一种鸡血白蛋白低聚肽及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种鸡血白蛋白低聚肽及其制备方法和应用 (Chicken blood albumin oligopeptide and preparation method and application thereof ) 是由 毛新亮 李晓敏 曾瑜 陈晶 袁方 陈小娟 栗原博 古润金 于 2021-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种鸡血白蛋白低聚肽及其制备方法和应用,所述方法利用微生物对鸡血白蛋白进行发酵降解,所述微生物为枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、酵母菌、醋酸杆菌中的一种或两种,所述方法包括以下步骤：(1)将鸡血白蛋白和所述微生物在液体培养基中混合得到发酵体系A,于25～40℃和pH6.0～8.0的条件下发酵得到发酵液；(2)收集步骤(1)中分子量低于3000Da的物质得到所述鸡血白蛋白低聚肽。本发明的鸡血白蛋白低聚肽的制备方法通过生物发酵将鸡血白蛋白降解为小分子多肽,充分利用鸡血中的生物活性物质,进一步拓展鸡血的用途,减少资源浪费,提高其产业经济价值,而且鸡血白蛋白低聚肽具有优异的抗氧化、抗疲劳和提高免疫力的功效。(The invention provides a chicken blood albumin oligopeptide and a preparation method and application thereof, the method utilizes microorganisms to ferment and degrade the chicken blood albumin, the microorganisms are one or two of bacillus subtilis, lactobacillus plantarum, saccharomycetes and bacillus aceticus, and the method comprises the following steps: (1) mixing chicken blood albumin and the microorganism in a liquid culture medium to obtain a fermentation system A, and fermenting at 25-40 ℃ and pH 6.0-8.0 to obtain fermentation liquor; (2) and (2) collecting the substances with the molecular weight lower than 3000Da in the step (1) to obtain the chicken blood albumin oligopeptide. According to the preparation method of the chicken blood albumin oligopeptide, the chicken blood albumin is degraded into small molecular polypeptides through biological fermentation, bioactive substances in the chicken blood are fully utilized, the application of the chicken blood is further expanded, the resource waste is reduced, the industrial economic value of the chicken blood albumin oligopeptide is improved, and the chicken blood albumin oligopeptide has excellent effects of resisting oxidation and fatigue and improving the immunity.)
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种鸡血白蛋白低聚肽及其制备方法和应用。
背景技术
中国具有庞大的肉鸡养殖及屠宰加工产业，近年来，国内市场的需求量大幅增加，每年肉鸡的存栏量约10亿只，出栏量已高达上百亿只，中国已成为继美国之后世界第二大鸡肉生产国。鸡血是肉鸡屠宰加工过程中的副产品，我国目前对鸡血的利用率不高，部分鸡血被制作成鸡血粉，用作动物饲料，附加值低，绝大部分鸡血当作废物直接排放到环境中，不仅是资源浪费，而且造成了严重的环境污染。鸡血液中包含多种营养物质和生物活性物质，特别是丰富的蛋白质，血浆中蛋白含量约8％，血细胞中蛋白含量约35％，但是利用率、吸收率极低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种鸡血白蛋白低聚肽及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种鸡血白蛋白低聚肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：
