制备抗体的方法
阅读说明：本技术 制备抗体的方法 (Method for producing antibody ) 是由 K·K·乔希 P·J·卡特 尹一媛 于 2020-05-07 设计创作，主要内容包括：本发明尤其提供了改进抗体(例如双特异性抗体)的重链和轻链的配对的方法。还提供了使用此类方法产生的抗体(例如双特异性抗体)、文库和筛选此类文库的方法。(The invention provides, inter alia, methods for improving the pairing of heavy and light chains of an antibody (e.g., a bispecific antibody). Antibodies (e.g., bispecific antibodies) produced using such methods, libraries, and methods of screening such libraries are also provided.)
相关申请的交叉引用
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背景技术
开发双特异性抗体作为人类疾病的治疗剂具有巨大的临床潜力。然而，生产IgG形式的双特异性抗体具有挑战性，因为抗体重链已经进化为以相对杂乱的方式结合抗体轻链。作为这种杂乱配对的结果，两条抗体重链和两条抗体轻链在单个细胞中的同时表达自然导致例如重链同源二聚化和重链/轻链配对的混乱。
一种规避重链同源二聚化问题的方法，称为“杵臼技术(knobs-into-holes)”，旨在通过在CH3结构域引入突变来修饰接触界面，从而迫使两种不同的抗体重链配对。在一条重链上，原来的氨基酸被具有短侧链的氨基酸所取代，以形成“臼(hole)”。相反，具有大侧链的氨基酸被引入另一个CH3结构域，以形成“杵(knob)”。通过共同表达这两条重链(和两条相同的轻链，必须适用于这两条重链)，观察到异源二聚体形成(“杵-臼”)与同源二聚体形成(“臼-臼”或“杵-杵”)相比的高发生率(Ridgway,J.B.,Protein Eng.9(1996)617-621；Merchant et al.“An efficient route to human bispecific IgG.”NatBiotechnol.1998；16:677 81；Jackman et al.“Development of a two-part strategyto identify a therapeutic human bispecific antibody that inhibits IgEreceptor signaling.”J Biol Chem.2010；285:20850 9；和WO 96/027011)。
由于抗体Fab内复杂的多结构域异源二聚体相互作用，使重链/轻链的混乱的最小化变得更加困难。旨在解决重链/轻链混乱的双特异性抗体形式包括：DVD-Ig(双可变结构域Ig)(Nature Biotechnology 25,1290-1297(2007))；交叉Ig(Schaefer W et al(2011)PNAS 108(27):11187-11192)；二合一Ig(Two-in-One Ig)(Science 2009,323,1610)；抗体(PNAS 92(15):7021-7025；1995)和Lewis et al.(2014)“Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design ofan orthogonal Fab interface.”Nat Biotechnol 32,191-8；Liu et al.(2015)“A NovelAntibody Engineering Strategy for Making Monovalent Bispecific HeterodimericIgG Antibodies by Electrostatic Steering Mechanism.”J Biol Chem.Publishedonline January 12,2015,doi:10.1074/jbc.M114.620260；Mazor et al.2015.“Improving target cell specificity using a novel monovalent bispecific IgGdesign.”Mabs.Published online January 26,2015,doi:10.1080/19420862.2015.1007816；WO 2014/081955、WO 2014/082179和WO 2014/150973所述的策略。
然而，本领域仍然需要减少错误配对的重链/轻链副产物和增加正确组装的双特异性抗体的产率的方法。
发明内容
本文提供了一种改进抗体的重链和轻链的优先配对的方法，该方法包括将轻链可变结构域(VL)的94位处或VL的96位处的至少一个氨基酸从不带电荷的残基取代为带电荷的残基的步骤，带电荷的残基选自由以下项组成的组：天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，该方法包括将94位处和96位处的氨基酸中的每一者从不带电荷的残基被取代成带电荷的残基的步骤。在一些实施例中，94位处的氨基酸被D取代。在一些实施例中，96位处的氨基酸被R取代。在一些实施例中，94位处的氨基酸被D取代，并且96位处的氨基酸被R取代。在一些实施例中，重链可变结构域(VH)的95位处的氨基酸从不带电荷的残基被取代成带电荷的残基，所述带电荷的残基选自由以下项组成的组的：天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，VL的94位处的氨基酸被D取代，VL的96位处的氨基酸被R取代，并且VH的95位处的氨基酸被D取代。
