确定待测核酸样本变异率的方法和系统
阅读说明：本技术 确定待测核酸样本变异率的方法和系统 (Method and system for determining mutation rate of nucleic acid sample to be detected ) 是由 谢震 黄慧雅 廖微曦 曹玉冰 郭亚琨 于 2020-03-23 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种确定待测核酸样本变异率的方法。方法包括：对待检测核酸样本进行测序,以便获得测序结果；将所述测序结果与所述待测核酸样本的参考基因组序列进行比对,以便获得比对结果；基于匹配测序读段与所述建库片段平均长度,分别确定并校正结构变异、单核苷酸和/或小片段变异；将未匹配测序读段与其他物种基因组参考序列进行比对,并确定各其他物种来源与未知来源的测序读段比例；对所述未匹配测序读段进行拼接,并对所述拼接结果与所述待测核酸样本的参考基因组序列进行比对,以便确定外源变异,并基于所述拼接结果,确定可能的来源物种；将所述结构变异、所述单核苷酸和/或小片段变异、外源变异进行汇总,以便确定所述待测核酸样本的变异率。(The invention provides a method for determining the mutation rate of a nucleic acid sample to be detected. The method comprises the following steps: sequencing a nucleic acid sample to be detected so as to obtain a sequencing result; comparing the sequencing result with a reference genome sequence of the nucleic acid sample to be detected so as to obtain a comparison result; respectively determining and correcting structural variation, single nucleotide variation and/or small fragment variation based on the average length of the matched sequencing reads and the library-building fragments; comparing the unmatched sequencing reads with the reference sequences of the genomes of other species, and determining the sequencing read proportion of the sources of the other species to the unknown sources; splicing the unmatched sequencing reads, comparing the splicing result with a reference genome sequence of the nucleic acid sample to be detected so as to determine exogenous variation, and determining possible source species based on the splicing result; summarizing the structural variation, the single nucleotide and/or small fragment variation and the exogenous variation so as to determine the variation rate of the nucleic acid sample to be detected.)
技术领域
本发明涉及生物信息领域，具体地，本发明涉及确定待测核酸样本变异率的方法和系统、计算机可读存储介质以及电子设备。