利用微生物对鸡血白蛋白进行发酵降解，所述微生物为枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、酵母菌、醋酸杆菌中的一种或两种。
上述鸡血白蛋白低聚肽的制备方法通过生物发酵将鸡血白蛋白降解为小分子多肽，充分利用鸡血中的生物活性物质，进一步拓展鸡血的用途，减少资源浪费，提高其产业经济价值，更好的促进了鸡血白蛋白低聚肽在动物体内的吸收，而且鸡血白蛋白低聚肽具有优异的抗氧化、抗疲劳和提高免疫力的功效。
优选地，所述微生物包括枯草芽孢杆菌，所述微生物还包括植物乳杆菌、酵母菌、醋酸杆菌中的一种。
发明人通过研究发现，枯草芽孢杆菌发酵对鸡血白蛋白具有更好的水解能力，有利于获得更高水平的小分子白蛋白肽，更有利于动物吸收。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)将鸡血白蛋白和所述微生物在液体培养基中混合得到发酵体系A，于25～40℃和pH6.0～8.0的条件下发酵得到发酵液；
(2)收集步骤(1)中分子量低于3000Da的物质得到所述鸡血白蛋白低聚肽。
发明人通过研究发现，上述方法制备得到的鸡血白蛋白低聚肽产率高，成本低。
优选地，所述鸡血白蛋白和所述微生物的重量比为(5～12)：(0.5～5)。
发明人通过研究发现，鸡血白蛋白和所述微生物的重量比为(5～12)：(0.5～5)时，上述方法制备得到的鸡血白蛋白低聚肽产率高，成本低。
优选地，所述发酵体系A中，鸡血白蛋白的质量浓度为5％～12％，所述微生物的浓度为0.5％～5％。
优选地，所述液体培养基中包括碳源为0.5％～1％的葡萄糖、氮源为2％～2.5％的蛋白胨和牛肉膏的混合物。
优选地，所述发酵体系A中，鸡血白蛋白的质量浓度为7％～10％，所述微生物的浓度为3％～4％。
优选地，所述步骤(1)中，发酵的时间为18～48小时。
优选地，所述步骤(1)中，于30～38℃和pH7.0～7.4的条件下发酵，发酵时间为24～36小时。
优选地，所述步骤(1)中，鸡血白蛋白和所述微生物在液体培养基混合前，对鸡血白蛋白进行灭菌，发酵后对发酵液进行灭菌；
所述步骤(2)中，通过超滤收集发酵液中含有分子量低于3000Da的多肽片段的超滤液，将超滤液在不超过180℃下进行喷雾干燥得到鸡血白蛋白低聚肽。
上述方法通过超滤分离小分子活性肽具有较好的分离效果，属于物理分离，没有引入化学试剂，因此安全无毒性，最大程度地保留了白蛋白低聚肽的生物活性。
本发明还提供上述任一所述鸡血白蛋白低聚肽的制备方法制备得到的鸡血白蛋白低聚肽。
本发明还提供上述所述鸡血白蛋白低聚肽在制备抗氧化食品或保健品、增强免疫食品或保健品、抗疲劳食品或保健品中的应用。
鸡血白蛋白低聚肽具有优异的抗氧化、抗疲劳和提高免疫力的功效，分子量低，有利于人体吸收，在食品或保健品中具有很高的利用价值。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种鸡血白蛋白低聚肽及其制备方法和应用，本发明的鸡血白蛋白低聚肽的制备方法通过生物发酵将鸡血白蛋白降解为小分子多肽，充分利用鸡血中的生物活性物质，进一步拓展鸡血的用途，减少资源浪费，提高其产业经济价值，更好的促进了鸡血白蛋白低聚肽在动物体内的吸收，而且鸡血白蛋白低聚肽具有优异的抗氧化、抗疲劳和提高免疫力的功效。
附图说明
图1为本发明实施例的鸡血白蛋白低聚肽体外抗氧化活性的效果示意图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
枯草芽孢杆菌种子液的制备：所用枯草芽孢杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。使用枯草液体培养基进行种子液的培育。液体培养基包括碳源为1％的葡萄糖，氮源为2％的蛋白胨和牛肉膏的混合物，pH 6.8～7.0，30℃培养12小时制备种子液。
本实施例参考了肖湘等报道的《鸡血白蛋白的制备与性质研究》(汕头大学学报:自然科学版,1998(01):41-45)制备鸡血浆白蛋白粗品。具体步骤如下：3.8％柠檬酸钠抗凝处理的新鲜鸡血，4000r/min离心10min，分离上清即为血浆。加入相同体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀后室温静置2h，3000r/min离心20min，收集上清液。用HCl(1M)调节pH 3.8，室温静置1h，3000r/min，离心20min，获取沉淀。用NaOH(1M)复溶沉淀，加入去离子水稀释至5％(w/v)，搅拌均匀后加人辛酸钠使终浓度为0.0017g/mL。用HCl(1M)调节pH 5.0，静置过夜。第二天再次调pH 5.0，55℃加热30min，冷却至室温。搅拌下加硫酸铵达40％饱和度，3000r/min离心20min，得上清液。再用HCl(1M)调节pH 7.0，搅拌下加硫酸铵达75％饱和度，用HCl(1M)调节pH 4.6，离心得沉淀，即为鸡血白蛋白。
