丹参总酮和三七总皂苷在制备用于预防和治疗结肠炎的药物中的应用
阅读说明：本技术 丹参总酮和三七总皂苷在制备用于预防和治疗结肠炎的药物中的应用 (Application of total tanshinone and total notoginsenoside in preparing medicine for preventing and treating colitis ) 是由 罗花 谭德超 王一涛 王胜鹏 李鹏 钟章锋 余华 王芷廷 于 2021-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了丹参总酮和三七总皂苷在制备用于预防和治疗结肠炎的药物中的应用,涉及生物医药技术领域。本发明筛选出了具有抗炎作用的丹参总酮以及三七总皂苷,且丹参总酮联合三七总皂苷在预防和治疗结肠炎方面具有协同增效的作用,联合治疗能够更有效地达到预防和治疗结肠炎的效果,为未来开发预防和治疗结肠炎的中药药对和新药奠定了基础。(The invention discloses application of total tanshinone and total notoginsenoside in preparing a medicament for preventing and treating colitis, and relates to the technical field of biological medicines. The invention screens out the total tanshinone and the panax notoginseng saponins with anti-inflammatory effect, and the total tanshinone and the panax notoginseng saponins have synergistic effect in the aspect of preventing and treating the colitis, and the combined treatment can more effectively achieve the effect of preventing and treating the colitis, thereby laying a foundation for developing traditional Chinese medicine pairs and new drugs for preventing and treating the colitis in the future.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及丹参总酮和三七总皂苷在制备用于预防和治疗结肠炎的药物中的应用。
背景技术
结肠炎包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，是一种发生在胃肠道的慢性复发性疾病，其症状包括腹泻、便血、贫血、体重减轻和疲劳等。
从中医角度分析，结肠炎病理因素涉及淤热、气滞、血瘀等，常见临床症候有大肠湿热证、脾虚湿蕴证、寒热错杂证等。在肠镜下可观察到结肠炎患者的肠黏膜呈红色，有明显的水肿、充血，以及溃疡出血，肠腔内也有弥漫性的充血水肿。
迄今为止，结肠炎的发病机制仍未明确，也尚未发现可以完全治愈结肠炎的药物。目前市面上用于治疗结肠炎的药物主要有氨基水杨酸类、糖皮质激素类、免疫调节剂和单克隆抗体等，但这些药物通常伴随有副作用或不良反应。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供丹参总酮和三七总皂苷在制备用于预防和治疗结肠炎的药物中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了丹参总酮和三七总皂苷在制备用于预防和/或治疗结肠炎的药物中的应用。
第二方面，本发明实施例提供了丹参总酮和三七总皂苷在制备用于抑制炎症细胞合成NO的药物中的应用。
第三方面，本发明实施例提供了丹参总酮和三七总皂苷在制备用于抑制NF-κB活化的药物中的应用。
第四方面，本发明实施例提供了丹参总酮和三七总皂苷在制备用于抑制炎症因子表达水平或提高抑炎因子表达水平的药物中的应用。
