以粘附生长。为了成像，通过刮擦收集汇合率为80％的PC12细胞，并将其转移至共聚焦培养皿中以粘附生长。通过具有多光子激光扫描共聚焦显微镜在810nm处激发，获得双光子激发的荧光图像，如图4所示。由图4(a)可知，其中如a1～a3、b1～b3、c1～c3所示，与在810nm双光子激发下在37℃孵育的细胞相比，在25℃和4℃孵育的细胞的图像中没有观察到明显的荧光变化。同时，d1～d3中用地塞米松处理后PC12相对强度不变也表明细胞粘度几乎不变。如图e1～e3、f1～f3在加入自噬诱导剂雷帕霉素和细胞饥饿处理后PC12细胞显示出比对照组更低的荧光强度信号。同时，如g1～g3，在用自噬抑制剂3-MA(3-甲基腺嘌呤)处理的细胞观察到明显的荧光，并且荧光强度的变化主要是由于自噬-溶酶体的出现，导致溶酶体极性增大，荧光强度降低。此外，如h1～h3，向细胞中加入炎症诱导剂LPS(细菌脂多糖)，导致比对照更低的荧光强度信号。如i1～i3，在LPS+3-MA中培养细胞的荧光的增强类似图4(b)。表明探针的荧光变化与炎症诱导的自噬有关。综上，所设计的分子完全可以作为溶酶体靶向，极性响应探针，揭示炎症与细胞自噬之间的关系。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。