作为本发明实施例的一种鸡血白蛋白低聚肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取鸡血白蛋白粗品100g，加水溶解底物浓度为8％，121℃灭菌20分钟，冷却至室温后，调节溶液pH 7.5，向白蛋白溶液中接种3％的枯草芽孢杆菌，30℃，200rpm发酵36小时，121℃灭菌20分钟终止发酵；
(2)冷却至室温后，将发酵液4000rpm离心10分钟，取上清液得白蛋白酵解液。超滤截留酵解液中分子量低于3000Da的多肽片段，将超滤液进行喷雾干燥，进口温度180℃，出口温度80℃，得白蛋白低聚肽粉82.6g。
本实施例所得白蛋白低聚肽为乳白色粉末，水溶性较好，无不良风味。活性肽含量74.6％，水分含量4.71％，灰分含量小于2.18％。肽分子量分布结果见表1，由肽分子量分布可以发现鸡血浆白蛋白低聚肽中分子量低于1000Da的低聚肽占72.34％。
表1实施例1鸡血白蛋白低聚肽分子量分布
实施例2
植物乳杆菌制备：所用植物乳杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。使用液体培养基进行种子液的培育。液体培养基，碳源为0.5％的葡萄糖。氮源为2.5％的蛋白胨、牛肉膏和酵母粉的混合物，pH 6.8～7.0，37℃培养12小时制备种子液。
作为本发明实施例的一种鸡血白蛋白低聚肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取鸡血白蛋白粗品100g，加水溶解底物浓度为10％，121℃灭菌20分钟，冷却至室温后，调节溶液pH 7.4，向白蛋白溶液中接种5％的植物乳杆菌，37℃，200rpm发酵48小时，121℃灭菌20分钟终止发酵；
(2)冷却至室温后，将发酵液4000rpm离心10分钟，取上清液得白蛋白酵解液。超滤截留酵解液中分子量低于3000Da的多肽片段。将超滤液进行喷雾干燥，进口温度180℃，出口温度80℃，得白蛋白低聚肽粉79.6g。
本实施例所得白蛋白低聚肽为乳白色粉末，水溶性较好，无不良风味。活性肽含量75.4％，水分含量6.13％，灰分含量小于3.59％。肽分子量分布结果见表2，由肽分子量分布可以发现鸡血浆白蛋白低聚肽中分子量低于1000Da的低聚肽占61.20％。
表2实施例2鸡血白蛋白低聚肽分子量分布
实施例3
酵母菌制备：所用酵母菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。使用液体培养基进行种子液的培育。液体培养基，5°Bé麦芽汁1.0L，琼脂15.0g，自然pH，37℃培养12小时制备种子液。
作为本发明实施例的一种鸡血白蛋白低聚肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取鸡血白蛋白粗品100g，加水溶解底物浓度为8％，121℃灭菌20分钟，冷却至室温后，调节溶液pH 7.0，向白蛋白溶液中接种5％的酵母菌，37℃，200rpm发酵48小时，121℃灭菌20分钟终止发酵；
(2)冷却至室温后，将发酵液4000rpm离心10分钟，取上清液得白蛋白酵解液。超滤截留酵解液中分子量低于3000Da的多肽片段。将超滤液进行喷雾干燥，进口温度180℃，出口温度80℃，得白蛋白低聚肽粉84.2g。
本实施例所得白蛋白低聚肽为乳白色粉末，水溶性较好，无不良风味。活性肽含量79.6％，水分含量3.67％，灰分含量小于2.81％。肽分子量分布结果见表3，由肽分子量分布可以发现鸡血浆白蛋白低聚肽中分子量低于1000Da的低聚肽占63.02％。
表3实施例3鸡血白蛋白低聚肽分子量分布
实施例4
醋酸杆菌制备：所用醋酸杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。使用液体培养基进行种子液的培育。液体培养基，葡萄糖100.0g，酵母提取物10.0g，CaCO320.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH 6.8，37℃培养12小时制备种子液。
作为本发明实施例的一种鸡血白蛋白低聚肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取鸡血白蛋白粗品100g，加水溶解底物浓度为12％，121℃灭菌20分钟，冷却至室温后，调节溶液pH 6.5，向白蛋白溶液中接种5％的醋酸杆菌，37℃，200rpm发酵48小时，121℃灭菌20分钟终止发酵；
(2)冷却至室温后，将发酵液4000rpm离心10分钟，取上清液得白蛋白酵解液。超滤截留酵解液中分子量低于3000Da的多肽片段。将超滤液进行喷雾干燥，进口温度180℃，出口温度80℃，得白蛋白低聚肽粉78.2g。
本实施例所得白蛋白低聚肽为乳白色粉末，水溶性较好，无不良风味。活性肽含量81.6％，水分含量4.37％，灰分含量小于3.08％。肽分子量分布结果见表4，由肽分子量分布可以发现鸡血浆白蛋白低聚肽中分子量低于1000Da的低聚肽占67.37％。