第五方面，本发明实施例提供了一种预防和/或治疗结肠炎的药物，所述药物包含丹参总酮和三七总皂苷；丹参总酮和三七总皂苷的质量比为1：(5～80)。
本发明具有以下有益效果：
本发明筛选出了具有抗炎作用的丹参总酮以及三七总皂苷，相对于单独用药而言，丹参总酮以及三七总皂苷的联合治疗能够更有效地达到预防和治疗结肠炎的技术效果，为未来开发预防和治疗结肠炎的中药药对和新药奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中丹参总酮与三七总皂苷联合用药体外抑制Pam3CSK4诱导的巨噬细胞产生NO；
图2为实施例2中丹参总酮与三七总皂苷联合用药体外抑制Pam3CSK4诱导的巨噬细胞发生p65核转移；
图3为实施例3中丹参总酮与三七总皂苷联合用药缓解DSS诱导的小鼠模型体重减轻；
图4为实施例3中参总酮与三七总皂苷联合用药缓解DSS诱导的小鼠模型DAI；
图5为实施例3中丹参总酮与三七总皂苷联合用药缓解DSS诱导的小鼠模型结肠缩短；
图6为实施例3中丹参总酮与三七总皂苷联合用药缓解DSS诱导的小鼠模型结肠溃疡损伤；
图7为实施例3中丹参总酮与三七总皂苷联合用药降低了DSS诱导的小鼠模型结肠组织病理学损伤评分；
图8为实施例4中丹参总酮与三七总皂苷联合用药对DSS诱导的小鼠模型的结肠炎症因子影响。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先，本发明提供了丹参总酮和三七总皂苷在制备用于预防和/或治疗结肠炎的药物中的应用。
丹参总酮以及三七总皂苷具有抗炎作用，且相互之间具有本领域技术人员预料不到的技术效果，相对于单独用药而言，丹参总酮以及三七总皂苷的联合治疗能够更有效地达到预防和治疗结肠炎的技术效果。
本文中的“治疗”是指干预或改变特定健康状态的过程，包括预防、治愈或抑制结肠炎中的至少一种。
在可选的实施方式中，丹参总酮和三七总皂苷的质量比为1：(5～80)，具体可以为1:5、1:10、1:20、1:40或1:80。这里所述的质量比为制备药物时，采用的丹参总酮和三七总皂苷的量。优选地，丹参总酮和三七总皂苷的质量比为1:(20～60)，在该质量比的限定下，具有更好的协同增效。
在制备药物时，可以将丹参总酮和三七总皂苷混合配置，也可以分别进行配置，只要满足药物中包括这两种组分即可。在可选的实施方式中，所述药物的制备包括：配制含有丹参总酮的第一溶液，配制含有三七总皂苷的第二溶液。第一溶液和第二溶液的溶剂可以选择现有的缓冲液或水。
在可选的实施方式中，所述结肠炎包括克罗恩病和溃疡性结肠炎中的至少一种。
本发明实施例还提供了丹参总酮和三七总皂苷在制备用于抑制炎症细胞合成NO的药物中的应用。丹参总酮和三七总皂苷能够有效抑制炎症细胞合成NO，为炎症细胞产生过量NO导致的相关疾病的预防或治疗提供了一种新的途径，所述相关疾病包括但不限于结肠炎。
本发明实施例还提供了丹参总酮和三七总皂苷在制备用于抑制NF-κB活化的药物中的应用。
丹参总酮和三七总皂苷的联合治疗能够抑制NF-κB活化，从而抑制由NF-κB活化导致的相关疾病(包括但不限于结肠炎)。具体地，丹参总酮和三七总皂苷的联合治疗能够抑制p65会向细胞核转移。
本发明实施例还提供了丹参总酮和三七总皂苷在制备用于抑制炎症因子表达水平或提高抑炎因子表达水平的药物中的应用。
具体地，炎症因子包括但不限于TNF-α、IL-6、IL-1β、MPO和MCP-1中的至少一种；抑炎因子包括IL-10。丹参总酮和三七总皂苷的联合治疗能够有效抑制炎症因子表达水平或提高抑炎因子表达水平，为由炎症因子表达水平过量或抑炎因子表达水平过低导致的相关疾病(包括但不限于结肠炎)提供了一种新的治疗或预防的方法。
此外，本发明实施例还提供了一种预防和/或治疗结肠炎的药物，所述药物包含丹参总酮和三七总皂苷。
在优选的实施方式中，丹参总酮和三七总皂苷的质量比为1：(5～80)，优选为1：(20～60)。丹参总酮和三七总皂苷的制备方式同前述任意实施例所述，在此不再赘述。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
实验药物：丹参总酮和三七总皂苷。
体外抗炎实验：将RAW 264.7巨噬细胞接种于24孔板，24小时细胞附着于24孔板上后，先提前加入1μg/mL丹参总酮、40μg/mL三七总皂苷、1μg/mL丹参总酮+40μg/mL三七总皂苷干预细胞4小时，接着加入50ng/mL的Pam3CSK4诱导剂干预细胞12小时。根据Griess试剂盒说明书，分别取各组上清液与Griess试剂于96孔板中进行反应半个小时。最后置于酶标仪，吸收波长设置为490nm，进行吸光度检测。
