一种用于mRNA疫苗靶向递送的聚氨基酸及其制备方法和用途
阅读说明：本技术 一种用于mRNA疫苗靶向递送的聚氨基酸及其制备方法和用途 (Polyamino acid for mRNA vaccine targeted delivery and preparation method and application thereof ) 是由 王海龙 于 2021-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种用于mRNA疫苗靶向递送的的聚氨基酸及其制备方法和用途,所述聚氨基酸为侧链修饰的聚氨基酸,通过在聚氨基酸的侧链中引入亲水性成分和疏水性成分,能够形成聚氨基酸胶束,所述胶束用于高效地递送核酸分子。本发明的所述侧链修饰的聚氨基酸在侧链上引入在还原性环境中裂解的双硫键,能促进胶束对胞浆中还原性环境和低pH值响应,帮助mRNA疫苗从“溶酶体陷阱”中主动逃离进入胞浆。相较于被动地渗透压主导的逃离过程,纳米载体的主动裂解能更高效地释放mRNA。(The invention provides a polyamino acid for targeted delivery of an mRNA vaccine, a preparation method and application thereof. The side chain modified polyamino acid of the invention introduces disulfide bond cracked in reducing environment on the side chain, which can promote the response of micelle to reducing environment and low pH value in cytoplasm, and help mRNA vaccine actively escape from 'lysosome trap' and enter into cytoplasm. Active cleavage of the nanocarriers can release mRNA more efficiently than passive osmotic pressure dominated escape processes.)
技术领域
本发明属于聚合物材料领域，涉及一种用于mRNA疫苗靶向递送的聚氨基酸及其制备方法和用途。
背景技术
病毒是危及人类健康的重大公共卫生安全威胁。使用疫苗是人类抗击病毒的有效手段。自从用种‘牛痘’的方式战胜天花病毒以来，疫苗帮助人类有效控制和预防多种病毒引起的疾病，包括甲肝病毒、乙肝病毒、乙型脑膜炎以及流感病毒。针对致命性的埃博拉（Ebola）病毒和冠状病毒引起的严重急性呼吸道综合症（SARS）、中东呼吸道综合症（MERS）、2019冠状病毒病（COVID-19），开发疫苗成为控制病毒感染疫情的迫切需求。根据不同技术路线，疫苗的类型包括灭活疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗、核酸疫苗。其中，核糖核酸（RNA）疫苗通过细胞的蛋白质转录-翻译机制，在人体细胞的胞浆内产生与病毒受体结合区域、病毒衣壳蛋白或其他保守区域的蛋白质片段作为抗原，诱导免疫系统产生抗体，实现对病毒的免疫。
核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）是生命体系中重要的遗传物质。根据生命中心法则，遗传信息通过DNA－RNA－蛋白质的过程，转录和翻译成为功能性的蛋白质。该过程中，细胞利用信使RNA（mRNA）为模板翻译出蛋白质。信使RNA（mRNA）是一类RNA分子，它将遗传信息保存在核苷酸A-U、G-C的碱基对序列中，将遗传信息从DNA传递到核糖体，在那里作为蛋白质合成模板并表达蛋白产物。mRNA疫苗无需蛋白质表达纯化，通过体外合成病毒的相关序列mRNA，将mRNA传递到人体细胞内形成免疫。mRNA疫苗因而具有较多优势：1) mRNA易在体外生产和纯化, 除去蛋白药物及病毒载体制备的复杂过程，同时可避免宿主蛋白及病毒源性污染；2) mRNA的生产工艺通用性强，可以快速应用于生产不同的目的蛋白，节省药物研发时间，提高效率；3) mRNA仅需进入细胞质即可翻译成蛋白质，无需进入细胞核，因此不存在基因的插入和整合，提高药物的安全性；4) 通过调节序列修饰和递送载体可以改变其半衰期。mRNA疫苗生物安全性高、设计灵活、开发迅速、通用性强的特点，使之成为疫苗开发的重要途径。mRNA疫苗不但可以预防和抑制病毒在生物体内的感染，还可以使用mRNA疫苗治疗肿瘤，例如已有报道针对黑色素瘤和小细胞肺癌开发的mRNA疫苗均已进入临床试验阶段。
在临床试验发现，mRNA疫苗有效发挥作用受到如下具体因素限制：1）不能自由通过生物膜；2）容易被血浆和组织中RNA降解酶（RNase）分解；3）进入细胞后被内吞小体（endosome）捕获，发展成“溶酶体陷阱”（lysosome trapping），无法发挥作用。因此mRNA免疫效率依赖于提高mRNA疫苗在体内的稳定性和克服细胞内囊泡转运机制。由于核苷酸2位的羟基取代，RNA在生理环境下的稳定性不如DNA。为了避免RNA在体内循环过程中的水解和酶解消耗，mRNA疫苗和药物需要递送体系的包裹保护。但是，由于存在“溶酶体陷阱”而导致现有的递送体系的递送效率很低，无法实现mRNA疫苗和药物的有效递送。
为了通过递送体系使疫苗高效进入细胞并且从“溶酶体陷阱”中释放进入胞浆，mRNA疫苗的成药方式和递送方式对于药代动力学和剂量的控制起到关键作用。现有技术使用脂质体、脂质纳米颗粒作为递送体系制得mRNA疫苗和药物的纳米复合材料。含有正电荷类脂分子的脂质纳米颗粒可通过静电作用获得对带负电的核酸分子良好的装载效果。为了从“溶酶体陷阱”中高效释放mRNA疫苗和药物进入胞浆，需要对递送体系的稳定性、环境响应和靶向递送进行优化。所述环境响应包括细胞和组织的微环境改变，例如pH值、氧化-还原环境和与膜结构接触而导致的亲水-疏水环境变化。所述靶向递送能力是指对核酸递送体系进行生物功能化，利用生物功能性配体和抗体，获得对目标细胞（如癌细胞、免疫系统的B细胞、T细胞）和组织（如淋巴组织、肺、小肠等器官）的靶向递送能力。
胶束是分子在水溶液中自发形成的一种纳米聚集体形式，多为球状，还可为柱状。当含有亲水和亲油基团的表面活性剂在溶液中达到和超过临界胶束浓度（criticalmicelle concentration, CMC）后，自发缔合成为胶束。胶束在溶液中处于动态平衡，能够包裹和释放有效成分，适用于作为递送体系。胶束的疏水性内核使其能够包裹水相中难溶的疏水性化合物。具备负电性或正电性的组成成分的胶束，可以装载带有正电荷或负电荷的有效成分。具备生物相容性的胶束可以保持所接触生物分子的活性，确保低的细胞毒性，能在体内生物降解或无害地排除体外。现有技术报道了通过嵌段共聚物的结构设计形成高分子胶束。例如商品名为Pluronic®F-127的一类聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（PEO-PPO-PEO）三嵌段聚合物材料。此外，已有报道以壳多糖主链的接枝树枝状共聚物形成胶束类纳米材料。
发明内容
为了克服现有的核酸分子（如mRNA疫苗）由于“溶酶体陷阱”导致的低递送效率，本发明旨在提供一种对细胞和组织结构中氧化-还原环境和/或pH值变化敏感的聚氨基酸胶束递送体系。具体地，本发明提供一种用于递送核酸分子的聚氨基酸及其制备方法和用途，所述聚氨基酸是以聚氨基酸为主链的侧链修饰的聚氨基酸。聚氨基酸是一类可完全生物降解的主链类型，聚氨基酸的主链基于酰胺键在体内环境的生物稳定性优于酯键。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
一种侧链修饰的聚氨基酸，其中，所述聚氨基酸含有主链和侧链；所述主链为聚赖氨酸，或者为赖氨酸与其他氨基酸形成的共聚物；所述其他氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和精氨酸、组氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中的一种或多种；
