具体实施方式

实施例1

实施例2

一、实验仪器与设备

表1.1实验仪器

实验试剂：阿特拉津、甲醇(色谱纯)、碳酸氢钠、氯化钙、乳酸钠、Vc、L-半胱氨酸盐酸盐、NaOH(分析纯)、HCl(分析纯)、二氯甲烷(色谱纯)、氯化钠、无水硫酸钠

二、实验方法：

2.1生物炭的制备：

以玉米芯为原料制备生物炭。将玉米芯洗净，于80℃烘箱中烘干、磨碎，并将玉米芯粉末置于坩埚内在250℃、400℃和600℃马弗炉中缺氧裂解4h，待其生物炭在马弗炉中冷却至室温后，将其取出研磨，过0.15mm筛，待用。制备的生物炭分别为CC250、CC400和CC600。

2.2生物炭的表征：

生物炭表面结构观察：将3种不同的生物炭样品喷金后，于材料扫描电镜下观察生物炭的表面形态及结构。

生物炭元素分析：元素的含量(C、H、N)由元素分析仪(Flash EA 1112)来测定，O元素的含量通过质量平衡方法来进行计算，同时扣除灰分和自由水分的质量。

生物炭pH和EC的测定：将3种生物炭分别和水以1:10的比例混合，用pH/EC计测定。

生物炭N₂-BET表面积(SA)的测定：表面积的测定由ASAP-2020表面积分析仪测定。

生物炭晶体结构(XRD)的测定：将粉末状的3种生物炭均匀铺在样品槽内，压实后分别于X射线衍射仪上进行扫描测定，扫描范围为2θ＝10-80°。

生物炭持久性自由基测定：将2mg左右的3种生物炭样品分别装入石英毛细管中，将其置于电子顺磁共振波谱仪的共振腔中，检测EPR信号。

2.3生物炭固定化菌剂的制备：

分别称取500mg CC250、CC400和CC600生物炭用去离子水定容到500mL，超声2h，制成生物炭母液，备用。取处于对数生长期的菌株，制成OD₆₀₀＝1的菌悬液。然后将OD₆₀₀＝1的菌悬液和生物炭母液分别以1:1、2:1、3:1的比例加入至锥形瓶中，在30℃、150r/min的条件下振荡24h，使微生物吸附在生物炭上，调节pH为7.63，备用。

2.4生物炭固定化菌剂的表征：

将固定好的生物炭固定化菌剂离心，去掉上清液，使用无菌生理盐水重复洗涤多次，去除表面的石蜡等液体，离心结束后，加入2.5％的戊二醛溶液于4℃环境中固定24h，目的为保持生物炭结构上菌株的形态，将其干燥后在材料扫描电镜下观察菌株在生物炭上的形态及负载情况。

生物炭固定化菌剂对菌株生长的影响：

将制备好的不同固定化菌剂以10％的比例加入到含阿特拉津的富集培养基中，使最终溶液中阿特拉津的浓度为2mg/L，pH为7.63，将其置于33℃、150r/min的条件下进行培养，以一定的间隔取样测定菌量，观察生物炭对菌株生长的影响。在取样前要求摇匀溶液后进行取样，设置三组平行。同时设置空白对照，其中等量的菌悬液为对照组，要求用无菌生理盐水按照比例调整菌悬液。

生物炭固定化菌剂对阿特拉津的去除效果：

将制备好的固定化菌剂以10％的比例加入到含阿特拉津的富集培养基中，使溶液中阿特拉津的浓度为2mg/L，pH为7.63，将其置于33℃、150r/min的条件下进行培养，分别于2d和5d时取样，测定溶液中阿特拉津的浓度。在取样前要求摇匀溶液后进行取样，设置三组平行，同时对空白对照组的要求与生物炭固定化菌剂对菌株生长的影响中一致。