背景技术
病毒往往具有稳定的结构、简单的基因组、广谱的侵染能力与高效的包装能力而成为广泛使用的工程化DNA转运表达载体。而利用病毒自身的免疫特性，研究者使用灭活、减毒或工程改造的病毒作为有效的疫苗。更进一步，利用病毒在扩增过程中裂解宿主细胞的生物特性，研究者将病毒工程改造为具有复制包装能力并特异性实现肿瘤杀伤作用的溶瘤病毒。随着病毒相关研究的逐渐深入，目前已有腺病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒-1等多种病毒成为工程改造的对象，并有多种病毒产品应用于临床治疗。
虽然病毒作为工程载体具有上述优势，但病毒的致病能力与易于变异的特点也增加了安全上的风险。对于外源污染与自身变异的检测是改造与生产过程中的质量控制的重要内容。以腺病毒为例，FDA要求非复制型腺病毒中复制型腺病毒(RCA)水平小于1RCA/3e10VP。目前主要通过对特定区域进行PCR检测与一代测序的低通量方法对病毒样品中外源与变异片段进行检测，需要针对可能的变异类型对待测片段进行相应的引物设计，难以完全涵盖样品中所有的外源与变异片段，且受限于PCR反应特异性与长度限制，难以检测高同源性片段与长片段。深度测序技术通过随机片段化待测样品进行建库，可以高通量地检测样品中所有片段，涵盖了待测片段周围丰富的邻域信息，结合相关分析技术可以有效地检测病毒样品的外源与变异片段。
综上所述，病毒样品中外源与变异片段的检测是质量控制的重要内容，但目前传统的检测方法仍然存在低通量、不全面、难以检测高同源性片段与长片段的问题，发明人基于高通量的深度测序技术及相关分析技术，建立了从待测样品到分析报告的检测分析流程，有效全面地检测分析样品中外源污染与自身变异的情况。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
在工程病毒的改造与生产的质量控制中，为了检测外源污染与自身变异情况，发明人基于高通量的深度测序与相关分析技术，建立了从待测样品到分析报告的检测分析流程，有效全面地检测分析样品中外源污染与自身变异的情况。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种确定待测核酸样本变异率的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)对待测核酸样本进行测序，以便获得测序结果，所述测序的最低有效深度为10～100，所述测序结果的数据量是基于参考基因组的长度、最低有效测序深度以及预定的可检出变异最低变异率确定的，所述测序结果由多个测序读段构成；(2)将所述测序结果与所述待测核酸样本的参考基因组序列进行比对，以便获得比对结果，所述比对结果包括匹配测序读段和未匹配测序读段，并基于所述匹配测序读段确定所述测序的建库片段平均长度；(3)基于所述匹配测序读段与所述建库片段平均长度，分别确定并校正结构变异、单核苷酸和/或小片段变异；(4)对所述未匹配测序读段进行拼接，并对所述拼接结果与所述待测核酸样本的参考基因组序列进行比对，以便确定外源变异；(5)将所述结构变异、所述单核苷酸和/或小片段变异、外源变异进行汇总，以便确定所述待测核酸样本的变异率。根据本发明的是实施例，所述待测核酸样本包括病毒基因组。根据本发明实施例的方法可有效全面地检测分析待测核酸样本中外源污染与自身变异的情况。
根据本发明的实施例，所述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，在进行步骤(2)之前，预先对所述测序结果进行质量评估和筛选，并基于所述筛选结果，重新确定可检出变异最低变异率，如果所述可检出变异最低变异率低于预定的阈值，则在步骤(1)增加所述核酸样本的量。
根据本发明的实施例，在步骤(3)中，利用Pindel确定所述结构变异，并且采用所述预定的可检出变异最低变异率的一半作为变异率筛选阈值。
根据本发明的实施例，在确定所述结构变异、所述单核苷酸变异和/或所述小片段变异后，对所述变异所涉及的所述测序读段进行二次比对，，合并同类型检出变异并校正由于低质量碱基、比对结果误差等原因产生的假阳性检测结果。
根据本发明的实施例，在步骤(3)中，所述二次比对与步骤(2)中的比对采用不同的软件。