所述侧链中至少部分侧链分别含有基团A和基团G，所述基团A为-L3-S-S-C4-25脂肪烃基，L3为C1-10亚脂肪烃基，所述基团G选自基团G1和/或基团G2，其中，基团G1为端基连有C1-10烷氧基的聚乙二醇基团，基团G2为端基连有生物功能性基团的聚乙二醇基团；
所述基团A或所述基团G通过连接基团Y与所述主链中的氨基酸相连。
在一个实施方式中，所述C4-25脂肪烃基为C4-25烷基、C4-25烯基、C4-25炔基。
在一个实施方式中，L3为C1-6烷基。
在一个实施方式中，所述连接基团Y为如下基团：-NH-CO-、-NH-、-N=CR1-、-N-CHR1-、-NH-CH2-CO-、-O-CO-、-O-、-O-CH2-CO-中的任意一种。其中，R1独立地选自H、C1-6烷基。上述连接基团Y中左起第一个氨基或氧来自于聚氨基酸侧链上的活性基团，如氨基或羟基。
在一个实施方式中，所述连接基团Y与基团A之间可以是直键（直接连接），也可以是存在任意的间隔基团。
在一个实施方式中，所述连接基团Y与基团G之间可以是直键（直接连接），也可以是存在任意的间隔基团。
在一个实施方式中，所述基团G1为-L1-PEG-L2-Z1-D，其中，PEG为聚乙二醇链段，D为C1-10烷氧基，Z1为连接基团，L1、L2为直键或间隔基团。
在一个实施方式中，所述基团G2为-L1-PEG-L2-Z2-E，其中，PEG为聚乙二醇链段，E为生物功能性基团，Z2为连接基团，L1、L2为直键或间隔基团。
在一个实施方式中，L1、L2例如为直键、C1-10烷基。
在一个实施方式中，所述连接基团Z1、Z2包括如下基团：
-CO-NH-、-CO-O-、-O-、-O-CH2-CO-、-NH-、-N=CR1-、-N-CHR1-、-NH-CH2-CO-、-S-S-、-S-CO-、-S-CH2-CO-或、叠氮基与炔基发生点击反应得到的连接基团、四嗪与双键发生点击反应得到的连接基团中的任意一种。
其中，所述叠氮基与炔基发生点击反应得到的连接基团为三唑基或其衍生物；所述四嗪与双键发生点击反应得到的连接基团为二氮杂环或其衍生物。
在一个实施方式中，所述聚乙二醇链段的重复单元数为1-600之间的整数，优选为2-300之间的整数，更进一步优选4-200之间的整数。
在一个实施方式中，所述基团A中的双硫键在还原性环境下可以裂解。
本发明中，所述的还原性环境中包含还原剂，例如巯基化合物、膦基化合物、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、以及硫代硫酸盐中的一种或多种；优选地选自谷胱甘肽、半胱氨酸、二硫苏糖醇、巯基乙醇、半胱胺和三-（2-羧乙基）膦中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述基团G1中的烷氧基为C1-6烷氧基，例如甲氧基、乙氧基。
在一个实施方式中，所述生物功能性基团为能与蛋白质、多肽、氨基酸等生物分子结合的结合子，包括人工合成的结合子或天然生物分子。
在一个实施方式中，所述结合子包括可以与亲和素结合的生物素；可以与SNAP蛋白连接的连接子，如苄基鸟嘌呤及其衍生物；可以与CLIP蛋白连接的连接子，如苄基胞嘧啶及其衍生物；可以与HaloTag蛋白连接的连接子（HaloTag Ligand (HTL)），如6-氯代正己烷及其衍生物；上述所述衍生物可以是乙二醇重复单元数小于46的寡聚乙二醇衍生物。
在一个实施方式中，所述天然生物分子包括糖类分子、RNA链段、氨基酸序列中的至少一种。
其中，所述糖类分子为能与受体蛋白质结合的糖类分子，包括单糖、二糖、寡聚糖；所述单糖选自二羟丙酮、赤藓糖、苏力糖、阿拉伯糖、核糖、脱氧核糖、木糖、来苏糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、鼠李糖中的至少一种。所述二糖选自蔗糖、乳糖、麦芽糖中的至少一种；所述寡聚糖选自麦芽三糖、松三糖、棉子糖、龙胆三糖、甘露三糖、鼠李三糖中的至少一种、及可以与其他小分子结合的α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精，δ-环糊精中的至少一种。
其中，所述RNA链段为能够与待检测生物分子互补的核苷酸或脱氧核苷酸序列，例如5-80个核苷酸的能与蛋白质结合的核酸适配体序列。
其中，所述氨基酸序列为能够与蛋白质如抗体结合的氨基酸序列，长度约为2-100个氨基酸残基的氨基酸序列，包括流感病毒血凝素HA氨基酸序列、FLAG氨基酸序列、myc-tag氨基酸序列、含有-EPEA氨基酸序列的“C-tag”和含有SRLEEELRRRL的氨基酸“ALFA-tag”。
本发明中，所述的抗体为多克隆抗体、单克隆抗体和纳米抗体中的至少一种，所述抗体为动物来源的抗体或重组蛋白质表达制备得到的抗体。
在一个实施方式中，所述侧链修饰的聚氨基酸可为如下中的一种：包括基团A和基团G1的聚氨基酸，包括基团A和基团G2的聚氨基酸，包括基团A、基团G1和基团G2的聚氨基酸。在所述聚氨基酸中，可以存在不被修饰的聚氨基酸侧链。
在一个实施方式中，所述聚氨基酸中，含有基团G1和/或基团G2的侧链数占全部侧链总量的摩尔百分比为2%-98%，优选5%-90%，更优选10%-80%。
在一个实施方式中，所述聚氨基酸中，含有基团A的侧链数占全部侧链总量的摩尔百分比为2%-98%，优选5%-90%，更优选10%-80%。
在一个实施方式中，所述聚氨基酸中，含有A基团的侧链数与含有基团G1和/或基团G2的侧链数之和占全部侧链总量的摩尔百分比为5%-100%，优选20%-100%，更优选40%-100%，例如可以为30%-98%，35%-95%或40%-90%。
在一个实施方式中，所述主链中的精氨酸、组氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺根据其侧链的疏水特性或分子构型、尺寸、芳香性、成氢键能力、pH值响应等特征，可以调节所述聚氨基酸的亲疏水性、成氢键能力和pH值响应。
在一个实施方式中，所述聚氨基酸的主链为聚左旋赖氨酸。
在一个实施方式中，所述聚氨基酸的主链为人工合成的聚右旋赖氨酸。
在一个实施方式中，所述聚氨基酸的主链是α-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸。
在一个实施方式中，所述聚氨基酸的主链为赖氨酸与其他氨基酸形成的共聚物，包括赖氨酸-精氨酸共聚物、赖氨酸-组氨酸共聚物、赖氨酸-丝氨酸共聚物、赖氨酸-苏氨酸共聚物、赖氨酸-酪氨酸共聚物、赖氨酸-丝氨酸-苏氨酸共聚物、赖氨酸-精氨酸-组氨酸共聚物、赖氨酸-丝氨酸-苏氨酸-酪氨酸共聚物、赖氨酸-甘氨酸共聚物、赖氨酸-亮氨酸共聚物、赖氨酸-异亮氨酸共聚物、赖氨酸-缬氨酸共聚物、赖氨酸-苯丙氨酸共聚物、赖氨酸-色氨酸共聚物的任意一种。
在一个实施方式中，所述聚氨基酸中，赖氨酸占其他氨基酸与赖氨酸总量的摩尔百分比为0.1%-100%，优选10%-100%，更优选30%-100%。
在一个实施方式中，所述聚氨基酸的重复单元数为2-3000之间的整数，优选3-1500之间的整数，更优选4-1000之间的整数，再优选5-500之间的整数。
在一个实施方式中，所述侧链修饰的聚氨基酸例如具体可为：
。
本发明还提供一种侧链修饰的聚氨基酸，其由如下制备方法制备得到：
将侧链具有活性基团的聚氨基酸、与一端连有C1-10烷氧基另一端连有反应性基团x1的聚乙二醇和/或一端连有生物功能性基团另一端连有反应性基团x2的聚乙二醇、以及一端连有反应性基团x3另一端连有活化双硫键的C1-10脂肪烃进行反应；其中，反应性基团x1、x2、x3与聚氨基酸侧链上的活性基团氨基或羟基反应，将端基带有C1-10烷氧基和/或生物功能性基团的聚乙二醇以及含有活化双硫键基团的脂肪烃连接到聚氨基酸的侧链上；然后再将上述产物与C4-25脂肪烃硫醇进行反应，制得所述侧链修饰的聚氨基酸。
根据本发明，所述活化双硫键为-S-S-吡啶基。
在一个实施方式中，所述一端连有C1-10烷氧基另一端连有反应性基团x1的聚乙二醇可以是商业途径购买后获得的，也可以采用本领域的常规方法进行制备得到。