三、结果与讨论

3.1生物炭的表征

不同裂解温度下玉米芯生物炭的基本理化性质及元素组成如表1.2所示。由表1.2可知，玉米芯生物炭的pH值均大于7，且随热解温度的升高而升高，分别为9.36、10.19、10.00，这是因为玉米芯生物炭中原本与有机物结合的矿物元素在裂解过程中向碳酸盐形态转变，这些碳酸盐等物质溶于水后呈碱性。同样，玉米芯生物炭的EC也随着热解温度的升高而增加，分别为1.43、4.05、6.64，这也与高温下碱液的积累有关。而随着热解温度的升高，玉米芯生物炭的灰分含量相对较为稳定，当热解温度为400℃和600℃时，两者生物炭的灰分含量几乎一致，分别为1.80和1.81。C含量随着热解温度的升高呈上升趋势，分别为75.76％、85.65％、89.88％，然而，H含量、N含量和O含量随着热解温度的升高呈下降趋势，分别从4.37％、0.76％、19.58％下降至1.69％、0.70％、8.14％，其中H含量的多少与植物的有机质组分有关。不同裂解温度下制备的玉米芯生物炭中各原子比所以代表的意义不相同，H/C代表芳香性，值越大代表芳香性越低，CC600的H/C原子比随着裂解温度的升高下降至0.23，表明原始有机组分减少，炭化程度增强。(O+N)/C代表极性和疏水性，值越小代表疏水性增强，极性基团减少，随着裂解温度的升高，CC600的(O+N)/C值由CC250的0.20下降至0.07，表明裂解温度的升高会导致生物炭的疏水性增强以及极性基团的减小。这与其他一些生物质制备生物炭的研究结果一致。

表1.2玉米芯生物炭的基本理化性质及元素组成

为进一步了解玉米芯生物炭的结构和表面形态特征，对3种不同的生物炭进行材料扫描电镜和比表面积的分析测定，结果如图1和表1.2所示。由表1.2可知，随着裂解温度的升高，比表面积呈增大趋势，由CC250的1.71m²/g增大至295.95m²/g，这是因为在较高的热解温度下，由于芳香族C含量的增加，连接芳香族的官能团(如-OH、酯C＝O、脂肪族CH₂、C-O、芳香族C＝O和酚-OH)被破坏和去除，形成了一些细小的微孔结构，导致SA值增大。图1为不同裂解温度下生物炭的SEM图，较好的展示了样品表面孔隙结构的特征，其中(a)、(b)、(c)分别表示为CC250、CC400、CC600的SEM图。由图1可知，3种不同的生物炭样品均具有丰富的孔隙结构，且随着裂解温度的升高，生物炭的孔隙结构更为发达，CC250和CC400生物炭样品的表面较为粗糙，而CC600生物炭样品的表面较光滑且有丰富的网状孔结构，同时，可以看出CC250和CC400的孔结构里出现碎屑堵塞微孔的现象。3种生物炭的结构主要呈网状分布，排列均匀，随着扫描电镜倍数的增大，可以清晰的看到生物炭侧壁上的小孔，且小孔间排列紧密。

X射线衍射分析(XRD)能够分析不同生物炭的内部晶体结构和组成成分。图2为不同裂解温度下生物炭的XRD图，其中(a)、(b)、(c)分别表示CC250、CC400、CC600的XRD图。根据Jade软件里的标准卡片，可以发现3种不同生物炭样品中主要存在的物质有Si、Al₂O₃、SiO₂、Fe₂O₃、CaCO₃等，且随着热解温度的升高，石墨化程度增强，无机元素的富集能力提高，更易形成稳定的矿物晶体。CC250的主要特征峰在2θ为28.43、40.59°，CC400的主要特征峰在2θ为26.82、28.61、40.70°，CC600的主要特征峰在2θ为24.34、26.65、28.49、30.16、31.43、40.71°。有研究表明，生物炭中含有的Fe₂O₃部分结晶相有利于微生物的生长，同时，生物炭中存在的氧化物和碱性盐基离子不利于阿特拉津的吸附，裂解温度的升高会导致纤维素的结构被破坏。