在一些实施例中，本文提供的方法进一步包括使抗体(例如，已被修饰以改善重链和轻链的优先配对的抗体)经历至少一个亲和力成熟(affinity maturation)步骤，其中VL的94位处的取代氨基酸不是随机的。另外地或可替代地，在一些实施例中，VL的96位处的取代氨基酸不是随机的。另外地或可替代地，在一些实施例中，VH的95位处的取代氨基酸不是随机的。
在一些实施例中，抗体为选自由以下所组成的组的抗体片段：Fab、Fab’、F(ab’)2、单臂抗体和scFv或Fv。在一些实施例中，抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施例中，抗体包含人IgG Fc区。在一些实施例中，人IgG Fc区为人IgG1 Fc区、人IgG2 Fc区、人IgG3 Fc区或人IgG4 Fc区。在一些实施例中，抗体为单特异性抗体。在一些实施例中，抗体为多特异性抗体。
在一些实施例中，多特异性抗体为双特异性抗体。在一些实施例中，双特异性抗体包括第一CH2结构域(CH21)、第一CH3结构域(CH31)、第二CH2结构域(CH22)和第二CH3结构域；其中CH32被改变，使得在CH31/CH32界面内，一个或多个氨基酸残基被一个或多个具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在CH32的表面上产生与CH31相互作用的突起，且其中CH31被改变，使得在CH31/CH32界面内，一个或多个氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在CH31的表面上产生与CH32相互作用的空腔。在一些实施例中，双特异性抗体包括第一CH2结构域(CH21)、第一CH3结构域(CH31)、第二CH2结构域(CH22)和第二CH3结构域；其中CH31被改变，使得在CH31/CH32界面内，一个或多个氨基酸残基被一个或多个具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在CH31的表面上产生与CH32相互作用的突起，且其中CH32被改变，使得在CH31/CH32界面内，一个或多个氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在CH32的表面上产生与CH31相互作用的空腔。在一些实施例中，突起是杵突变(knobmutation)。在一些实施例中，杵突变包括T366W，其中氨基酸编号是根据EU索引。在一些实施例中，空腔是臼突变(hole mutation)。在一些实施例中，臼突变包括T366S、L368A和Y407V中的至少一个、至少两个或全部三个，其中氨基酸编号是根据EU索引。
还提供了通过本文所述方法中的任何一种(或组合)产生的抗体。
附图说明
图1A和1B提供了抗LGR5/抗IL4双特异性抗体的高分辨率液相色谱质谱(LCMS)数据，即低产率BsIgG的代表性实例。图1A显示了电荷状态38+和39+的质量包络。图1B显示了相应的去卷积数据。
图1C和1D提供了抗SIRPα/抗IL4双特异性抗体的高分辨率LCMS数据，即中间产率BsIgG的代表性实例。图1C显示了电荷状态38+和39+的质量包络图。图1D显示了相应的去卷积数据。
图1E和1F提供了抗Met/抗DR5双特异性抗体的高分辨率LCMS数据，即高产率BsIgG的代表性实例。图1E显示了电荷状态38+和39+的质量包络图。图1F显示了相应的去卷积数据。
图2提供了实验的结果，这些实验是为了确定掺入CH1/CL电荷对取代突变是否会增加显示出强烈内在HC/LC配对偏好的BsIgG的产率。
图3说明了为研究抗EGFR/抗MET BsIgG和抗-IL-4/抗-IL-13 BsIgG中优先HC/LC配对的机制基础而进行的实验设计。该实验的结果在表C中提供。
图4A提供了抗MET抗体onartuzumab(参见Merchant et al.(2013)PNAS USA 110:E2987-2996)(SEQ ID NO:1)和抗EGFR抗体D1.5(参见Schaefer et al.(2011)Cancer Cell20:472-486)(SEQ ID NO:2)的轻链可变结构域(VL)的比对。氨基酸残基是根据Kabat编号。来自Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest.Bethesda,MD:NIH,1991的序列定义的CDR以及Chothia和Lesk(1987)J Mol Biol 196:901-917的结构定义用阴影表示。
图4B提供了抗MET抗体onartuzumab(SEQ ID NO:3)和抗EGFR抗体D1.5(SEQ IDNO:4)的重链可变结构域(VH)的比对。氨基酸残基是根据Kabat编号。来自Kabat etal.Sequences of Proteins of Immunological Interest.Bethesda,MD:NIH,1991的序列定义的CDR以及Chothia和Lesk(1987)J Mol Biol 196:901-917的结构定义用阴影表示。
图5A提供了为评估抗-EGFR/抗MET双特异性抗体的抗EGFR臂的互补决定区(CDR)L3和CDR H3对BsIgG产率的贡献而进行的实验的结果。还提供了为评估抗-EGFR/抗MET双特异性抗体的抗MET臂的CDR L3和CDR H3对BsIgG产率的贡献而进行的实验的结果。