在一个实施方式中，所述一端连有生物功能性基团另一端连有反应性基团x2的聚乙二醇可以是商业途径购买后获得的，也可以采用本领域的常规方法进行制备得到，例如通过如下方法制备得到：
将一端连有反应性基团x2另一端连有反应性基团x4的聚乙二醇与连有反应性基团x5的生物功能性物质进行反应，所述反应性基团x4与反应性基团x5发生反应，从而使生物功能性基团连接到聚乙二醇的一端。
在一个实施方式中，所述反应性基团x4、x5例如选自羟基、氨基、羧基、醛基、酮基、酯基、巯基、马来酰亚胺、α-卤代羰基、炔基、烯键、叠氮基、四嗪基。其中，反应性基团x4、x5互为反应性基团，可以发生反应。
例如，氨基与羧基缩合反应得到酰胺连接基团，或者氨基与醛基或酮基反应得到希夫碱连接基团，或者氨基与酯基反应得到酰胺连接基团，或者羟基与羧基缩合反应得到酯连接基团，或者羟基与羟基脱水进行缩合反应得到醚连接基团，或者马来酰亚胺与巯基进行加成反应，或者巯基与α-卤代羰基发生的取代反应，或者炔基与叠氮基发生点击反应得到连接基团，或者烯键与四嗪基发生点击反应得到连接基团。其中，炔基与叠氮基发生点击反应是本领域中已知的“点击化学”反应，例如：由金属离子（例如Cu(I)）催化的叠氮化物-炔环加成反应（Sharpless反应，炔基一般在端基），或者，环张力催化的叠氮化物-炔环加成反应（SPAAC反应，炔基位于张力环的中间）。烯键与四嗪基发生点击反应是本领域中已知的反应，例如环烯烃与四嗪基发生环加成反应。
示例性地，当x4为氨基时，x5为羧基、醛基、酮基、酯基、α-卤代羰基中的至少一种；当x4为羟基时，x5为羧基、羟基、α-卤代羰基中的至少一种；当x4为巯基时，x5为巯基、马来酰亚胺、α-卤代羰基中的至少一种；当x4为炔基时，x5为叠氮基；当x4为烯键时，x5为四嗪基。反之也成立。
在聚乙二醇与端基的反应性基团x1、x2、x4或生物功能性基团之间可以直接连接，即作为封端基团，也可以通过任意的间隔基团进行连接，这依赖于采用本领域中特定的常规方法将上述反应性基团或生物功能基团引入到聚乙二醇上。在聚乙二醇与反应性基团之间的间隔基团可以是任意的，只要不影响制备本发明所述的聚氨基酸，所述间隔基团例如为C1-12烷基、酯基、酰胺基、酮基等。
在一个实施方式中，上述步骤中，所述反应均为本领域的常规反应步骤，示例性地，所述反应的温度为10-40℃。
在一个实施方式中，所述反应可以在偶联剂促进下进行。例如氨基与羧基在偶联剂存在下缩合反应得到酰胺连接基团，或者羟基与羧基在偶联剂存在下缩合反应得到酯连接基团。所述偶联剂例如为碳二亚胺衍生物，选自1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，或N,N-二环己基碳二亚胺，以及琥珀酰亚胺。所述偶联剂进一步包括二硫键结构，如琥珀酰亚胺3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯、琥珀酰亚胺-寡聚乙二醇-3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯。偶联剂与反应物的摩尔比为1~500，优选1~100，更优选1~50，再优选1~20。
在一个实施方式中，所述聚氨基酸为聚赖氨酸，或者为赖氨酸与其他氨基酸形成的共聚物；所述其他氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和精氨酸、组氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中的一种或多种。
本发明中，所述赖氨酸的侧链含有氨基；所述丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的侧链含有羟基；上述基团可以通过共价偶联反应进行侧链功能化修饰。
本发明中，所述精氨酸、组氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺根据其侧链的疏水特性或分子构型、尺寸、芳香性、成氢键能力、pH值响应等特征，可以用于调节聚氨基酸的亲疏水性、成氢键能力和pH值响应。
在一个实施方式中，所述生物功能性基团的定义如上所述。
在一个实施方式中，所述一端连有C1-10烷氧基另一端连有反应性基团x1的聚乙二醇的结构为：x1-L1-PEG-L2-Z1-D，其中，PEG为聚乙二醇链段，D为C1-10烷氧基，Z1为连接基团，L1、L2为直键或间隔基团，反应性基团x1为羟基、羧基、醛基、酮基、酯基、马来酰亚胺、α-卤代羰基。
在一个实施方式中，所述一端连有生物功能性基团另一端连有反应性基团x2的聚乙二醇的结构为：x2-L1-PEG-L2-Z2-E，其中，PEG为聚乙二醇链段，E为生物功能性基团，Z2为连接基团，L1、L2为直键或间隔基团，反应性基团x2为羟基、羧基、醛基、酮基、酯基、马来酰亚胺、α-卤代羰基。
在一个实施方式中，所述一端连有反应性基团x3另一端连有活化双硫键的脂肪烃的结构为：x3-L3-S-S-吡啶基，反应性基团x3为羟基、羧基、醛基、酮基、酯基、马来酰亚胺、α-卤代羰基。L3为C1-10脂肪烃基。
在一个实施方式中，所述反应性基团x1、x2、x3选自羟基、羧基、醛基、酮基、酯基、马来酰亚胺、α-卤代羰基；反应性基团x1、x2、x3与聚氨基酸侧链上的活性基团氨基或羟基反应；具体地，氨基与羧基缩合反应得到酰胺连接基团，或者氨基与醛基或酮基反应得到希夫碱连接基团，或者氨基与酯基反应得到酰胺连接基团，或者氨基与α-卤代羰基发生的取代反应，或者羟基与羧基缩合反应得到酯连接基团，或者羟基与羟基脱水进行缩合反应得到醚连接基团，或者羟基与α-卤代羰基发生的取代反应。
示例性地，当聚氨基酸的侧链含有氨基时，所述反应性基团x1、x2、x3为羧基、醛基、酮基、酯基、α-卤代羰基中的至少一种；当聚氨基酸的侧链含有羟基时，所述反应性基团x1、x2、x3为羧基、羟基、α-卤代羰基中的至少一种。
本发明还提供一种上述侧链修饰的聚氨基酸的制备方法，包括如下步骤：
将侧链具有活性基团的聚氨基酸、与一端连有C1-10烷氧基另一端连有反应性基团x1的聚乙二醇和/或一端连有生物功能性基团另一端连有反应性基团x2的聚乙二醇、以及一端连有反应性基团x3另一端连有活化双硫键的C1-10脂肪烃进行反应；其中，反应性基团x1、x2、x3与聚氨基酸侧链上的活性基团氨基或羟基反应，将端基带有C1-10烷氧基和/或生物功能性基团的聚乙二醇以及端基带有活化双硫键的脂肪烃连接到聚氨基酸的侧链上；然后再将上述产物与C4-25脂肪烃硫醇进行反应，制得所述侧链修饰的聚氨基酸。
本发明还提供上述侧链修饰的聚氨基酸的用途，其用于制备胶束。
本发明还提供一种胶束，所述胶束包括上述的侧链修饰的聚氨基酸。
在一个实施方式中，所述胶束是通过将侧链修饰的聚氨基酸溶解到溶剂中形成的。
优选地，将侧链修饰的聚氨基酸溶解在水或pH为3-8的缓冲液中，使其浓度为1-1000倍临界胶束浓度，形成所述胶束。
在一个实施方式中，所述胶束是由上述的一种侧链修饰的聚氨基酸组成，或者由上述的两种以上侧链修饰的聚氨基酸组合而成。所述组合可以是二元、三元或多元侧链修饰的聚氨基酸的组合，组合物中的各侧链修饰的聚氨基酸的百分比没有特定的限制只要组合物能够形成胶束。
在一个实施方式中，所述侧链修饰的聚氨基酸的临界胶束浓度是通过本领域已知的方法测试得到的，例如包括电导法、表面张力法、滴体积法、超滤曲线法、单点式超滤法、双点式超滤法、紫外分光光度法、染料吸附法、光散射发法、荧光探针法、溶解度法。
在一个实施方式中，所述胶束的粒径均值小于300nm，优选小于200nm，更优选小于100nm，进一步优选小于80nm。
在一个实施方式中，所述胶束的粒径是通过本领域已知的方法测试得到的，例如包括动态激光散射法、荧光相关光谱法、扫描电子显微镜成像。
本发明还提供上述胶束的制备方法，所述方法包括如下步骤：
将上述侧链修饰的聚氨基酸溶解在溶剂中，使其浓度为1-1000倍临界胶束浓度。
在一个实施方式中，所述浓度为1-1000倍临界胶束浓度，优选地，所述浓度为1-200倍临界胶束浓度，更优选地，所述浓度为1-50倍临界胶束浓度，进一步优选地，所述浓度为1-10倍临界胶束浓度。
在一个实施方式中，所述溶剂例如为水溶液或pH为3-8的缓冲液，例如醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液。