根据本发明的实施例，在步骤(3)中，根据公开数据与历史检测数据排除常见变异类型。
根据本发明的实施例，在步骤(3)中，采用Mutect2进行所述单核苷酸和/或小片段变异的检测。
根据本发明的实施例，在步骤(4)中，基于所述拼接结果，确定可能的来源物种。
根据本发明的实施例，进一步将所述未匹配测序读段与其他物种基因组参考序列进行比对，并确定各其他物种来源和未知来源的测序读段比例。
根据本发明的实施例，所述其他物种基因组包括人基因组和/或支原体基因组。
根据本发明的实施例，进一步包括对所述结构变异和/或外源变异进行PCR验证。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序。根据本发明的实施例，该程序被处理器执行时实现如前面所述的确定待测核酸样本变异率的方法。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种电子设备。根据本发明的实施例，所述电子设备包括存储器、处理器；其中，所述处理器通过读取所述存储器中存储的可执行程序代码来运行与所述可执行程序代码对应的程序，以用于实现如前面所述的确定待测核酸样本变异率的方法。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种确定待测核酸样本变异率的系统。根据本发明的实施例，所述系统包括：测序装置，所述测序装置用于对待测核酸样本进行测序，以便获得测序结果，所述测序的最低有效深度为10～100，所述测序结果的数据量是基于参考基因组的长度、最低有效测序深度以及预定的可检出变异最低变异率确定的，所述测序结果由多个测序读段构成；比对装置，所述比对装置与所述测序装置相连，用于将所述测序结果与所述待测核酸样本的参考基因组序列进行比对，以便获得比对结果，所述比对结果包括匹配测序读段和未匹配测序读段，并基于所述匹配测序读段确定所述测序的建库片段平均长度；匹配测序读段分析装置，所述匹配测序读段分析装置与所述比对装置相连，用于基于所述匹配测序读段与所述建库片段平均长度，分别确定并校正结构变异、单核苷酸和/或小片段变异；未匹配测序读段分析装置，所述未匹配测序读段分析装置与所述比对装置相连，对所述未匹配测序读段进行拼接，并对所述拼接结果与所述待测核酸样本的参考基因组序列进行比对，以便确定外源变异；输出装置，所述输出装置与所述匹配测序读段分析装置和所述未匹配测序读段分析装置相连，用于将所述结构变异、所述单核苷酸和/或小片段变异、外源变异进行汇总，以便确定所述待测核酸样本的变异率。根据本发明的实施例，所述待测核酸样本为病毒基因组。根据本发明实施例的系统适于执行上述确定待测核酸样本变异率的方法，有效全面地检测分析样本中外源污染与自身变异的情况。
根据本发明的实施例，上述系统还可以进一步包括如下技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述系统进一步包括：
最低变异率确定装置，所述最低变异率确定装置与所述测序装置和所述比对装置相连，用于预先对所述测序结果进行质量评估和筛选，并基于所述筛选结果，重新确定可检出变异最低变异率，如果所述可检出变异最低变异率低于预定的阈值，则在测序装置增加所述核酸样本的量，如果所述可检出变异最低变异率不低于预定的阈值，则测序结果输入所述比对装置。
根据本发明的实施例，所述系统进一步包括未匹配测序读段来源分析装置，所述未匹配测序读段来源分析装置与所述比对装置相连，用于将所述未匹配测序读段与其他物种基因组参考序列进行比对，并确定各其他物种来源和未知来源的测序读段比例，结果输入所述输出装置。
根据本发明的实施例，所述系统进一步包括拼接结果来源分析装置，所述拼接结果来源分析装置与未匹配测序读段分析装置相连，用于基于所述拼接结果，确定可能的来源物种，结果输入所述输出装置。
根据本发明的实施例，所述系统进一步包括PCR装置，所述PCR装置与所述匹配测序读段分析装置、所述未匹配测序读段来源分析装置和所述未匹配测序读段分析装置相连，用于对所述结构变异和/或外源变异进行PCR验证，结果输入所述输出装置。
附图说明
图1是病毒变异检测分析流程示意图；
图2A～2F是不同工具检测不同比例不同长度删除变异的准确性的仿真测试；
图3A～3F是不同工具检测不同比例不同长度翻转变异的准确性的仿真测试；