图5B提供了为评估抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体的抗IL-4臂的CDR L3和CDR H3对BsIgG产率的贡献而进行的实验的结果。还提供了为评估抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体的抗IL-13臂的CDR L3和CDR H3对BsIgG产率的贡献而进行的实验的结果。
图6提供了为评估CDR-L1+CDR-H1、CDR-L2+CDR-H2和CDR-L3+CDR-H3对抗EGFR/抗MET双特异性抗体的BsIgG产率的贡献而进行的实验的结果。
图7提供了抗MET Fab(PDB 4K3J)的X射线结构，其突出了CDR L3和CDR H3接触残基。
图8A提供了抗IL-13抗体lebrikizumab(参见Ultsch et al.(2013)J Mol Biol425:1330-1339)(SEQ ID NO:5)和抗-IL-4抗体19C11(参见Spiess et al.(2013)J BiolChem 288:265:83-93)(SEQ ID No:6)的轻链可变结构域(VL)的比对。来自Kabat的序列定义以及Chothia和Lesk的结构定义的CDR用阴影表示。
图8B提供了抗IL-13抗体lebrikizumab(SEQ ID NO:7)和抗-IL-4抗体19C11(SEQID NO:8)的重链可变结构域(VH)的比对。氨基酸残基是根据Kabat编号。来自Kabat的序列定义以及Chothia和Lesk的结构定义的CDR用阴影表示。
图9提供了抗IL-13Fab(PDB 4I77)的X射线结构，其突出了CDR L3和CDR H3接触残基。
图10A提供了实验结果，这些实验是为了评估以下项对BsIgG产率的效应而进行：(a)将抗CD3/抗HER2双特异性抗体的抗CD3臂的CDR L3和CDR H3替换为抗MET的CDR L3和CDR H3；(b)将抗CD3/抗HER2双特异性抗体的抗-HER2臂的CDR L3和CDR H3替换为抗-MET的CDR L3和CDR H3；(c)将抗CD3/抗HER2双特异性抗体的抗CD3臂的CDR L3和CDR H3替换为抗IL-13的CDR L3和CDR H3；以及(d)将抗CD3/抗HER2双特异性抗体的抗HER2臂的CDR L3和CDR H3替换为抗IL-13的CDR L3和CDR H3。
图10B提供了实验结果，这些实验是为了评估以下项对BsIgG产率的效应而进行：(a)将抗VEGFA/抗ANG2双特异性抗体的抗VEGFA臂的CDR L3和CDR H3替换为抗MET的CDR L3和CDR H3；(b)将抗VEGFA/抗ANG2双特异性抗体的抗-ANG2臂的CDR L3和CDR H3替换为抗-MET的CDR L3和CDR H3；(c)将抗VEGFA/抗ANG2双特异性抗体的抗VEGFA臂的CDR L3和CDRH3替换为抗IL-13的CDR L3和CDR H3；以及(d)将抗VEGFA/抗ANG2双特异性抗体的抗ANG2臂的CDR L3和CDR H3替换为抗IL-13的CDR L3和CDR H3。
图11提供了为评估链间二硫键对以下双特异性抗体的BsIgG产率的贡献而进行的实验的结果：(1)抗HER2/抗CD3；(2)抗VEGFA/抗VEGFC；(3)抗EGFR/抗MET；以及(4)抗IL13/抗IL-4。
具体实施方式
双特异性抗体是很有前途的一类治疗剂，因为它们具有双重特异性，例如，将有效载荷递送至靶点，同时阻断两个信号通路，将免疫细胞递送至肿瘤细胞等。然而，双特异性抗体(例如，双特异性IgG，或“BsIgG”)的生产仍然是一个技术挑战，因为两个抗体重链和两个抗体轻链在一个细胞中的共同表达可能自然导致，例如，重链同源化和重链/轻链配对的混乱。本文所述的方法基于申请人的发现，即优先的抗体重链/抗体轻链会受到CDR-H3和CDR-L3中特定氨基酸位置残基的强烈影响。此外，申请人发现在许多情况下，将这些残基转移到其他无关抗体中的相应氨基酸位置增加了正确组装的BsIgG的产率。
除非本文另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。Singleton,et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND MOLECULAR BIOLOGY,2D Ed.,John Wiley and Sons,New York(1994),and Hale&Margham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)提供了一个本发明中使用的许多术语的通用词典。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是描述了优选的方法和材料。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则核酸以5’至3’方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左至右书写。对于本领域的定义和术语，从业者特别针对Sambrook et al.,1989,和Ausubel FM et al.,1993。应理解，本发明并不限于所述的特定方法、方案和试剂，因为这些是可变的。
数字范围包括定义范围的数字。
除非另有说明，否则核酸以5’至3’方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左至右书写。
本文提供的标题不是对各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过参考整个说明书来获得。因此，通过参考整个说明书，下面定义的术语被更全面地定义。