有研究表明，生物炭在炭化过程中会产生自由基，自由基的产生会刺激菌株的细胞产生ROS，降低细胞的抗氧化能力造成细胞死亡，具有显著的细胞毒性。Liao等人发现在玉米秸秆、水稻和小麦秸秆以及生物质的主要生物聚合物组分(纤维素和木质素)中均有明显的电子顺磁共振(EPR)信号，表明生物炭在炭化过程中产生了自由基。生物炭的PFRs一般以多种形式存在，可以根据EPR信号的g因子识别自由基类型。g>2.0040是氧中心自由基的典型特征，如半琨自由基阴离子；g为2.0030～2.0040则是氧中心自由基和碳中心自由基组合的典型特征；而当g<2.0030则是以碳为中心的自由基，如芳香族自由基。如图3为不同裂解温度下玉米芯生物炭的自由基信号图，从图中可以看出，BC250、BC400、BC600的g因子分别为2.00249、2.00254、2.00256，g值均小于2.0030，表明3种生物炭样品中含有的自由基均是以碳为中心的自由基，同时，当裂解温度由250℃升高至400℃时，生物炭样品中的EPRs强度也增强，而当裂解温度由400℃升高至600℃时，EPRs的信号强度却随裂解温度的升高而减弱，400℃下热解制备的生物炭样品中信号强度最强，600℃下热解制备的生物炭样品中信号强度最弱，这与张绪超等和裘舒越等的研究结果一致。

3.2生物炭固定化菌剂的表征

图4(a)、(b)、(c)和(d)为生物炭固定化菌剂的表面形貌观察。从图4(a)中可以看出，生物炭在热解过程中保持了原有的天然形态，表面分布着大小不一的通道和孔隙，可以为微生物提供理想的生存场所。同时，可以看出在生物炭的表面负载有杆状的菌体，且主要分布在生物炭表面的平坦处，这是因为生物炭与微生物之间的作用力较弱，表面平坦处更适合微生物的生长，有利于对微生物的固定。从图4(b)和(c)中可以看出，菌株在生物炭表面以不同的菌落形态存在，部分如图4(b)和图4(d)所示为聚集状的，这是因为菌株在生物炭上挂膜，或者是菌体之间的物理吸附使得菌体表现为聚集状。而另外一部分如图4(a)和图4(c)所示为分散状的，这是载体间的静电引力造成。

3.3生物炭固定化菌剂对菌株生长的影响

为探究菌液/生物炭的不同比例对菌株生长的影响，将3种不同菌液/生物炭的比值分别调整为1:1、2:1和3:1，同时将生理盐水中不同比例的菌液加入至培养基中作为空白对照组，如图5为同一生物炭不同比例对菌株生长的影响。

研究表明，不同的初始菌量可以在微生物生长过程中起到关键作用，合适的菌量可以缩短微生物适应期所需要的时间。由图5(a)可知，1:1菌液空白组生长较为缓慢，而2:1和3:1的生长情况相同。这是因为当菌量较低时，阿特拉津抑制了菌株的增长，导致菌株难以快速的繁殖，适当增加菌量促进了菌株种内的协同作用，帮助其更好的快速适应环境，而当菌量到达一定值后，过多的增加菌量导致培养基内的生物容量达到最大值，菌体竞争利用培养基中的营养物质，生长受限，且随着菌量的增加，菌株的生长量变化不明显。对于不同的菌株，其所需的合适的菌量并不相同，菌量的多少与有机物的种类、性质和菌株的种类以及特性相关，利用能力强的菌株所需的菌量相对较少，而利用能力弱的菌株所需的菌量相对较多。

由图5(b)(c)(d)可知，对于同一生物炭，当菌液/CC的比例为2和3时，菌株可以快速适应环境，从而缩短微生物适应期所需要的时间。但相比而言，菌液/CC的比例为2时的效果更佳，这是因为随着菌液浓度的增加，生物炭对菌体的吸附逐渐达饱和状态，当菌液含量较高时，由于生物炭载体内部空间有限，生物炭固定化微生物材料对底物的传至受到抑制或者由于空间狭小，营养物质的缺乏使得微生物之间存在竞争作用，固定化在生物炭表面的菌体无法获得足够的营养生长繁殖，从而导致其活性下降。也有研究表明，在相同的培养条件下，菌剂接种量越多会导致固定化微生物产生过多的代谢产物，而这类有毒的代谢产物会降低微生物的存活率，抑制菌株的生长。然而，在菌株生长的前期阶段，菌液/CC比例为3时菌株的生长情况要大于比例为2时，主要是因为在初始阶段，菌量相对较多，生长相对较快，但随着培养基内营养物质的消耗，菌株之间存在竞争作用，也会产生过多的代谢产物，菌株生长受到限制，因此在前期阶段，菌液/CC比例为3时菌株生长较好。