本发明还提供上述胶束在核酸分子的包覆和递送中的用途。
本发明还提供一种递送体系，包括胶束和核酸分子，所述核酸分子位于胶束内部。
在一个实施方式中，所述核酸分子包括RNA和DNA。
在一个实施方式中，所述核酸分子可以为疫苗或药物，即所述核酸分子为RNA疫苗、RNA药物、DNA疫苗。
在一个实施方式中，所述RNA为单链RNA或为双链RNA。
本发明的核酸分子用于治疗或防治传染病、肿瘤、罕见病、以及其他蛋白缺陷类疾病等，或者用于美容及抗衰老等。本发明用于治疗传染病的RNA目标序列是病毒的受体结合区域、病毒的衣壳蛋白或病毒的其他保守区域的蛋白质或蛋白质片段的基因序列。
在一个实施方式中，所述核酸分子与形成胶束的侧链修饰的聚氨基酸的摩尔比为0.001-1000:1，优选0.01-100:1，更优选为0.1-10:1。
在一个实施方式中，所述递送体系可选地包含有佐剂，所述佐剂选自天然磷脂分子、胆固醇、氨基酸、多肽、离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂中的至少一种。
在一个实施方式中，所述佐剂与核酸分子的摩尔比0.001-8000:1，优选0.01-4000:1，更优选为0.1-1000:1。
本发明还提供一种递送体系的制备方法，所述方法包括如下步骤：
将含有所述胶束的溶液与核酸分子接触，孵育混合溶液，制备得到所述的递送体系。
其中，接触过程中使用机械搅拌、振荡、加热回流或超声分散。
本发明还提供一种递送体系的制备方法，所述方法包括如下步骤：
将所述侧链修饰的聚氨基酸与核酸分子混合，形成混合溶液，制备得到所述的递送体系。
本发明还提供一种冻干粉，所述冻干粉通过将上述的递送体系中的溶剂蒸干获得。
在一个实施方式中，所述冻干粉在使用时，重新溶于溶剂中即可形成递送体系。
其中，含有所述胶束的溶液例如可以是含有胶束的有机溶液或者含有胶束的水溶液，所述有机溶液的溶剂没有特别限制，只要其能够溶解所述材料即可，可选地为醇、醚、酮、酯、酰胺、亚砜、烷烃、环烷烃、芳香烃、氯代烷烃其中之一，或其混合。
[术语和解释]
本发明中“侧链修饰的聚氨基酸”、“聚氨基酸”可互换名称。
本发明所述的“脂肪烃”，也可以称为脂肪族化合物，其是指结构中不含有芳香环的烃类，其中碳原子以直链、支链或环状排列，分别称为直链脂肪烃、支链脂肪烃及脂环烃。脂肪族化合物可以是烷烃、烯烃或炔烃。本发明所述脂肪烃的碳原子数可以为1-40个。
本发明所述的烷基代表碳原子数为1-40的直链、支链或环状烷基，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基等。
本发明所述的烯基代表碳原子数为1-40的直链、支链或环状烯基，例如，乙烯、丙烯、异丙烯、丁烯等。优选的，双键的数目为1到6的整数。
本发明所述的炔基代表碳原子数为1-40的直链、支链或环状炔基，例如，乙炔、丙炔、丁炔等。优选的，炔键的数目为1到6的整数。
本发明所述氨基代表基团-N(R2)2，其中，R2独立的选自H、C1-6烷基。
本发明所述的酯基代表基团-CO-OR3，其中，R3为C1-6烷基。
术语“反应性基团”也可称为“活性基团”，是指可与另一个“反应性基团”形成化学键的官能团。适合的化学键在本领域中众所周知，例如可以为：羟基、氨基、羧基、醛基、酮基、酯基、巯基、马来酰亚胺、α-卤代羰基、炔基、烯键、叠氮基、四嗪基。
术语“连接基团”是指将任意两个基团连接起来的基团，其是由两个“反应性基团”进行反应后形成的基团。
术语“间隔基团”是指通过常规反应将反应性基团等引入聚乙二醇链端时可能形成的基团。该基团依赖于引入基团时所使用的试剂。
术语“结合子”是指能够与蛋白质、多肽、氨基酸等生物分子通过例如共价键、非共价键等方式结合的物质。
术语“连接子”也可称为“配体连接子”，英文为Ligand，其是指通过共价连接的方式与蛋白质、氨基酸、抗体、多肽等相连的基团。
术语“核酸”是指脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种用于递送核酸分子的聚氨基酸及其制备方法和用途，所述聚氨基酸为侧链修饰的聚氨基酸，通过在聚氨基酸的侧链中引入亲水性成分和疏水性成分，能够形成聚氨基酸胶束，所述胶束用于高效地递送核酸分子。本发明的所述侧链修饰的聚氨基酸具有如下优势：
（1）细胞胞浆中广泛存在的谷胱甘肽和巯基代谢产物使得胞浆中普遍存在还原性环境。纳米载体被细胞内吞后形成的溶酶体处于典型的还原性环境和低pH值条件下。在聚氨基酸胶束载体的主链构成和侧链修饰两方面综合优化，在侧链上引入在还原性环境中裂解的双硫键，能促进胶束对胞浆中还原性环境和低pH值响应，帮助mRNA疫苗从“溶酶体陷阱”中主动逃离进入胞浆。相较于被动地渗透压主导的逃离过程，纳米载体的主动裂解能更高效地释放mRNA。
（2）主链和侧链结构及其连接方式都可以灵活选取，调节亲水性基团、电荷特性、疏水性基团的数量和种类，使制得的聚氨基酸胶束具有良好生物相容性和靶向递送效率。
（3）聚氨基酸主链的电荷极性为电正性，侧链的反应性基团可以分别为氨基或羟基。通过精氨酸、组氨酸、丝氨酸等其他共聚氨基酸的数量和分布，调节主链电荷分布，实现对负电性RNA的高效、可控包裹。对主链的电荷调节促进胶束的pH值响应，帮助RNA从“溶酶体陷阱”中逃离进入胞浆。
（4）通过量化侧链修饰脂肪链的链长、饱和度和脂肪链数量来控制侧链的疏水性部分，精确调节疏水部分的体积和缔合作用强度，而亲水部分的体积通过选择聚乙二醇高分子链长和分支数量调节，两者协同配合，实现聚氨基酸胶束尺寸和稳定性精确调控。本发明的聚氨基酸胶束的尺寸小，具有很好的组织穿透性。
（5）由于RNA和DNA在结构和负电性上的相似性，通过灵活调整本发明胶束的基础电荷、尺寸和稳定性，高效构建包裹和递送体系，可实现mRNA疫苗、RNA药物和DNA疫苗等核酸类有效成分的高效包裹和递送。
（6）通过功能高分子的侧链修饰引入多个相同的生物功能基团，包括小分子结合子、蛋白质、抗体等靶向结合效应物，利用多价功能化实现递送体系对靶点组织和部位的高效、稳定结合。
（7）通过功能高分子的侧链修饰引入不同的生物功能基团，包括小分子结合子、蛋白质、抗体等靶向结合效应物，通过不同功能基团的复合-协同作用机制，实现递送体系对靶点组织和部位的特异性结合，提高靶向递送效果。
附图说明
图1 实施例12制备的聚氨基酸的临界胶束浓度测定结果。
图2 实施例12制备的聚氨基酸形成的胶束的动态激光散射结果，尺寸分布用对数坐标表示。
图3 实施例16制备的包含mRNA疫苗的聚氨基酸胶束的动态激光散射结果。
图4 实施例19制备的包含mRNA疫苗的聚氨基酸胶束的动态激光散射结果。
图5 多价靶向疫苗H7N9-BT21（A）和单价靶向疫苗H7N9-BT1（B）在上载凯夫萨拉靶向抗体之前和之后的动态激光散射实验结果。
图6 HEK293T白介素6受体稳转细胞的反转录-PCR分析凝胶电泳色谱图。其中，1为加入了多价靶向的H7N9-BT21 mRNA疫苗的细胞，2为加入单价靶向的H7N9-BT1 mRNA疫苗的细胞，3为未加入疫苗的对照组。
图7 实施例12的二元多肽复合生物功能化聚氨基酸mRNA疫苗的氧化-还原条件响应的动态激光散射实验结果。实线和黑方块显示该聚氨基酸mRNA疫苗的粒径分布图，虚线和灰方块为5mM DTT还原环境中的聚氨基酸mRNA疫苗粒径。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的缓冲液为常用的缓冲溶液，包括磷酸盐缓冲溶液、HEPES缓冲液和Tris缓冲液，水为高压釜灭菌处理后的MiliQ去离子水，电导率为18.2欧姆*厘米。
下述实施例中使用的百分数（%）均为摩尔百分数。
任选表示所述特征存在或不存在，还表示所述特征一定存在，只是具体选择可以随意。
实施例1 聚氨基酸PLL-SSMO25-PEG2000-Biotin20的制备