定义
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且是指包含两条重链和两条轻链的任何免疫球蛋白(Ig)分子，以及其任何片段、突变体、变体或衍生物，只要它们表现出所需的生物活性(例如，表位结合活性)。抗体的实例包括本文所述的单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段。抗体可为小鼠抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体和/或亲和力成熟抗体。
作为参照系，如本文所用的免疫球蛋白指的是免疫球蛋白G(IgG)的结构。然而，本领域技术人员会理解/认识到，任何免疫球蛋白类别的抗体都可用于本文所述的本发明方法中。为了清楚起见，IgG分子包含一对重链(HC)和一对轻链(LC)。每个LC有一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)，而每个HC有一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。CH1和CH2结构域通过铰链区连接。这种结构是本领域公知的。
简而言之，基本的4链抗体单元为异四聚体糖蛋白，由两条轻(L)链和两条重(H)链组成(IgM抗体由5个基本异四聚体单元以及一条称为J链的额外多肽组成，因此包含10个抗原结合位点，而分泌IgA抗体可聚合以形成包含2-5个基本4-链单元以及J链的多价组合体)。在IgG情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键连接至H链，而两条H链则根据H链的同种型通过一个或多个二硫键相互连接。每条H链和L链还具有规则间隔的链内二硫键。每条H链在N末端具有可变结构域(VH)，随后具有三个恒定结构域(CH)(对于每条α链和γ链)和四个CH结构域(对于μ和ε同种型)。每条L链在N末端具有可变结构域(VL)，随后在其另一端具有恒定结构域(CL)。VL与VH对准，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对准。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单一抗原结合位点。有关不同类别抗体的结构和特性，参见例如：《基础和临床免疫学》(Basic and Clinical Immunology)，第8版，Daniel P.Stites,Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(主编)，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994年，第71页和第6章。
来源于任何脊椎动物的L链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以配属为两种明显不同的类型中的一种，这两种类型分别称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。免疫球蛋白基于其重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列，可以配属为不同的类别或同种型。存在以下五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM具有分别称为α、δ、γ、ε和μ的重链。γ和α类别基于CH序列和功能的相对较小的差异进一步分为子类，例如，人表达以下子类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“CL结构域”包含免疫球蛋白轻链的恒定区结构域，其例如从约Kabat位置107A-216(EU位置108-214(κ))延伸。Kappa C结构域的Eu/Kabat转换表可在www(dot)imgt(dot)org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGKCnber.html在线获得，Lambda C结构域的Eu/Kabat转换表可在www(dot)imgt(dot)org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGLCnber.html在线获得。CL结构域与VL结构域相邻，并且包括免疫球蛋白轻链的羧基末端。
如本文所用，术语人IgG的“CH1结构域”包含免疫球蛋白重链的第一(大多数氨基末端)恒定区结构域，其从例如Kabat编号系统中的约114-223位(EU位置118-215)延伸。CH1结构域与免疫球蛋白重链分子的VH结构域和铰链区的氨基末端相邻，不形成免疫球蛋白重链的Fc区的一部分，并且能够与免疫球蛋白轻链恒定结构域(即“CL”)二聚化。IgG1重链的EU/Kabat转换表可在www(dot)imgt(dot)org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html在线获得。
根据EU编号系统，人IgG Fc区的术语“CH2结构域”通常包含IgG的约231至约340位残基。CH2结构域的独特之处在于它与另一个结构域不紧密配对。相反，两个N连接的分支碳水化合物链插入在完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，碳水化合物可提供结构域-结构域配对的取代，并有助于稳定CH2结构域。Burton,Mol.lmmunol.22:161-206(1985).