图4A～4F是不同工具检测不同比例不同长度插入变异的准确性的仿真测试；
图5A～5F是不同工具检测不同比例不同长度拷贝数变异的准确性的仿真测试；
图6是外源插入/替换变异检测流程；
图7A～7D是基于拼接检测不同比例不同长度外源替换变异的准确性的仿真测试；
图8A～8C是检测不同比例不同长度删除与翻转变异的准确性的实验测试；
图9是腺病毒样品实验测试与PCR验证；
图10是Pindel检出变异高分辨率校正流程；
图11是根据本发明实施例的确定待测核酸样本变异率的系统的结构示意图；
图12是根据本发明另一实施例的确定待测核酸样本变异率的系统的结构示意图；
图13是根据本发明另一实施例的确定待测核酸样本变异率的系统的结构示意图；
图14是根据本发明另一实施例的确定待测核酸样本变异率的系统的结构示意图；
图15是根据本发明另一实施例的确定待测核酸样本变异率的系统的结构示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明提出了一种确定待测核酸样本变异率的系统。根据本发明的实施例，参考图11，所述系统包括：测序装置100，所述测序装置100用于对待测核酸样本进行测序，以便获得测序结果，所述测序的最低有效深度为10～100，所述测序结果的数据量是基于参考基因组的长度、最低有效测序深度以及预定的可检出变异最低变异率确定的，所述测序结果由多个测序读段构成；比对装置200，所述比对装置200与所述测序装置100相连，用于将所述测序结果与所述待测核酸样本的参考基因组序列进行比对，以便获得比对结果，所述比对结果包括匹配测序读段和未匹配测序读段，并基于所述匹配测序读段确定所述测序的建库片段平均长度；匹配测序读段分析装置300，所述匹配测序读段分析装置300与所述比对装置200相连，用于基于所述匹配测序读段与所述建库片段平均长度，分别确定并校正结构变异、单核苷酸和/或小片段变异；未匹配测序读段分析装置400，所述未匹配测序读段分析装置400与所述比对装置200相连，对所述未匹配测序读段进行拼接，并对所述拼接结果与所述待测核酸样本的参考基因组序列进行比对，以便确定外源变异；输出装置500，所述输出装置500与所述匹配测序读段分析装置300和所述未匹配测序读段分析装置400相连，用于将所述结构变异、所述单核苷酸和/或小片段变异、外源变异进行汇总，以便确定所述待测核酸样本的变异率。根据本发明的实施例，所述待测核酸样本为病毒基因组。根据本发明实施例的系统适于执行上述确定待测核酸样本变异率的方法，有效全面地检测分析样本中外源污染与自身变异的情况。
根据本发明的实施例，上述系统还可以进一步包括如下技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，参考图12，所述系统进一步包括：最低变异率确定装置600，所述最低变异率确定装置600与所述测序装置100和所述比对装置200相连，用于预先对所述测序结果进行质量评估和筛选，并基于所述筛选结果，重新确定可检出变异最低变异率，如果所述可检出变异最低变异率低于预定的阈值，则在测序装置增加所述核酸样本的量，如果所述可检出变异最低变异率不低于预定的阈值，则测序结果输入所述比对装置。
根据本发明的实施例，参考图13，所述系统进一步包括未匹配测序读段来源分析装置700，所述未匹配测序读段来源分析装置700与所述比对装置200相连，用于将所述未匹配测序读段与其他物种基因组参考序列进行比对，并确定各其他物种来源和未知来源的测序读段比例，结果输入所述输出装置500。
根据本发明的实施例，参考图14，所述系统进一步包括拼接结果来源分析装置800，所述拼接结果来源分析装置800与未匹配测序读段分析装置400相连，用于基于所述拼接结果，确定可能的来源物种，结果输入所述输出装置500。
根据本发明的实施例，参考图15，所述系统进一步包括PCR装置900，所述PCR装置900与所述匹配测序读段分析装置300、所述未匹配测序读段来源分析装置700和所述未匹配测序读段分析装置400相连，用于对所述结构变异和/或外源变异进行PCR验证，结果输入所述输出装置500。
在工程病毒的改造与生产的质量控制中，为了检测外源污染与自身变异情况，发明人基于高通量的深度测序与相关分析技术，建立了从待测样品到分析报告的检测分析流程，有效全面地检测分析样品中外源污染与自身变异的情况。