称取10 mg α-聚左旋赖氨酸的氢溴酸盐（PLL的氢溴酸盐，平均分子量22500道尔顿），将其溶于150 µL磷酸盐缓冲液中（pH 7.4）得到溶液（A）。称取20 mg端基修饰生物素和琥珀酰亚胺羧甲基酯的聚乙二醇2000（BIOTIN-PEG2000-SCM，聚乙二醇平均分子量2000道尔顿，购自北京键凯科技股份有限公司），将其溶于150 µL四氢呋喃（分析纯，南京试剂公司）。向得到的溶液中加入3.8 mg琥珀酰亚胺3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯（SPDP，分子量312，赛默飞公司）偶联剂，得到混合物溶液（B）。将溶液（A）与溶液（B）在试管中混合，室温下振荡反应4小时，其后向所得混合溶液加入1.2倍反应当量的正辛硫醇2.5 µL（MO，分析纯，分子量146，密度0.84 g/L，北京百灵威公司）。室温下振荡过夜，加入100 µL Tris缓冲液pH8.0，继续振荡1小时终止反应。去离子水中透析反应溶液24小时（MWCO 50万道尔顿）。所得溶液冷冻处理后置于冻干机中制得19 mg冻干粉。该冻干粉为25%双硫键正辛烷和20%聚乙二醇2000-生物素接枝修饰的功能化聚氨基酸，该聚氨基酸命名为PLL-SSMO25-PEG2000-Biotin20，具体结构式如下所示。
其中，未连接其他成分的聚氨基酸的侧链数用n表示，连接有聚乙二醇的侧链的聚氨基酸的侧链数用p表示，聚乙二醇的重复单元数用q表示，连接有含二硫键疏水性成分的聚氨基酸的侧链数用m表示，即m/（m+n+p）=0.25，p/（m+n+p）=0.2。
实施例2 聚氨基酸PLL-SSMO25-PEG3500-Biotin20的制备
在2毫升离心管中称取10 mg PLL的氢溴酸盐（平均分子量22500道尔顿），将其溶于150 µL磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中得到溶液（A）。称取33 mg端基修饰生物素和琥珀酰亚胺羧甲基酯的聚乙二醇3500（BIOTIN-PEG3500-SCM，聚乙二醇平均分子量3500道尔顿，购自北京键凯科技股份有限公司），将其溶于150 µL四氢呋喃中。向得到的溶液中加入3.8 mg琥珀酰亚胺3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯（SPDP，分子量312，赛默飞公司）偶联剂，得到混合物溶液（B）。将溶液（A）与溶液（B）在试管中混合，室温下振荡反应4小时，其后向所得混合溶液加入1.2倍反应当量的正辛硫醇2.5 µL（MO，分析纯，分子量146，密度0.84 g/L，北京百灵威公司）。按照实施例1的方法制备得到反应产物，冻干处理制得23 mg冻干粉。该白色粉末为25%双硫键正辛烷和20%聚乙二醇3500-生物素接枝修饰的功能化聚氨基酸，该聚氨基酸命名为PLL-SSMO25-PEG3500-Biotin20。
实施例3 聚氨基酸PLL-SSDT25-PEG3500-Biotin20的制备
与实施例2相同，不同之处仅在于使用3.0 µL正癸硫醇（DT，分子量174，SigmaAldrich公司）制得27 mg冻干粉。该白色粉末为25%二硫键正癸烷和20%聚乙二醇3500-生物素接枝修饰的功能化聚氨基酸，该聚氨基酸命名为PLL-SSDT25-PEG3500-Biotin20。
其中，未连接其他成分的聚氨基酸的侧链数用n表示，连接有聚乙二醇的侧链的聚氨基酸的侧链数用p表示，聚乙二醇的重复单元数用q表示，连接有含二硫键疏水性成分的聚氨基酸的侧链数用m表示，即m/（m+n+p）=0.25，p/（m+n+p）=0.2。
实施例4 聚氨基酸PLL-SSMO50-PEG3500-Biotin50的制备
与实施例2相同，不同之处仅在于称取82 mg端基修饰琥珀酰亚胺羧甲基酯和生物素的聚乙二醇3500，将其溶于150 µL四氢呋喃中，加入7.6 mg琥珀酰亚胺3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯偶联剂得到溶液（B）。向（B）中加入5.0 µL正辛硫醇（MO），按照实施例1的方法制得白色冻干粉末，其为50%二硫键正辛烷和50%聚乙二醇3500-生物素接枝修饰的功能化聚氨基酸，命名为PLL-SSMO50-PEG3500-Biotin50。
实施例5 聚氨基酸εPLL-SSMO25-PEG5000- Biotin30的制备
在2毫升离心管中称取10 mg ε-聚左旋赖氨酸的氢溴酸盐（以下称为εPLL的氢溴酸盐，平均分子量50000道尔顿），将其溶于150 µL磷酸盐缓冲液中得到溶液（A）。称取60 mg端基修饰生物素和琥珀酰亚胺羧甲基酯的聚乙二醇5000（BIOTIN-PEG5000-SCM，平均分子量5000道尔顿，购自北京键凯科技股份有限公司），将其溶于150 µL四氢呋喃中。向得到的溶液中加入3.8 mg琥珀酰亚胺3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯（SPDP，分子量312，赛默飞公司）偶联剂，得到混合物溶液（B）。将溶液（A）与溶液（B）在试管中混合，室温下振荡反应4小时，其后向所得混合溶液加入1.2倍反应当量的正辛硫醇2.5 µL（MO，分析纯，分子量146）。室温下振荡过夜，反应8小时，加入100 µL 20 mM Tris缓冲液pH 8.0，继续振荡1小时终止反应。去离子水中透析反应溶液24小时（MWCO 50万道尔顿）。所得溶液冷冻处理后置于冻干机中制得39 mg冻干粉，-20 ℃下密封存放。该白色粉末为25%二硫键正辛烷和30%聚乙二醇5000-生物素接枝修饰的功能化聚氨基酸εPLL-SSMO25-PEG5000-Biotin30，结构式如下。
其中，未连接其他成分的聚氨基酸的侧链数用n表示，连接有聚乙二醇的侧链的聚氨基酸的侧链数用p表示，聚乙二醇的重复单元数用q表示，连接有含二硫键疏水性成分的聚氨基酸的侧链数用m表示，即m/（m+n+p）=0.25，p/（m+n+p）=0.3。
实施例6 聚氨基酸εPLL-SSMO25-PEG5000-N3的制备
称取10 mg εPLL（平均分子量50000道尔顿），将其溶于150 µL磷酸盐缓冲液中得到溶液（A）。称取72 mg端基修饰叠氮盐和琥珀酰亚胺羧甲基酯的聚乙二醇5000（AZIDE-PEG5000-SCM，平均分子量5000道尔顿，购自北京键凯科技股份有限公司），将其溶于150 µL四氢呋喃中。向得到的溶液中加入3.8 mg琥珀酰亚胺3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯（SPDP，分子量312，赛默飞公司）偶联剂，得到混合物溶液（B）。将溶液（A）与溶液（B）在试管中混合，室温下振荡反应4小时，其后向所得混合溶液加入正辛硫醇2.5 µL（MO，分析纯，分子量146）。室温下将反应溶液继续在振荡器中混合。按照实施例5的描述制得产物，冻干制得31 mg冻干粉，-20℃下密封存放。该白色粉末为25%二硫键正辛烷和30%聚乙二醇5000-叠氮盐接枝修饰的聚氨基酸，该聚氨基酸命名为εPLL-SSMO25-PEG5000-N3。
其中，未连接其他成分的聚氨基酸的侧链数用n表示，连接有聚乙二醇的侧链的聚氨基酸的侧链数用p表示，聚乙二醇的重复单元数用q表示，连接有含二硫键疏水性成分的聚氨基酸的侧链数用m表示，即m/（m+n+p）=0.25，p/（m+n+p）=0.3。
实施例7 聚氨基酸PLL-SSDDT25-PEG2000-OMe37的制备
在2毫升离心管中称取10 mg PLL的氢溴酸盐（平均分子量22500道尔顿），将其溶于150 µL 磷酸盐缓冲液中得到溶液（A）。称取36 mg端基修饰甲氧基和琥珀酰亚胺羧甲基酯的聚乙二醇（M-PEG2000-SCM，平均分子量2000道尔顿，购自北京键凯科技股份有限公司），将其溶于150 µL四氢呋喃中。向得到的溶液中加入3.8 mg琥珀酰亚胺3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯（SPDP，分子量312，赛默飞公司）偶联剂，得到混合物溶液（B）。将溶液（A）与溶液（B）在试管中混合，室温下振荡反应4小时，其后向所得混合溶液加入正十二硫醇3.5 µL（DDT，分子量202，SigmaAldrich公司），室温下在试管中将反应溶液继续在振荡器混合过夜。按照与实施例1类似的方法，制得26 mg白色冻干粉末。该白色粉末为25%二硫键正十二烷和37%聚乙二醇2000-甲氧基接枝修饰的聚氨基酸，该聚氨基酸命名为PLL-SSDDT25-PEG2000-OMe37。具体结构式如下所示。