术语“CH3结构域”包括Fc区CH2结构域的C端残基(即根据EU编号系统，从IgG的约氨基酸残基341到约氨基酸残基447)。
如本文所用，术语“Fc区”通常是指包含免疫球蛋白重链的C-末端多肽序列的二聚体复合物，其中C末端多肽序列是可通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化获得的。Fc区可以包含天然或变体的Fc序列。尽管免疫球蛋白重链的Fc序列的边界可能不同，但人IgG重链Fc序列包含约Cys226位，或从约Pro230位到Fc序列的羧基末端。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat etal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。免疫球蛋白的Fc序列通常包含两个恒定结构域，CH2结构域和CH3结构域，并且任选包含CH4结构域。本文中的“Fc多肽”是指组成Fc区的多肽之一，例如单体Fc。Fc多肽可以从任何合适的免疫球蛋白获得，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc多肽可以从小鼠获得，例如小鼠IgG2a。Fc区包含通过二硫化物连接在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列决定，该区也是由某些类型的细胞上存在的Fc受体(FcR)识别的部分。在一些实施例中，Fc多肽包含部分或全部野生型铰链序列(通常在其N末端)。在一些实施例中，Fc多肽不包含功能性或野生型铰链序列。
本文所用的“Fc组分”是指Fc区的铰链区、CH2结构域或CH3结构域。
在某些实施例中，Fc区包含IgG Fc区，优选衍生自野生型人IgG Fc区。在某些实施例中，Fc区衍生自“野生型”小鼠IgG，例如小鼠IgG2a。“野生型”人IgG Fc或“野生型”小鼠IgG Fc是指分别在人类群体或小鼠群体内天然存在的氨基酸序列。当然，正如个体之间的Fc序列可能略有不同，可对野生型序列进行一个或多个改变，并且仍然在本发明的范围内。例如，Fc区可能包含改变，例如糖基化位点的突变或包含非天然氨基酸。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt et al.KubyImmunology,61st ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007).)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson et al.,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。
通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；以及
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另有说明，否则CDR根据Kabat等人所述的方法(同上)确定。本领域的技术人员将理解，也可以根据Chothia(同上)、McCallum(同上)所述的方法或任何其他在科学上接受的命名系统来确定CDR名称。
“框架”或“FR”是指除互补决定区(CDR)之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4。
如本文所用，短语“抗原结合臂”、“靶分子结合臂”、“靶结合臂”及其变体是指具有特异性结合目标靶标能力的抗体(例如双特异性抗体)的组成部分。通常且优选地，抗原结合臂是免疫球蛋白多肽序列的复合物，例如免疫球蛋白轻链和重链的CDR和/或可变结构域序列。
“靶标”或“靶分子”是指被抗体(例如双特异性抗体)的结合臂识别的部分。例如，如果抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，则取决于背景情况，靶标可以是单个分子或不同分子、或病原体或肿瘤细胞上的表位。本领域技术人员将理解，靶标由靶标结合臂的结合特异性决定，并且不同的靶标结合臂可以识别不同的靶标。靶标优选以高于1μMKd的亲和力结合抗体(例如，双特异性抗体)(根据本领域已知的方法，包括本文所述的方法)。靶分子的实例包括但不限于血清可溶性蛋白和/或其受体，例如细胞因子和/或细胞因子受体、粘附素、生长因子和/或其受体、激素、病毒颗粒(例如RSV F蛋白、CMV、Staph A、流感、丙型肝炎病毒)、微生物(例如细菌细胞蛋白、真菌细胞)、粘附素、CD蛋白及其受体。
如本文所用，术语“界面”是指由第一抗体结构域中的一个或多个氨基酸与第二抗体结构域的一个或多个氨基酸相互作用产生的缔合表面。示例性界面包括例如CH1/CL、VH/VL和CH3/CH3。在一些实施例中，界面包括例如氢键、静电相互作用或形成界面的氨基酸之间的盐桥。
“完整”或“全长”抗体的一个实例是包含抗原结合臂以及CL和至少重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。