已有研究表明生物炭的加入会影响菌株的生长，Yang等人研究了不同生物炭浓度对假单胞菌生长的影响，结果表明，随着BC350-BC700生物炭浓度的增加，用生物炭培养的假单胞菌浓度也显著提高，并随生物炭浓度的增加而增加，但当浓度增加至500mg/L后，高浓度的生物炭延长了细菌的指数增长期，细菌的生长受到了抑制。此研究结果与本研究结果一致，当生物炭的浓度增加至一定程度后，过高的生物炭延长了菌株的指数增长期，生长受到抑制。然而，也有很多研究发现，不同类型的生物炭及菌株制成的固定化菌剂性能不同，对菌株生长的影响也不尽相同，与菌株的种类、生物炭的种类以及生物炭与污染物的相互作用有关。

同一比例不同生物炭对菌株生长的影响如图6所示。由图6(a)可知，当菌液/生物炭比值为1:1时，在培养基中加入10％生物炭固定化菌剂后，菌株的生长均受到了不同程度的抑制，其中CC600的抑制程度较大，这是因为CC600有较大的比表面积，对阿特拉津的吸附能力较强，使得菌株生长可利用的碳源不足，抑制菌株的生长。由图6(b)(c)可知，当菌液/生物炭比值为2:1和3:1时，在培养基中加入10％生物炭固定化菌剂后，菌株的生长均受到了不同程度的促进作用，这是因为生物炭的多孔结构给微生物提供了较好的生长环境，降低了菌株和阿特拉津的直接接触，缓解了阿特拉津对菌株的毒害作用。

也有研究表明，生物炭可以作为外源物质输入，影响细菌的生长，从而影响生物降解。生物炭也可以释放TOC到溶液中，直接影响细菌的生长和繁殖，利用细菌具有的胞外聚合酶来分解结构上复杂的TOC，且随着TOC浓度的增加，微生物浓度也显著增加，同时，生物炭对细菌脂肪酸组成也有一定的影响，TOC含量越高对脂肪酸的合成越也有利，越有利于细菌的生长。微生物细胞表面具有丰富的官能团，这些表面官能团能与生物炭表面官能团之间形成共价键，从而可以固定化细菌，促进菌株的生长。

不同比例生物炭对菌株生长影响的对照图如图7所示。其中7(a)表示的是在3种不同的生物炭中，不同比例对菌株生长的影响，从图中可以看出，当菌液/生物炭比值为1:1时，CC250、CC400和CC600的菌生长情况明显低于2:1和3:1。7(b)表示的是在菌液/生物炭比值为1:1的条件下，不同生物炭对菌株生长的影响，可以发现菌株的生长均受到了抑制，且CC600对菌株的抑制作用最大，此结果与图6的研究结果一致。

三种不同的生物炭对菌株生长的影响效果为CC250>CC600>CC400。有研究表明，氮(N)是微生物生长的重要物质基础，生物炭的C/N值在微生物的生长发育中占有重要的角色，尤其在土壤中，当有机质C/N比低于为25:1时，微生物的活性较强，有机质的分解加快，反之，微生物的活性降低，有机质分解减慢，因此，C/N比越接近25:1，微生物的生长越好。不同裂解温度下制备的3种玉米芯生物炭CC250、CC400、CC600的C/N比值分别为99.68、115.74、128.4，表明CC250的C/N比值最接近25:1，最适合微生物的生长。

从生物炭的理化性质角度分析，可看出随着裂解温度的升高，CC250、CC400、CC600的H/C分别从0.69下降至0.42和0.23，表明生物炭的芳香性越高，原始有机组分减少，炭化程度增强，炭的聚合度降低，脂肪碳和芳香碳转化为石墨烯等物质，N、P等元素被固定在生物炭的有机机构中，营养作用下降，微生物可利用程度降低。(O+N)/C分别从0.20下降至0.10和0.07，表明生物炭的极性基团减小，疏水性增强，对微生物细胞的粘附生长作用减小，不利于微生物的生长。