其中，未连接其他成分的聚氨基酸的侧链数用n表示，连接有聚乙二醇的侧链的聚氨基酸的侧链数用p表示，聚乙二醇的重复单元数用q表示，连接有含二硫键疏水性成分的聚氨基酸的侧链数用m表示，即m/（m+n+p）=0.25，p/（m+n+p）=0.37。
实施例8 聚氨基酸PLL-SSDDT25-PEG2000-OMe75的制备
与实施例7相同，不同之处仅在于称取73 mg端基修饰甲氧基和琥珀酰亚胺羧甲基酯的聚乙二醇（M-PEG2000-SCM，平均分子量2000道尔顿，购自北京键凯科技股份有限公司）。制得47 mg白色冻干粉末，其为25%二硫键正十二烷和75%聚乙二醇2000-甲氧基接枝修饰的聚氨基酸，该聚氨基酸命名为PLL-SSDDT25-PEG2000-OMe75。
实施例9 聚氨基酸PLL-SSDT25-PEG2000-OMe37的制备
与实施例7相同，不同之处仅在于使用3.0 µL正癸硫醇（DT，分子量174，SigmaAldrich公司），制得20 mg白色冻干粉末，其为25%二硫键正癸烷和37%聚乙二醇2000-甲氧基接枝修饰的聚氨基酸，该聚氨基酸命名为PLL-SSDT25-PEG2000-OMe37。
实施例10 聚氨基酸PLL-SSMO25-PEG2000-OMe30-PEG2000-BG30的制备
称取96 mg端基修饰为双琥珀酰亚胺羧甲基酯修饰的聚乙二醇（SCM-PEG2000-SCM，PEG平均分子量2000道尔顿，购自北京键凯科技股份有限公司）和 10 mg SNAPTag蛋白的连接子O6-[4-(氨基甲基)苄基]鸟嘌呤（缩称为BG，购自Santa Cruz Biotechnology公司），将其溶于无水200 µL 四氢呋喃，加入4 µL三乙胺，氮气保护室温下反应4小时，加入去离子水30分钟，终止反应。置于真空烘箱中，60°C除去有机溶剂。用G200硅胶层析板分离反应产物，流动相为二氯甲烷：乙酸乙酯（80：20体积比），Rf值0.25处收集产物条带，得到41mg油状物COOH-PEG2000-BG，将其溶于200 µL四氢呋喃，避光保存。
称取7.5 mg聚左旋赖氨酸的氢溴酸盐（PLL的氢溴酸盐，平均分子量22500道尔顿），将其溶于100 µL的5 mM HEPES缓冲溶液（pH 7.4）得到溶液（A）。用玻璃小瓶量称取24mg 两端分别为甲氧基和琥珀酰亚胺酯的聚乙二醇（M-PEG2000-SCM，聚乙二醇平均分子量2000道尔顿，购自北京键凯科技股份有限公司），将其溶于150 µL四氢呋喃中，加入114 µL上述制备的COOH-PEG2000-BG的四氢呋喃溶液，向得到的溶液中加入3.8 mg琥珀酰亚胺3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯（SPDP，分子量312，赛默飞公司）偶联剂，得到混合物溶液（B）。将溶液（A）与溶液（B）在试管中混合，室温下振荡反应4小时，其后向所得混合溶液加入正辛硫醇2.5 µL（MO，分析纯，分子量146，密度0.84 g/L，北京百灵威公司）。室温下在试管中将反应溶液继续在振荡器中振荡过夜，加入100 µL去离子水30分钟终止反应。透析反应溶液24小时（MWCO 50万道尔顿）。冻干处理制得31 mg冻干粉。该冻干粉为25%二硫键正辛烷和30%聚乙二醇2000-甲氧基以及30%聚乙二醇2000-SNAPTag蛋白的配体连接子接枝修饰的聚氨基酸，该聚氨基酸命名为PLL-SSMO25-PEG2000-OMe30-PEG2000-BG30。具体结构式如下所示。
其中，未连接其他成分的聚氨基酸的侧链数用n表示，连接有聚乙二醇-甲氧基的侧链的聚氨基酸的侧链数用p表示，聚乙二醇的重复单元数用q表示，连接有聚乙二醇-BG功能化基团的侧链的聚氨基酸的侧链数用r表示，聚乙二醇的重复单元数用t表示，连接有含二硫键疏水性成分的聚氨基酸的侧链数用m表示，即m/（m+n+p+r）=0.25，p/（m+n+p+r）=0.3，r/（m+n+p+r）=0.3。
实施例11 含有二元多肽复合功能化基团的聚氨基酸PLL-SSMO25-PEG3500-HA15-PEG3500-ALFAtag15的制备
用塑料小瓶量称取7.5 mg聚左旋赖氨酸（PLL，平均分子量22500道尔顿），将其溶于200 µL的HEPES缓冲溶液（100 mM，pH 7.4）得到溶液（A）。另称取42 mg端基修饰分别为马来酰亚胺和琥珀酰亚胺羧甲基酯的聚乙二醇（MAL-PEG3500-SCM，PEG平均分子量2000道尔顿，购自北京键凯科技股份有限公司）和 6.5 mg 氨基酸序列为CYPYDVPDYA的多肽冻干粉（HA-tag，N端为乙酰基修饰，分子量1.3 kDa），以及8.5 mg氨基酸序列为CPSRLEEELRRRLTE的多肽冻干粉（ALFA-tag，N端乙酰基修饰，分子量1.9 kDa）。将其溶于200 µL HEPES缓冲溶液中（5 mM HEPES）调节溶液pH为 6.0，得到溶液（B）。室温下震荡10分钟后，得到端基分别为含有HA多肽和ALFA-tag多肽二元复合功能化基团以及琥珀酰亚胺羧甲基酯的聚乙二醇溶液，将其加入溶液（A）中，室温下振荡4小时。向得到的混合溶液中加入3.8 mg琥珀酰亚胺3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯（SPDP，分子量312，赛默飞公司）偶联剂，室温下振荡反应4小时，其后向所得混合溶液加入正辛硫醇2.5 µL（MO，分析纯，分子量146，密度0.84 g/L，北京百灵威公司）。室温下在试管中将反应溶液继续在振荡器中振荡过夜，加入100 µL去离子水30分钟终止反应。透析反应溶液24小时（MWCO 50万道尔顿）。冻干处理制得37 mg冻干粉。该冻干粉为25%二硫键正辛烷和15%聚乙二醇3500-HA-Tag和15%聚乙二醇3500-ALFA-Tag二元复合功能化接枝修饰的聚氨基酸，该聚氨基酸命名为PLL-SSMO25-PEG3500-HA15-PEG3500-ALFAtag15。
其中，未连接其他成分的聚氨基酸的侧链数用n表示，连接有聚乙二醇-HA-tag的侧链的聚氨基酸的侧链数用p表示，聚乙二醇的重复单元数用q表示，连接有聚乙二醇-AFLA-tag的侧链的聚氨基酸的侧链数用r表示，聚乙二醇的重复单元数用t表示，连接有含二硫键疏水性成分的聚氨基酸的侧链数用m表示，即m/（m+n+p+r）=0.25，p/（m+n+p+r）=0.15，r/（m+n+p+r）=0.15。
实施例12 聚氨基酸胶束的制备和表征
以实施例1制备的聚赖氨酸PLL-SSMO25-PEG2000-Biotin20为例，说明用探针稳态荧光发射法测定聚氨基酸胶束的临界胶束浓度CMC和动态激光散射法测量胶束的水合直径。
将探针芘（Sigma 公司产品，金标签，未经进一步纯化）用无水甲醇溶解，配制成1.0×10-4 mol/L溶液备用。取5 µL芘甲醇溶液，放入一系列5 mL容量瓶中，通氮气将甲醇吹干，依次加入5 mL不同浓度的PLL-SSMO25-PEG2000-Biotin20的水溶液，放入超声浴槽中分散1小时，取1mL样品溶液用于测定芘的荧光发射光谱。荧光光谱用日本日立HITACHI F-4500型荧光分光光度计检测，激发波长为335 nm，狭缝宽度设定为激发波长5 nm，发射波长2.5 nm，检测器偏压为700 V，实验温度22 ± 1 °C。
图1显示芘在不同浓度的PLL-SSMO25-PEG2000-Biotin20水溶液中的荧光发射光谱变化。芘的第一峰（373 nm）与第三峰（384 nm）荧光强度之比（I1/ I3，图1中的A）反应芘分子周围微环境的极性变化。
随着聚氨基酸PLL-SSMO25-PEG2000-Biotin20在水溶液中浓度的提高，该比值依次降低（图1中的B）。当聚氨基酸浓度增大到一定值时曲线发生突变，该处突变表明芘所处环境极性的变化，显示形成PLL-SSMO25-PEG2000-Biotin20胶束。因此，第一处突变点对应于PLL-SSMO25-PEG2000-Biotin20的CMC值。通过该方法测得PLL-SSMO25-PEG2000-Biotin20的临界胶束浓度为2.1 mg/mL。当PLL-SSMO25-PEG2000-Biotin20在水溶液中的浓度大于该值时，即可形成胶束。