表4实施例4鸡血白蛋白低聚肽分子量分布
实施例5
由实施例1-实施例4可以看出，经分子量分析后发现，枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、酵母菌和醋酸杆菌发酵制备的鸡血白蛋白多肽，其中分子量低于1000Da以下的低聚肽含量分别为72.34％，61.20％，63.02％和67.37％，说明枯草芽孢杆菌发酵对鸡血白蛋白具有更好的水解能力，有利于获得更高水平的小分子白蛋白肽。
采用ORAC方法检测实施例1中鸡血白蛋白低聚肽体外抗氧化活性。
通过氧化自由基吸收能力(Oxygen Radical Absorbance Capacity，ORAC)实验检测低聚肽的体外抗氧化活性。实验分组分别为AAPH-组(空白)、AAPH+组(阳性对照)、Trolox(水溶性维生素E)组(标准品)及受试样品组。将PBS、受试样品、荧光素钠及AAPH加到96孔板内，并迅速置于荧光酶标仪，在37℃，检测2h内荧光信号的变化(485nm激发波长和535nm发射波长下)。荧光素钠容易受到AAPH产生的自由基攻击而淬灭，因此通过检测荧光强度的变化可以反映受试样品的抗氧化能力。鸡血白蛋白低聚肽体外抗氧化活性和ORAC值见图1。由图1可以看出，鸡血白蛋白低聚肽具有良好的抗氧化活性，随着浓度的上升，ORAC值也随之增加(2.5mg/mL白蛋白低聚肽还原当量ORAC值：342.11；5.0mg/mL白蛋白低聚肽还原当量ORAC值：692.14)。
实施例6
实施例1中鸡血白蛋白低聚肽对免疫抑制小鼠免疫功能的影响。
将昆明种小鼠随机分为正常组，环磷酰胺(CTX)模型组，白蛋白低聚肽低剂量组(25mg/kg)，白蛋白低聚肽中剂量组(50mg/kg)和白蛋白低聚肽高剂量组(100mg/kg)。动物适应性喂养一周后，连续灌胃给予白蛋白低聚肽21天。给药第19天起，除正常组外，其余各组每日腹腔注射80mg/kg环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型。最后一次给药结束后，小鼠空腹24h，称体重，眼眶取血，取胸腺和脾脏进行实验检测。
胸腺是机体的中枢免疫器官，T细胞分化成熟的重要场所。脾是机体重要的外周免疫器官，T淋巴细胞和B淋巴细胞定居和增殖的场所。胸腺指数和脾脏指数能够反映机体的免疫功能。环磷酰胺等免疫抑制剂抑制淋巴细胞的分化，减少胸腺和脾等免疫器官中淋巴细胞的数量，进而导致免疫器官重量的减少。因此，通过观测胸腺指数和脾脏指数能够检测受试物对机体免疫的影响。将小鼠胸腺和脾进行称重，并计算相应的脏器指数(％)＝脏器重量(g)/体重(g)。小鼠胸腺指数和脾脏指数见表5。由表5结果可以发现，与环磷酰胺组相比，低聚肽各剂量组一定程度上增加小鼠的胸腺指数和脾脏指数。
表5白蛋白低聚肽对免疫抑制小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响
与空白对照组相比，*P<0.05；与环磷酰胺模型组相比，#P<0.05。
实施例7
实施例1中鸡血白蛋白多肽对运动性疲劳小鼠的影响。
将昆明种小鼠随机分为正常组，白蛋白低聚肽低剂量组(25mg/kg)，白蛋白低聚肽中剂量组(50mg/kg)和白蛋白低聚肽高剂量组(100mg/kg)。动物适应性喂养一周后，连续灌胃给予白蛋白低聚肽21天。末次给药30min后，小鼠尾根部给予5％体重的铅皮负荷，将其置于30cm游泳箱中进行力竭游泳实验，水温控制25±1℃。以小鼠沉入水中超过7s不能把头伸出水面为力竭状态，记录自开始游泳至出现力竭状态的时间作为小鼠力竭游泳时间。并对小鼠血液和肝脏进行取样，进行后续实验测定。
负重游泳是一种强制性的全身损耗能量活动，其游泳时间可以反应小鼠的抗疲劳能力。小鼠游泳时间见表6。由表6结果可以发现，低中高剂量的白蛋白低聚肽显著延长了小鼠游泳时间。肝糖原是机体的重要储能方式，可分解成葡萄糖维持血糖的稳定。力竭运动过程中，肝糖原分解代谢转化为能量供机体使用，进而导致肝糖原含量的下降。小鼠肝糖原见表6。由表6结果可以发现，低中高剂量的白蛋白低聚肽显著增加了小鼠肝糖原的水平。尿素氮是氨基酸经鸟氨酸循环分解代谢的终产物。长时间的剧烈运动，糖代谢和脂肪代谢产生的能量不能满足机体需求时，蛋白质和氨基酸便会参加代谢提供能量。小鼠尿素氮见表6。由表6结果可以发现，低中高剂量的白蛋白低聚肽显著降低了小鼠尿素氮的水平。力竭运动过程中机体处于无氧呼吸状态，通过糖酵解进行快速供能。葡萄糖代谢为乳酸，堆积在肌肉组织，导致肌肉运动能力下降，使机体产生疲劳。小鼠血乳酸见表6。由表6结果可以发现，低中高剂量的白蛋白低聚肽显著降低了小鼠血乳酸的水平。综上，白蛋白低聚肽具有较好的抗疲劳作用。
表6白蛋白低聚肽对力竭运动小鼠游泳时间，血清尿素氮，肝糖原和血乳酸含量的影响
与空白对照组相比，*P<0.05。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
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