具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1纯化条件的筛选

纯化试剂A选择阴离子脱色树脂(型号：POSITISIL脱色2#)，购于北京英莱克科技发展有限公司。

纯化试剂B选择硼酸填料(Phenyl borate group，以下简称pb填料)，购于上海国药集团沪试AR级(货号10004818)。硼酸填料是一种新型的去糖基化填料，主要用于纯化蛋白质过程中，对于糖基化蛋白质的去除。

实施例2去除色素实验过程

1.将含有HSA基因的重组毕赤酵母菌株经活化培养得到的种子液接种于一级种子罐进行培养；罐中含有YPD培养基(YPD培养基的成分包括葡萄糖、酵母浸粉、胰蛋白胨，按比例混合即可，或者购买市售品)，一级种子罐的容量可选30L，一般培养12小时，当罐内溶氧开始回升时转入二级种子罐中；

2.二级种子罐中含有YPD培养基，二级种子罐的容量可选300L，培养8小时左右，溶氧开始回升时转入发酵罐；

3.发酵罐中加入有机合成培养基F121.6kg、磷酸18690mL、氢氧化钾2.891kg、甘油28kg，转入发酵液前还加入维生素C和合成p1补充液，合成p1补充液的配方为：硫酸铜2g，碘化钠0.02g，硫酸锰一水1g，钼酸钠二水0.1g，硼酸0.005g，氯化锌5g，硫酸亚铁25g，硫酸5ml，水定容至1L；所述有机合成培养基F1的组分为酵母粉：蛋白胨＝2:1。当发酵液的湿重比(发酵液和菌体的比例)大于26时，进行甲醇诱导。当发酵液的湿重比(发酵液和菌体的比例)≥50，OD≥2.0时停止发酵。发酵总时长约192h；

4.发酵结束后，取含有rHSA的发酵液，通过叠片离心机去除酵母细胞，转速：12000rpm，料液温度：15℃，固含量：20-30％。离心清液过微滤，泵频25-35HZ；入口压力不超过0.2MPa。透过液过30KD浓缩，浓缩液中加入酒精(按照40％的体积比加入)，加入辛酸钠至终浓度15mM，68℃加热30min，得到30KD浓缩液；

5.利用分光光度计对获得的浓缩液杂质含量进行三次平行检测，具体检测结果如下表1：

表1

备注：不同型号的光度计测量结果有误差

当A350/A280的比值≤0.05，表示溶液中色素和杂质的含量可以忽略，比值越大，色素和杂质的含量越多，而当A450/A280、A500/A280的比值越大，色素和杂质的含量越多。因此由上表可知，发酵浓缩液中含有较多杂质和色素。

6.脱色柱装柱

①阴离子脱色树脂用纯化水浸泡24小时，充分涨溶；

②硼酸填料以NaCl浓度从低到高的梯度进行洗脱，NaCl浓度梯度设置在0.1M-1M之间，洗脱后以20mMPB、PH7.0磷酸钠缓冲液平衡；

③将阴离子脱色树脂+硼酸填料，按1:1,2:1,4:1,8:1比例充分混匀，装入填料柱中(设置两种填料分别单独装柱作为对照)；

④选择步骤③中的优选比例，将前述步骤4获得的浓缩发酵上清液过脱色柱，阴离子脱色树脂+硼酸填料的组合物与上样液的体积比为：1:10-1:20，验证脱色效果和收率。

实施例3脱色结果

1.单独使用阴离子脱色树脂对发酵液的脱色情况，具体如下表2：(流速50ml/min)

表2

2.单独使用硼酸对发酵液的脱色情况，具体如下表3：(流速50ml/min)

表3

如上结果所示，当单独使用阴离子脱色树脂或硼酸作为填料时，对发酵液的脱色效果并不明显。

3.几种阴离子脱色树脂和硼酸的组合填料对发酵液的60min脱色情况，具体如下表4：

表4

结果表明，采用阴离子脱色树脂复合硼酸填料可以显著降低发酵液的杂质和色 素。阴离子树脂和硼酸填料的质量比为4:1混合均匀，对发酵液进行预处理，其A350/A280可 降至0.05，A450/A280和A500/A280均为0或低于检测线，各项指标达到要求。

4.不同体积比的上样液与脱色树脂复合硼酸填料(阴离子脱色树脂：硼酸填料＝4:1)在洗脱60min时的脱色情况，具体如下表5：

表5

结果可见，上样液与脱色树脂复合硼酸填料体积比为1:20时脱色效果最佳。

5.脱色样品的SDS-PAGE结果如图1所示，从结果来看，上述脱色树脂/硼酸填料对目标蛋白基本不吸附。

6.蛋白收率

①将上样液与脱色树脂复合硼酸填料按1：20的比例混匀后装柱

②用注射用水冲洗脱色柱2个BV

③取200ml纯化后的浓缩液样品上样，取样检测PH及液相，蛋白质收率

检测结果如下：

结果可见，当脱色树脂/硼酸填料比例为4：1时，蛋白收率相对较高。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。