配制浓度为3.0 mg/mL PLL-SSMO25-PEG2000-Biotin20水溶液（大于CMC浓度），取1 mL溶液进行动态激光散射实验。使用英国Malvern Instruments 公司的Zetasizer NanoZS ZEN3600测得胶束的水合直径为97 ± 35 nm，结果如图2所示。
实施例13 禽流感病毒H7N9亚型mRNA疫苗的制备
第一步，合成DNA模板。为了制备mRNA疫苗，首先合成DNA序列用于随后的体外转录。选择禽流感病毒A/Shanghai/02/2013(H7N9)聚合酶PB2的基因序列片段作为目标抗原序列（基因序列-1）。目标抗原序列经GC含量优化（优化方法参见Mol. Ther. 23, 1456–1464 （2015）），在其5’端添加非翻译区调控元件（i）5’UTR (β-globin-1)：
CAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC。
在其3’端添加非翻译区调控元件（ii）3’UTR (2β-globin)：
AGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC
该（i）5’UTR中的序列可以抑制5’-核酸外切降解，而（ii）3’UTR中的序列可以抑制mRNA的去甲腺苷酸化，以增强mRNA的稳定性和翻译效率。在3’端进一步添加70个重复腺苷和30个重复的胞嘧啶，形成（iii）Poly-A尾和Poly-C尾，以增强mRNA的稳定性：
TTAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATTCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCTCTAGACAATTGGAATT
将上述所有DNA序列按照5’UTR-目标序列-3’UTR-PolyA-PolyC的组装顺序合成为线性模板，进行下一步的体外转录。
第二步，体外转录。在CAP类似物（m7GpppG）存在下，使用T7聚合酶体外转录制备的DNA模板，制成“加帽”mRNA。随后，使用MEGAclear Transcription Clean-Up Kit（购自赛诺菲公司, Waltham, MA, USA）纯化mRNA。得到的样品可立即用于形成胶束包裹制剂或冻干保存。
实施例14 甲型流感病毒H1N1的mRNA疫苗的制备
第一步，合成DNA模板。使用A/Puerto Rico/8/1934 H1N1流感病毒血凝素HA的基因序列（基因序列-2）作为目标抗原的DNA序列。目标基因序列GC含量经优化后（优化方法参见Mol. Ther. 23, 1456–1464 （2015）），在5’端添加非翻译区调控元件（i）5’UTR (β-globin-2)：
AGAGCGGCCGCTTTTTCAGCAAGATTAAGCCCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC
3’端添加非翻译区调控元件（ii）3’UTR (2β-globin)：
AGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC
进一步添加（iii）含重复腺苷和重复的胞嘧啶序列的Poly-A尾和Poly-C尾：
TTAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATTCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCTCTAGACAATTGGAATT
将上述所有DNA序列按照5’UTR-目标序列-3’UTR-PolyA-PolyC的组装顺序合成为线性模板，进行下一步的体外转录。
第二步，体外转录。在CAP类似物（m7GpppG）存在下，使用T7聚合酶体外转录制备得到的DNA模板，制成“加帽”mRNA。随后，使用MEGAclear Transcription Clean-Up Kit（购自赛诺菲公司, Waltham, MA, USA）纯化mRNA。经上述体外转录、加帽和纯化得到甲型流感病毒H1N1的mRNA疫苗，用于形成胶束包裹制剂或冻干保存。
实施例15 冠状病毒SARS-Cov-2的mRNA疫苗的制备
按照实施例14描述的方法，第一步，合成DNA模板。使用SARS-CoV-2冠状病毒表面刺突蛋白受体结合区域的基因序列（NIH Gene ID: 43740568，基因序列-3）作为目标抗原的DNA序列。目标基因序列经GC含量优化，添加非翻译区调控元件（i）5’UTR (β-globin-2)，（ii）3’UTR (2β-globin)，以及（iii）重复腺苷和胞嘧啶的Poly-A尾和Poly-C尾，合成为线性模板。第二步，所得DNA模板经体外转录、加帽和纯化得到冠状病毒SARS-Cov-2的mRNA疫苗，用于形成胶束包裹制剂或冻干保存。
实施例16 制备包含禽流感病毒mRNA疫苗的聚氨基酸胶束
在10毫升圆底烧瓶中，将10 mg实施例1制备的PLL-SSMO25-PEG2000-Biotin20溶于300微升乙醇中，向该聚氨基酸溶液中迅速加入200微升包含3 mg实施例13制备的禽流感病毒H7N9亚型mRNA疫苗水溶液（水经高压釜处理，确保无活性核酸水解酶，pH值用盐酸调节为4）。其后用针管通氮气吹除溶剂至形成透明薄膜。加入2 mL纯水，在10℃冷室中涡旋振荡15分钟。该体积下PLL-SSMO25-PEG2000-Biotin20的浓度大于临界胶体浓度（见实施例12测得CMC），聚氨基酸和mRNA形成胶束溶液。取200 µL样品在纯水中稀释5倍，溶液进行动态激光散射实验（方法参见实施例12），测得胶束的水合直径为161 ± 37 nm，结果如图3所示。将溶液等分为100 µL样品，每份样品含有30 µg mRNA疫苗，4℃冰箱或者液氮急冻保存。
实施例17 制备包含冠状病毒mRNA疫苗的聚氨基酸胶束
按照实施例16的描述，制备包含mRNA疫苗的聚氨基酸胶束，不同在于向该聚氨基酸溶液中迅速加入200微升包含2 mg实施例15制备的冠状病毒SARS-Cov-2的mRNA疫苗水溶液，该mRNA疫苗包含的目标蛋白序列为表面刺突蛋白受体结合区域。
实施例18 制备包含禽流感病毒mRNA疫苗的生物功能化聚氨基酸纳米材料
按照实施例16的方法制备2毫升包含mRNA疫苗的聚氨基酸胶束，向该样品溶液中加入100微摩尔（µM）的链霉素磷酸盐缓冲液，直至链霉素的最终浓度为100 纳摩尔（nM）。将得到的样品溶液转移至截止分子量为1百万道尔顿的半透膜中，在1升pH值6的磷酸盐缓冲液中（高压釜灭菌处理）进行透析24小时。透析后的溶液中再加入10 mg重组人血清白蛋白（hSA），所得混合溶液冷冻处理后置于冻干机中制得冻干粉。-20 ℃下密封存放。该冻干粉样品为链霉素功能化的含mRNA疫苗的聚氨基酸纳米材料。
该纳米材料冻干粉可以复溶于纯水中，用于与生物素修饰的小分子配体和抗体蛋白结合（如PD-L1抗体、T细胞受体抗体、白介素6受体抗体凯夫萨拉（sarilumab）等），提高对于目标细胞和组织的靶向递送。
实施例19 制备包含甲型流感病毒mRNA疫苗的聚氨基酸-佐剂混合物
在10毫升圆底烧瓶中，将10 mg实施例1制备的PLL-SSMO25-PEG2000-Biotin20和作为佐剂的0.5 mg胆固醇、3 mg卵磷脂共同溶于300 µL乙醇中，向该聚氨基酸溶液中迅速加入200 µL包含3 mg实施例14制备的甲型流感病毒mRNA水溶液（水经高压釜处理，确保无活性核酸水解酶，pH值用盐酸调节为4）。其后用针管通氮气吹除溶剂至形成透明薄膜。加入2 mL纯水，在10℃冷室中涡旋振荡15分钟。该体积下PLL-SSMO25-PEG2000-Biotin20的浓度大于临界胶体浓度（见实施例12测得CMC），聚氨基酸和mRNA形成胶束溶液。取200 µL样品在纯水中稀释5倍，溶液进行动态激光散射实验，测得胶束的水合直径为187 ± 45 nm，结果如图4所示。将溶液等分为100 µL样品，每份样品含有60 µg mRNA，存储于4℃冰箱保存或液氮急冻保存。
实施例20 制备含甲型流感病毒mRNA疫苗的聚氨基酸-佐剂混合物纳米材料