如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”是指不缀合至异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于药物组合物中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N端至C端，每条重链均具有可变结构域(VH)，亦称为可变重链结构域或重链可变区，随后为三个恒定重链结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链均具有可变结构域(VL)，亦称为可变轻链结构域或轻链可变区，随后为恒定轻链(CL)结构域。
“单特异性”是指抗体只结合一个表位的能力。“双特异性”是指抗体结合两个不同表位的能力。“多特异性”是指抗体结合多个表位的能力。在某些实施例中，多特异性抗体包括双特异性抗体。对于双特异性和多特异性抗体，表位可在同一抗原上，或者每个表位可在不同的抗原上。在某些实施例中，双特异性抗体结合两种不同的抗原。在某些实施例中，双特异性抗体结合一种抗原上的两个不同表位。在某些实施例中，多特异性抗体(例如双特异性抗体)与每个表位结合的解离常数(Kd)约为≤1μM、约≤100nM、约≤10nM、约≤1nM、约≤0.1nM、约≤0.01nM或约≤0.001nM(例如，约10-8M或更少，例如，从约10-8M到约10-13M，例如，从约10-9M到约10-13M)
本文中的术语“多特异性抗体”在最广义上是指能够结合两个或多个抗原的抗体。在某些方面，多特异性抗体指双特异性抗体，例如人双特异性抗体、人源化双特异性抗体、嵌合双特异性抗体或小鼠双特异性抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的VH和VL。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、ScFv和Fv片段；单臂抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体可以是“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体的相应序列相同或同源，以及这种抗体的片段，只要它们表现出所需的生物活性(美国专利第4,816,567号；以及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文的目标嵌合抗体包括包含衍生自非人类灵长类动物(例如，旧大陆猴，猿等)的可变结构域抗原结合序列和人类恒定区序列的灵长类抗体。
“人源化”形式的非人类(例如，啮齿类)抗体为包含衍生自非人类抗体的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区中的残基被来自非人类物种(供体抗体)的高变区的残基取代，所述非人类物种诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物，其具有所需的抗体特异性、亲和力和功能。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人类残基取代。此外，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中未发现的残基。这些修饰旨在进一步完善抗体性能。总体上，人源化抗体将基本上包含所有中的至少一个可变结构域，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有的FR为人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体还任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，该免疫球蛋白通常为人免疫球蛋白。更多详情参见Jones et al.,《自然》(Nature)321:522-525(1986)；Riechmann et al.,《自然》(Nature)332:323-329(1988)；以及Presta，《结构生物学新见》(Curr.Op.Struct.Biol.)2:593-596(1992)。
术语“药物组合物”或“药物制剂”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
“药用载体”是指药物组合物或制剂中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
如本文所用，“复合”或“复合的”是指通过非肽键的键和/或力(例如，范德华力、疏水力、亲水力)彼此相互作用的两个或更多个分子的缔合。在一个实施例中，复合物是异源多聚体。应当理解，如本文所用，术语“蛋白质复合物”或“多肽复合物”包含具有缀合至蛋白质复合物中的蛋白质的非蛋白质实体的复合物(例如，包括但不限于化学分子，诸如毒素或检测剂)。