具体流程如下：
1)通过文献调研、一代测序等方式获得所测病毒的参考基因组序列；病毒纯化后提取高质量的病毒基因组DNA。
2)通过深度测序技术，对病毒提取基因组进行建库测序，获得足够深度的高通量测序数据。最低有效测序深度为经验值10～100，可通过参考基因组序列长度、最低有效测序深度与预设可检出变异最低变异率估计所需总数据量，
3)使用测序数据质量评估软件(如Fastqc)对测序质量进行评估，主要判断碱基质量分布与接头污染情况；使用测序数据预处理软件(如Cutadapt)进行预处理，并结合质量评估的结果选择相应的接头类型、碱基质量阈值与序列长度阈值；数据预处理后重新进行质量评估，确认预处理效果；并根据预处理后总数据量重新估计可检出变异最低变异率，如果达不到预设可检出变异最低变异率则需要加测样品。
4)使用序列比对软件(如Bwa)将预处理后的数据与参考基因组比对，获得比对结果，保留次优比对结果；使用比对结果处理软件(如Samblaster)对比对结果进行去重并提取未匹配测序读段；使用比对结果处理软件(如Sambamba)对比对结果进行排序并估计建库片段平均长度。
5)使用结构性变异检测软件(如Pindel)基于比对结果与建库片段平均长度进行结构性变异分析，根据参考基因组序列长度选择合适的检测变异长度范围，选择预设可检出变异最低变异率的一半作为变异率筛选阈值。
6)使用高分辨率变异检测校正软件对变异检测结果与检出变异率进行校正，基于检出变异涉及数据的重新比对结果，合并同类型检出变异，排除由于低质量碱基、比对结果误差等原因产生的假阳性检测结果，根据公开数据与历史检测数据排除常见变异类型。
7)使用单核苷酸与小片段变异检测软件(如Mutect2)基于比对结果进行单核苷酸与小片段变异分析，根据公开的病毒多态性数据与历史检测数据排除常见变异类型，并与结构性变异检测结果进行比较，以降低假阴性为目标，补充在结构性变异检测中未检出的单核苷酸与小片段变异，并校正也在结构性变异检测中检出的单核苷酸与小片段变异的估计变异率。
8)将未匹配测序读段分别与可能污染源基因组(如人基因组，支原体基因组)进行比对，统计各污染源和未知来源在样品中所占比例；并根据污染源序列所占比例重新估计所测病毒来源的总数据量与可检出变异最低变异率，如果达不到预设可检出变异最低变异率则需要加测样品。
9)使用拼接软件(如Spades)对未匹配测序读段进行拼接，调整kmer参数以获得最好的拼接率与拼接长度。使用替换变异检出软件根据外源片段拼接结果检测外源替换变异，将拼接片段与病毒参考基因组比对，筛选片段两端一半读长均能与参考基因组匹配的拼接片段，根据匹配位置分析可能的外源插入、替换变异，根据参考基因组数据深度与拼接片段数据深度估计变异率。
10)使用序列相似性搜索软件(如Blast)对拼接片段进行搜索，分析拼接片段可能来源物种与基因信息。
11)对于检出的结构性变异与外源片段变异，设计相应的PCR实验进行验证，并回收PCR片段进行一代测序验证。
12)综合上述分析结果，生成最终分析报告。
本发明流程示意图如图1所示。
下面将进一步详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1病毒变异检测分析流程的仿真测试
实验一
仿真测试各工具检测各种长度的删除、翻转、插入、拷贝数变异的准确性
每次仿真随机生成40000bp序列作为参考基因组序列，使用工具Art仿真建库过程生成40000对Illumina PE150测序数据作为未变异的测序数据；分别在参考基因组序列中随机生成长度分别为1、10、100、200、1000bp的删除变异，使用工具Art仿真建库过程生成40000对Illumina PE150测序数据作为变异后的测序数据；分别以0.1、0.2、0.5的变异率将未变异与变异后的测序数据采样混合，并分别使用工具Mutect2、FreeBayes、Pindel、Delly、Gridss、Lumpy检测所生成变异。重复仿真200次，评价各工具检测不同长度删除变异的准确性。