按照实施例19的方法制备2 mL包含mRNA疫苗的的聚氨基酸-佐剂混合物，向该样品溶液中加入100 µM（微摩尔）的链霉素磷酸盐缓冲液，直至链霉素的最终浓度为100 nM（纳摩尔）。按照实施例18的方法透析和冻干，制得冻干粉，在-20 ℃下密封存放。该冻干粉样品为链霉素功能化的含mRNA疫苗的聚氨基酸-佐剂混合物纳米材料。使用时将纳米材料复溶于纯水中，与生物素修饰的小分子配体和抗体蛋白结合（如PD-L1抗体、T细胞受体抗体等），提高对于目标细胞和组织的靶向递送。
实施例21 上载多价凯夫萨拉靶向抗体的含禽流感病毒mRNA疫苗的聚氨基酸纳米颗粒
将实施例18中制备得到的链霉素功能化的含禽流感病毒H7N9亚型mRNA疫苗的聚氨基酸纳米材料冻干粉复溶于纯水中，与生物素修饰的白介素6受体抗体凯夫萨拉（sarilumab）混合，得到含mRNA疫苗的上载多价凯夫萨拉靶向抗体的聚氨基酸纳米颗粒。
本实施例使用的是实施例1制备的20%侧链修饰有端基生物素-聚乙二醇的聚氨基酸，根据聚左旋赖氨酸的平均分子量（22.5kDa）和20%的生物素侧链接枝的修饰比例可知，本实施例得到的含有mRNA疫苗的聚氨基酸纳米颗粒为单个颗粒具有平均21个生物素/链霉素/凯夫萨拉的多价靶向递送体系。将该含有mRNA疫苗的聚氨基酸纳米颗粒命名为H7N9-BT21 mRNA疫苗。动态激光散射实验测得该含mRNA疫苗的聚氨基酸纳米颗粒在上载凯夫萨拉靶向抗体之前和之后的水合直径变化，如图5中的A所示。结果显示粒径的峰值分别是140nm（之前）和180nm（之后），亦即，上载靶向抗体后平均粒径增大了40nm。
作为单价靶向mRNA疫苗的对照实验，本实施例使用实施例8的聚氨基酸PLL-SSDDT25-PEG2000-OMe75，制备了包含实施例13制备的禽流感病毒H7N9亚型mRNA疫苗的双亲聚氨基酸胶束纳米颗粒。实施例8的聚氨基酸侧链PLL-SSDDT25-PEG2000-OMe75不含有生物素功能基团，不具备上载多价靶向抗体的能力。用偶联剂1-乙基-3-（- 3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），仅能够将生物素分子的羧基与聚氨基酸PLL-SSDDT25-PEG2000-OMe75分子主链N端的胺基反应。随后按照上面所述的方法，制备含有mRNA疫苗的上载单价凯夫萨拉靶向抗体的聚氨基酸纳米颗粒。基于主链N端修饰的结构特征，所得到的含有mRNA疫苗的聚氨基酸纳米颗粒为单个颗粒平均具有单个生物素/链霉素/凯夫萨拉的单价递送体系。动态激光散射实验测得该含有mRNA疫苗的聚氨基酸纳米颗粒在上载凯夫萨拉靶向抗体之前和之后的水合直径没有变化（130nm，如图5中的B所示）。将其命名为H7N9-BT1 mRNA疫苗。对比图5中的A，该结果清楚地说明单价靶向的H7N9-BT1 mRNA疫苗在抗体上载效率上明显少于多价靶向的疫苗。
实施例22 多价靶向疫苗的效果
为了验证多价靶向疫苗的效果，本实施例用实施例21制备的多价和单价靶向的含禽流感病毒H7N9mRNA疫苗的聚氨基酸纳米颗粒对HEK293T的白介素6受体稳转细胞系进行转染，对转染效果进行反转录-PCR量化。实验过程和结果如下（参见图6）。
HEK293T的白介素6受体稳转细胞在37°C、5%CO2条件下130rpm悬浮培养。将活度大于95%的细胞稀释至1.0×106cell/mL，接种于六孔板中，每孔1.6×105个细胞，培养基为MEM+10FBS，置于37°C、5%CO2细胞培养箱中培养过夜。将2mg H7N9-BT21 mRNA疫苗冻干粉复溶于200µL MEM+10FBS培养液，分别取100µL加入到两个培养孔中，细胞继续培养过夜。类似地，将2mg H7N9-BT1 mRNA疫苗分别加入到两个培养孔中，细胞继续培养过夜。取出六孔板，胰蛋白酶处理，离心收集所有细胞。将加入H7N9-BT21 mRNA疫苗的细胞收集为一组，标明为1。将加入H7N9-BT1 mRNA疫苗的细胞收集为一组，标明为2。未加入疫苗的组标为3。对1、2和3组细胞中分别进行反转录-PCR分析，量化细胞经单价和多价靶向苗转染后目标mRNA的含量。使用Qiagen反转录-PCR试剂盒Oligotex mRNA Mini Kit并按照说明书操作，其中上游引物序列为atacatcaggaagacaggagaaga，下游引物为tcaatgcacctgcatcctttccaagc，目标mRNA长度~2000 bp。凝胶电泳实验结果如图6所示。第1组细胞样品在2000 bp位置上出现明显的条带。该结果说明加入H7N9-BT21 mRNA疫苗的细胞中目标mRNA获得了高效表达，证明多价靶向H7N9-BT21 mRNA能够高效转染HEK293T白介素6受体稳转细胞系。加入单价H7N9-BT1 mRNA疫苗的细胞中目标mRNA表达量与未经转染的对照组一样，没有可检出的目标mRNA条带。可见，单价靶向H7N9-BT1 mRNA转染HEK293T的白介素6受体稳转细胞系远不如多价靶向的H7N9-BT21 mRNA疫苗。
实施例23 二元多肽复合生物功能化聚氨基酸mRNA疫苗的氧化-还原条件响应
将10 mg实施例11制备的PLL-SSMO25-PEG3500-HA15-PEG3500-ALFAtag15溶于300µL乙醇中，向该二元多肽复合生物功能化聚氨基酸溶液中迅速加入200 µL包含3 mg实施例14制备的甲型流感病毒H1N1的mRNA序列水溶液（水经高压釜处理，确保无活性核酸水解酶，pH值用盐酸调节为4）。其后用针管通氮气吹除溶剂至形成透明薄膜。加入2 mL纯水，在10℃冷室中涡旋振荡15分钟，使得PLL-SSMO25-PEG3500-HA15-PEG3500-ALFAtag15聚氨基酸和mRNA形成胶束溶液。取200 µL样品在纯水中稀释5倍，溶液进行动态激光散射实验，测得胶束的水合直径为195 ± 45 nm，结果如图7所示（实线+黑方块）。
为观察二元多肽复合生物功能化聚氨基酸mRNA疫苗的氧化-还原条件响应，另称取200 µL该样品，加入500mM二硫苏糖醇（DTT）的磷酸盐缓冲液，使得样品溶液中DTT的终浓度为5mM，室温下温育60分钟。将样品用纯水稀释至1mL，对该溶液进行动态激光散射实验，测得在DTT还原环境下胶束的水合直径为95 ± 65 nm，结果如图7中（虚线+灰方块）所示。增大的分布宽度和粒径峰向小粒径移动100nm，说明还原条件使得聚氨基酸中的二硫键裂解，导致完整的胶束结构被破坏，有益于mRNA疫苗的释放。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津力博生物科技有限公司
<120> 一种用于mRNA疫苗靶向递送的聚氨基酸及其制备方法和用途
<141> 2021-10-01
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagggcagag ccatctattg cttacatttg cttctgacac aactgtgttc actagcaacc 60
tcaaacagac acc 73
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<212> DNA
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agctcgcttt cttgctgtcc aatttctatt aaaggttcct ttgttcccta agtccaacta 60
ctaaactggg ggatattatg aagggccttg agcatctgga ttctgcctaa taaaaaacat 120
ttattttcat tgcagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc 180
ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc 240
taataaaaaa catttatttt cattgc 266
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tcaatgcacc tgcatccttt ccaagc 26