“结合目标抗原”的抗体(诸如单特异性或多特异性抗体)是以足够的亲和力结合抗原(例如蛋白质)的抗体，由此使得该抗体可用作靶向表达该蛋白质的细胞或组织的诊断和/或治疗剂，并且与其他蛋白质不发生显著的交叉反应。在此类实施例中，通过荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)或ELISA测得，抗体与“非靶”蛋白的结合程度小于抗体与其特定靶标蛋白结合程度的约10％。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合到”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位意指与非特异性相互作用可测量到不同的结合(例如，非特异性相互作用可能与牛血清白蛋白或酪蛋白结合)。例如，可通过确定分子的结合与对照分子的结合相比来测量特异性结合。例如，可通过与类似于靶标的对照分子(过量的无标记靶标)竞争来测定特异性结合。在这种情况下，如果标记靶标与探针的结合受到过量无标记靶标的竞争性抑制，则表明存在特异性结合。如本文所用的术语“特异性结合”或“特异性结合到”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位可表现为例如对靶标具有至少约200nM、或至少约150nM、或至少约100nM、或至少约60nM、或至少约50nM、或至少约40nM、或至少约30nM、或至少约20nM、或至少约10nM、或至少约8nM、或至少约6nM、或至少约4nM、或至少约2nM、或至少约1nM、或更大的亲和力。在一个实施例中，术语“特异性结合”是指多特异性抗体结合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不结合任何其他多肽或多肽表位的结合。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体，诸如双特异性或多特异性抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(Kd)表示。例如，Kd可为约200nM或更小、约150nM或更小、约100nM或更小、约60nM或更小、约50nM或更小、约40nM或更小、约30nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约8nM或更小、约6nM或更小、约4nM或更小、约2nM或更小、或约1nM或更小。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常快速结合抗原并且倾向于保持更长的结合时间。测量结合亲和力的各种方法是本领域中已知的，其中任何一种方法均可用于本发明的目的。
在一个实施例中，“Kd”或“Kd值”是通过使用表面等离子体共振测定法来测量的。例如，可使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃下测定Kd值，固定靶标(例如，抗原)CM5芯片的应答单位为-10(RU)。简而言之，在一个实例中，根据供应商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化的葡聚糖生物感测器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。将抗原用10mM醋酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，之后以5μL/分钟的流速进行注射以获得约10应答单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。关于动力学测量，在25℃下，以约25μL/min的流速，注射在含有0.05％Tween 20的PBS(PBST)中的Fab的两倍系列稀释液(例如，0.78nM至500nM)。使用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore Evaluation Software 3.2版)，通过同时拟合缔合与解离感测器图来计算缔合速率(kon)与解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)被计算为比率koff/kon。参见例如Chen etal.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。若通过上述表面等离子体共振测定得出缔合速率超过106M-1s-1，则可通过使用荧光淬灭技术来确定缔合速率，即如在分光计诸如配备止流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯所测得的，在浓度渐增的抗原存在下，测量在25℃下PBS pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少。
根据本文提供的方法制备的关于抗体(例如，经修饰的抗体，例如经修饰的双特异性抗体)(诸如抗体(例如，双特异性抗体)、其片段或衍生物)的“生物学活性”和“生物活性”和“生物学特性”意指具有结合生物分子的能力，除非另有说明。
当用于描述各种异源多聚体多肽时，“分离的”意指已经从表达它的细胞或细胞培养物中分离和/或回收的异源多聚体。其自然环境的污染物组分是会干扰对于异源多聚体的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶质。在某些实施例中，异源多聚体将被纯化至(1)大于蛋白质的95重量％(通过Lowry方法来确定)，并且最优选地大于99重量％；(2)足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度(通过使用旋转杯测序仪)，或(3)同质(通过在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选地银染，来进行SDS-PAGE)。然而，通常，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤进行制备。