实验结果
参照图1，丹参总酮与三七总皂苷在由Pam3CSK4诱导的细胞炎症模型中均表现出抗炎作用，可以显著抑制NO的释放，但两者联用抗炎效果明显强于单独用药。
实施例2
免疫荧光蛋白检测：将RAW 264.7巨噬细胞接种于24孔板，24小时细胞附着于24孔板上后，先提前加入1μg/mL丹参总酮、40μg/mL三七总皂苷、1μg/mL丹参总酮+40μg/mL三七总皂苷干预细胞2小时，接着加入50ng/mL的Pam3CSK4诱导剂干预细胞4小时。去掉24孔板里所有液体后，加入4％多聚甲醛固定细胞10分钟，然后用冷PBS洗涤细胞两次。接下来，将细胞用含0.5％Triton X-100的PBS透化20分钟，并用5％胎牛血清(用PBS配制，并含0.2％Triton X-100)封闭1小时。将细胞与p65一抗(1:100；Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)一起孵育过夜，接着加入Alexa Fluor 514偶联的二抗(1:1000；CellSignaling Technology，Danvers，MA，USA)一起孵育1小时后再加入Hoechst 33342用于染细胞核。最后用Leica TCS SP8激光扫描共聚焦显微镜拍照。
实验结果
由图2可知，经Pam3CSK4的诱导，p65会向细胞核转移，然而丹参总酮与三七总皂苷可以抑制这种情况的转移，丹参总酮与三七总皂苷联合干预细胞起到更明显的抑制作用。
实施例3
动物实验：60只C57BL/6小鼠随机分为6组，每组10只小鼠。药物浓度分别配制为：丹参总酮组(TT，1mg/mL)，三七总皂苷组(PNS，40mg/mL)，丹参总酮+三七总皂苷-低剂量组(TT 0.5mg/mL+PNS 20mg/mL(L))，丹参总酮+三七总皂苷-高剂量组(TT 1mg/mL+PNS 40mg/mL(H))，对照组(Control，生理盐水)，DSS模型组(Model，3％DSS)，每只小鼠给予对应药物或纯水0.2ml每天。小鼠正常饲养5天，使其适应环境。丹参总酮组、三七总皂苷组、丹参总酮+三七总皂苷-低剂量组，丹参总酮+三七总皂苷-高剂量组分别先给予对应药物干预4天，接着除对照组外，其余组给予7天含3％DSS的饮用水造成结肠炎模型。每天称量小鼠体重，观察小鼠粪便情况，并用便隐血试剂盒检测小鼠便血情况。取指标当天，收集小鼠结肠、脾脏等用于进一步研究，并测量结肠的长度和重量。小鼠新鲜粪便用于16sDNA测序，检测药物对肠道菌群的调节作用。此外，利用ELISA试剂盒检测小鼠结肠炎症因子变化。
实验结果
C57BL/6小鼠连续饮用含3％DSS的水会诱发结肠炎，在第三天左右即出现便血的情况，粪便渐渐变得软烂不成型，体重也会随之下降(图3)，结肠也相应地萎缩。连续饮用7天造成结肠溃疡，如图4所示，模型组小鼠DAI指数逐日上升，接受丹参总酮、三七总皂苷，以及丹参总酮联合三七总皂苷用药治疗的小鼠DAI上升的趋势受到抑制，特别是联合用药组的效果更明显。与模型组相比，给药组的小鼠结肠相对较长，其中联合用药高浓度组小鼠的结肠长度与空白对照组接近。
对照组正常小鼠结肠组织病理学检查显示隐窝和结肠上皮细胞结构完整，杯状细胞正常。而DSS诱导的结肠炎小鼠结肠组织出现严重病变，例如上皮细胞、杯状细胞和隐窝结构消失。肠黏膜下层和黏膜也有明显的透壁炎症细胞浸润。经丹参总酮、三七总皂苷，以及丹参总酮联合三七总皂苷用药治疗后，这些组织学变化得到明显改善，特别是联合用药组效果最明显(图6)，明显降低了组织病理学损伤评分(图7)。
实施例4
抑制DSS诱导的结肠炎小鼠的炎症因子分泌：将实施例3中收集的结肠组织经消化后用于ELISA试剂盒的检测。
结果发现，与对照组相比，DSS显著促进了炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、MPO和MCP-1水平的增加，而降低了抑炎因子IL-10的水平。与模型组相比，接受丹参总酮、三七总皂苷，以及丹参总酮联合三七总皂苷干预的小鼠结肠的促炎因子水平下降了，而提高了抑炎因子水平，特别是联合用药高浓度组的药效作用最明显(图8)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。