每次仿真随机生成40000bp序列作为参考基因组序列，使用工具Art仿真建库过程生成40000对Illumina PE150测序数据作为未变异的测序数据；分别在参考基因组序列中随机生成长度分别为10、100、200、1000bp的翻转变异，使用工具Art仿真建库过程生成40000对Illumina PE150测序数据作为变异后的测序数据；分别以0.1、0.2、0.5的变异率将未变异与变异后的测序数据采样混合，并分别使用工具Mutect2、FreeBayes、Pindel、Delly、Gridss、Lumpy检测所生成变异。重复仿真200次，评价各工具检测不同长度翻转变异的准确性。
每次仿真随机生成40000bp序列作为参考基因组序列，使用工具Art仿真建库过程生成40000对Illumina PE150测序数据作为未变异的测序数据；分别在参考基因组序列中随机生成长度分别为1、10、100、200bp的插入变异，使用工具Art仿真建库过程生成40000对Illumina PE150测序数据作为变异后的测序数据；分别以0.1、0.2、0.5的变异率将未变异与变异后的测序数据采样混合，并分别使用工具Mutect2、FreeBayes、Pindel、Delly、Gridss、Lumpy检测所生成变异。重复仿真200次，评价各工具检测不同长度插入变异的准确性。
每次仿真随机生成40000bp序列作为参考基因组序列，使用工具Art仿真建库过程生成40000对Illumina PE150测序数据作为未变异的测序数据；分别在参考基因组序列中随机生成长度分别为25、50、100、200、1000bp的2X与3X拷贝数变异，使用工具Art仿真建库过程生成40000对Illumina PE150测序数据作为变异后的测序数据；分别以0.1、0.2、0.5的变异率将未变异与变异后的测序数据采样混合，并分别使用工具Mutect2、Pindel、Delly、Gridss检测所生成变异。重复仿真200次，评价各工具检测不同长度拷贝数变异的准确性。
检测结果见图2A～2F,3A～3F,4A～4F,5A～5F。Mutect2与FreeBayes是检测单核苷酸变异与小片段插入删除变异的工具，在测试中可检测到最大长度为10bp的删除、插入、翻转变异，Mutect2可以检测长度最大长度50bp的拷贝数2X变异，工具所评估的变异率与实际变异率接近。Delly、Lumpy与Gridss是检测结构性变异的工具，在测试中可检测到最小长度为100bp的删除与翻转变异，由于Gridss具有局部拼接的功能，Gridss还能检测部分长度100与200bp的插入变异。Delly可以检测最小长度为200bp的2X拷贝数变异。Gridss可以检测最小长度为25bp的3X拷贝数变异。Delly、Lumpy与Gridss均不能评估变异率。Pindel可检测各种类型各种长度的变异，工具所评估的变异率与实际变异率接近。以仿真数据变异率0.1所对应的30X覆盖度为检测极限，与变异率0.2或0.5的仿真数据相比，各工具表现保持一致。综上，Pindel可全面地检测各种类型各种长度的变异，可作为病毒变异检测的主要工具；Mutect2与FreeBayes可作为单核苷酸变异与小片段插入删除变异检测的补充；长度较长的外源插入变异无法用基于已知图谱比对的工具检测，需要通过基于拼接的工具检测。
实验二
仿真测试各工具检测各种长度的外源片段变异的准确性
每次仿真随机生成40000bp序列作为参考基因组序列，使用工具Art仿真建库过程生成40000对Illumina PE150测序数据作为未变异的测序数据；分别在参考基因组序列中随机生成删除长度分别为0、200、500、1000、10000bp而插入长度分别为200、500、1000、10000bp的替换变异，使用工具Art仿真建库过程生成40000对Illumina PE150测序数据作为变异后的测序数据；分别以0.1、0.2、0.5的变异率将未变异与变异后的测序数据采样混合，并使用工具Spades拼接未匹配测序读段，检测所生成变异。外源插入/替换变异检测流程如图6。重复仿真200次，评价Spades拼接工具检测不同长度插入删除片段的替换变异的准确性。
检测结果如图7A～7D。对于不同长度插入删除片段的替换变异，Spades工具均能拼接出外源片段并准确比对至替换变异发生位置，工具所评估的变异率与实际变异率接近。以仿真数据变异率0.1所对应的30X覆盖度为检测极限，与变异率0.2或0.5的仿真数据相比，检测准确性表现一致。这说明对于长度较长的外源片段插入/替换变异，基于拼接的Spades工具可以准确检测外源片段与变异发生位置。