生物炭具有挥发性有机化合物和持久性自由基，且中等温度(400℃)下制备的生物炭比高温(>400℃)条件下制备的生物炭具有较高的多环芳烃、二噁英等，这些稳定的持久性自由基(包括半醌类、苯氧化合物、酚类物质)会对微生物产生毒性，诱导微生物发生氧化应激反应。从不同热解温度玉米芯生物炭的EPR图中可以看出，CC400的自由基信号强度最强，表明对菌株的毒性大于CC600对菌株的毒性，因此由CC600制备的固定化菌剂对菌株生长的促进作用大于由CC400制备的固定化菌剂对菌株生长的促进作用。

Masiello等人发现生物炭可以通过吸附信号分子来改变微生物细胞间的通讯，许多革兰氏阴性菌可利用信号分子来调节基因表达和种内通讯。高温条件(700℃)下制备的生物炭相比低温条件(300℃)下制备的生物炭具有比表面积高，吸附信号分子(AHL)并阻断细胞间传递信号的作用，从而影响微生物的生长。CC600相比CC250具有更大的比表面积，吸附信号分子的能力较强，在很大程度上可以阻断细胞间的信号传递，影响微生物的生长，因此，CC250促进菌株生长的能力较强，3种不同的生物炭对菌株生长的影响效果为CC250>CC600>CC400。

3.4生物炭固定化菌剂对阿特拉津的去除效果

为了分析9种不同的固定化菌剂、3种不同比例不同种类的生物炭和不同比例菌液去除阿特拉津的能力，将一定浓度的阿特拉津加入培养基中，待2d和5d后取样测定溶液中阿特拉津的浓度，测定的阿特拉津去除率如图8所示。其中8(a)(b)(c)分别表示菌液/生物炭比值为1:1、2:1、3:1的不同类型生物炭固定化菌剂对阿特拉津的去除效果，JN01表示同一比例菌体对阿特拉津的去除效果，CC250、CC400和CC600分别表示同一种类同一比例生物炭对阿特拉津的去除效果。

不同类型的生物炭固定化菌剂对阿特拉津的去除效率均大于单一菌株和单一生物炭对阿特拉津的去除效率。由图8(a)(b)(c)可知，1:1、2:1、3:1的单一菌株在第2天对阿特拉津的去除率分别为50.67％、61.56％、64.41％，在第5天对阿特拉津的去除率分别为55.58％、69.49％、70.52％，表明阿特拉津的去除率随着菌量的增加呈逐渐升高的趋势，且随着降解时间的延长，阿特拉津的去除率也呈上升趋势，并逐渐趋于平稳。而当菌液比例由2:1增加至3:1时，阿特拉津的去除率呈逐渐稳定趋势，降解率未明显提高，这是因为过多的菌体竞争有限的阿特拉津底物，导致细胞菌体营养受限，阿特拉津的去除率受到了影响。赵昕悦等人研究了不同接菌量对阿特拉津去除的影响，结果表明，当接菌量从1％增加至3％时，阿特拉津去除呈显著上升趋势，而当接菌量增加至5％时，阿特拉津去除率基本保持不变。由此可见，当菌量达到一定程度后，再增加菌量并不会提高阿特拉津的去除率。

有研究表明，不同的原材料，以及制备过程中的热解温度、传热速率、停留时间等工艺条件都会影响生物炭的性能。为此，我们研究了不同裂解温度下制备的生物炭(CC250、CC400、CC600)对阿特拉津的吸附效果，由图8(a)(b)(c)可知，增加生物炭母液的比例可以提高对阿特拉津的吸附能力，CC250由27.64％增加至33.22％，CC400由29.91％增加至33.61％，CC600由39.77％增加至41.64％。因此，3种不同的生物炭对阿特拉津的吸附效果为CC600>CC400>CC250，表明CC250对阿特拉津的吸附效果较差，CC600对阿特拉津的吸附效果较好。这是因为同一原材料制备的生物炭，裂解温度越高，微孔结构越多，比表面积大，CC600较大的比表面积以及多孔结构可以通过表面吸附作用和孔隙填充作用等吸附阿特拉津，表现出相对较强的吸附能力。