实施例2病毒变异检测分析流程的腺病毒实验测试
实验一
实验测试病毒变异检测分析流程检测各种长度的删除、翻转变异的准确性
构建长度约40000bp的腺病毒包装质粒作为未变异载体；在未变异载体上不同位置引入不同长度的删除与翻转变异，如表1；分别以0.001、0.01、0.1变异率混合未变异载体与变异载体，并以测序深度1G进行Illumina PE150深度测序；通过病毒变异检测分析流程检测各样本中的变异，与变异载体及实际变异率比较并评价病毒变异检测分析流程的准确性。
检测结果如图8A～8C。对于所测的不同位置不同长度的删除与翻转变异，病毒变异检测分析流程均能准确地检测出来，以实际变异率0.001所对应的约30X覆盖度为检测极限，与变异率0.01或0.1相比，检测准确性表现一致。
表1:
类型
长度(bp)
起始位置(bp)
变异A
删除
15
1177
变异B
删除
347
1837
变异C
删除
1042
2907
变异D
翻转
12
6084
变异E
翻转
320
5047
变异F
翻转
2079
4504
实验二
实验测试病毒变异检测分析流程检测病毒样品SYN
提取病毒样品SYN基因组并以测序深度1G进行Illumina PE150深度测序；通过病毒变异检测分析流程检测各样本中的变异，并通过PCR与一代测序反应验证检测结果。
通过对测序结果进行分析，检测出外源片段1与外源片段2。分别设计相应的PCR引物，跑胶结果如图9，与检出外源片段长度及位置一致。回收PCR片段进行一代测序，序列与检出外源片段一致。
实施例3Pindel检出变异高分辨率校正流程测试
实验一
实验测试Pindel检出变异高分辨率校正流程校正病毒样品SYN2的检测结果
Pindel检出变异高分辨率校正流程如图10。筛选Pindel检出变异深度大于10的结果，共计254种；经过高分辨率校正后，共检出微卫星不稳定变异34种，其它变异8种，其中2种为合并变异；与历史检出结果比较，微卫星不稳定变异均为既有变异，而其它变异中5种为既有变异，3种为新检出变异。结果如表2所示。可见校正流程有效提高了Pindel检测结果的准确性
表2：
实施例4病毒变异检测分析流程的慢病毒实验测试
实验一
实验测试病毒变异检测分析流程检测慢病毒样品
构建一定长度片段的慢病毒载体作为未变异载体；在未变异载体上不同位置引入不同长度的删除与翻转变异；分别以0.01变异率混合未变异载体与变异载体，并以测序深度1G进行Illumina PE150深度测序；通过病毒变异检测分析流程检测各样本中的变异，与变异载体及实际变异率比较并评价病毒变异检测分析流程的准确性。
对于所测的不同位置不同长度的删除与翻转变异，病毒变异检测分析流程均能准确地检测出来，与变异率0.01相比，检测准确性表现一致。
实施例5病毒变异检测分析流程的腺相关病毒实验测试
实验一
实验测试病毒变异检测分析流程检测腺相关病毒样品
构建一定长度片段的腺相关病毒载体作为未变异载体；在未变异载体上不同位置引入不同长度的删除与翻转变异；分别以0.01变异率混合未变异载体与变异载体，并以测序深度1G进行Illumina PE150深度测序；通过病毒变异检测分析流程检测各样本中的变异，与变异载体及实际变异率比较并评价病毒变异检测分析流程的准确性。
对于所测的不同位置不同长度的删除与翻转变异，病毒变异检测分析流程均能准确地检测出来，与变异率0.01相比，检测准确性表现一致。
实施例6病毒变异检测分析流程的单纯疱疹病毒实验测试
实验一
实验测试病毒变异检测分析流程检测单纯疱疹病毒样品
构建一定长度片段的单纯疱疹病毒载体作为未变异载体；在未变异载体上不同位置引入不同长度的删除与翻转变异；分别以0.01变异率混合未变异载体与变异载体，并以测序深度1G进行Illumina PE150深度测序；通过病毒变异检测分析流程检测各样本中的变异，与变异载体及实际变异率比较并评价病毒变异检测分析流程的准确性。
对于所测的不同位置不同长度的删除与翻转变异，病毒变异检测分析流程均能准确地检测出来，与变异率0.01相比，检测准确性表现一致。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。