Wang等人研究了由花生壳在300℃、450℃、600℃条件下热解生成的生物炭对阿特拉津的吸附性能，结果表明，高温生物炭(BC600)在阿特拉津浓度较低时具有较高的吸附能力，且随着热解温度的升高，吸附量对总吸附量的贡献增大，高温花生壳生物炭可以有效的固定阿特拉津，并阻止其向地表或地下水中迁移。Zheng等人研究了废生物质在450℃限氧条件下制得的生物炭对阿特拉津的吸附性能，发现当生物炭粒径为0.24mm时，对阿特拉津的吸附容量为31％，当生物炭粒径为0.125mm时，对阿特拉津的吸附容量为44％，表明生物炭的粒径对阿特拉津的吸附有影响。本实验所用的生物炭粒径为0.15mm，对生物炭的最大吸附容量为41.64％，与本研究结果一致。

在生物降解过程中，不同浓度的生物炭表面和孔隙结构均可吸附污染物。由图8(a)(b)(c)可知，菌株和生物炭固定化菌剂对阿特拉津的生物降解效率远大于生物炭对阿特拉津的吸附效率，表明对阿特拉津的去除作用主要是生物降解而不是吸附。从图8(a)和图6(a)中可以看出，当菌悬液与生物炭母液比例为1:1时，菌株的生长受到了不同程度的抑制作用，但生物炭固定化菌剂对阿特拉津的生物降解效率仍大于菌株对阿特拉津的生物降解效率，表明当生物炭浓度较高时，固定化菌剂中生物炭过多的表面和孔隙结构对阿特拉津的吸附作用会导致菌株生长的碳源受到影响，同时对菌株的毒害作用减小，此时生物炭的吸附作用会吸附大量的阿特拉津，因此当两者比例为1:1时，固定化菌剂对阿特拉津的生物降解效率为CC600>CC400>CC250，第5d对阿特拉津的生物降解效率分别为69.76％、67.41％、61.88％。

由图8(b)(c)和6(b)(c)可知，当两者比例为2:1和3:1时，具有相同的规律特征，且随着生物炭浓度的增加，对菌株的生长促进作用也越明显，固定化菌剂对阿特拉津的生物降解效率也越明显。由图8(c)可知，当两者比例为2:1时，生物炭固定化菌剂对阿特拉津的去除效率最好，对阿特拉津的生物降解效果为SCC250>SCC400>SCC600。因此，SCC250固定化菌剂对阿特拉津的生物降解效率最高，为88.25％，明显高于单一菌株(69.49％)和生物炭(28.01％)。

固定化菌剂具有较好的去除效率有两方面的原因，一方面，生物炭提高了菌株的存活率，并能发挥稳定的降解性能；另一方面，生物炭具有促进菌株生长的营养物质。Fu等人研究了由肉桂壳、花生壳生物炭和假单胞菌YT-11制成的固定化菌剂对柴油的去除效果，结果表明，当以7.5g/L的柴油为唯一碳源时，第7d对其的去除率为69.94％和64.41％，远大于单一菌对柴油的去除，并且发现固定化菌剂的主要降解途径包括表面吸附、内部吸收和生物降解，降解前期以表面吸附为主，后期以生物降解为主。因此，以生物炭为载体固定菌株可有效提高单一菌株对阿特拉津的去除效果。

3.5综上所述

(1)测定了不同裂解温度条件下制备的玉米芯生物炭的基本理化性质，结果表明，随着裂解温度的升高，3种不同玉米芯生物炭的pH、EC和灰分升高，C含量呈上升趋势，而H含量、N含量、O含量呈下降趋势，生物炭的芳香性和炭化程度增强、疏水性增强以及极性基团减少，比表面积增大，自由基信号先增强后减弱。

(2)SEM可观察到生物炭的表面负载有杆状的菌体，且主要分布在生物炭表面的平坦处，菌株在生物炭表面以不同的菌落形态存在(聚集状、分散状)。

(3)适当增加生物炭浓度，可以促进菌株的生长，增强其对阿特拉津的去除效果，当生物炭浓度过高(1:1)时，会抑制菌株的生长，延长菌株的生长期。当阿特拉津浓度为2mg/L时，在pH＝7.63，温度33℃、10％的菌接种量条件下，菌悬液与生物炭母液比例为2:1，SCC250对阿特拉津的生物降解效率最高，为88.25％，明显高于单一菌株(69.49％)和生物炭(28.01％)。

本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。