抗体(例如，双特异性抗体)通常被纯化至基本同质。短语“基本上同质的”、“基本上同质的形式”和“基本同质”用于表明产物基本上不含源自非期望多肽组合的副产物(例如，重链同源二聚体和/或错义的重链/轻链对)。
以纯度表示，基本同质意指副产物的量不超过10重量％、9重量％、8重量％、7重量％、6重量％、4重量％、3重量％、2重量％或1重量％，或小于1重量％。在一个实施例中，副产物低于5％。
“生物分子”是指核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质以及它们的组合。在一个实施例中，生物分子存在于自然界中。
除非上下文另有说明，否则术语“第一”多肽(诸如重链(HC1或HC1)或轻链(LC1或LC1))和“第二”多肽(诸如重链(HC2或HC2)或轻链(LC2或LC2))及其变体仅为通用标识符，并且不被视为识别使用本文提供的方法产生的抗体(例如，双特异性抗体)的特异性或特定多肽或组分。
除非另有说明，否则根据制造商的说明来使用实例中提及的市售试剂。在以下实例和整个说明书中通过ATCC登录号识别的那些细胞的来源为美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA。除非另有说明，本发明使用重组DNA技术的标准程序，诸如上文和以下教科书中描述的那些：Sambrook等人(同上)，Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience,NY,1989)；Innis等人，PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,Inc.,NY,1990)；Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,ColdSpring Harbor,1988)；Gait,Oligonucleotide Synthesis(IRL Press,Oxford,1984)；Freshney,Animal Cell Culture,1987；Coligan等人，Current Protocols inImmunology,1991。
在本文中提及“约”值或参数是指为此技术领域中的技术人员容易知晓的相应值的常见误差范围。在本文中提及“约”值或参数包含(且描述)涉及该值或参数本身的方面。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
应当理解，本文所述的发明的方面和实施例包括“包含”、“由以下组成”及“基本上由以下组成”所指的方面和实施例。
本文引用的所有参考文献(包括专利申请及公布)在此全部以引用的方式并入。
改进重链/轻链配对选择性的方法
本申请基于对(例如，抗体轻链或其片段的)VL和(例如，抗体重链或其片段的)VH中的氨基酸位置处的、在优先重链/轻链配对中起作用的残基的识别
如下文进一步详细描述的，本文提供的方法包括在重链和/或轻链多肽的可变结构域内(例如，特别是在CDR序列内)的特定残基处引入一个或多个取代。本领域普通技术人员将理解，可采用各种编号惯例以用于指定抗体可变区序列内的特定氨基酸残基。常用的编号惯例包括Kabat和EU索引编号(参见Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))。包括用于可变结构域的校正或替代编号系统的其他惯例包括Chothia(Chothia C,Lesk AM(1987),J Mal Biol 196:901-917；Chothia等人(1989),Nature 342:877-883)、IMGT(Lefranc等人(2003),Dev Comp Immunol 27:55-77)和AHo(Honegger A,Plückthun A(2001)J Mol Biol 309:657-670)。这些参考文献提供了定义抗体序列的可变区氨基酸残基的位置的用于免疫球蛋白可变区的氨基酸序列编号方案。
除非本文另有明确说明，所有对出现在实例和权利要求书中的免疫球蛋白重链可变区(即，VH)氨基酸残基(即，编号)的引用均基于Kabat编号系统，除非另有特别说明，否则所有对VL残基的引用也是如此。除非另有特别说明，否则所有对出现在实例和权利要求书中的免疫球蛋白重链恒定区CH1、CH2和CH3残基(即，编号)的引用均基于EU系统，所有对CL残基的引用也是如此。了解根据Kabat或EU索引编号的残基编号，普通技术人员可根据任何常用的编号惯例来识别本文所述的氨基酸序列修饰。
尽管本文提供的项目、组分或元素(例如“抗体”、“取代”或“取代突变”)可以单数形式描述或要求保护，但复数被设想为在其范围内，除非明确说明限于单数。
如下文更详细描述的，本文提供了改进抗体(包括双特异性抗体)中正确重链/轻链配对的方法，该方法包括将一个或多个取代引入VH和/或VL。还提供了改进抗体(例如，正确组装的双特异性抗体)的产率的方法，该方法包括将一个或多个取代引入抗体的VH和/或VL，其中包含使用特定方法(例如，本领域已知的方法)产生的取代的抗体(例如，双特异性抗体)的产率高于使用相同方法产生的未取代抗体(例如，双特异性抗体)的产率。先前的努力集中于将一个或多个氨基酸取代引入可变结构域的框架区。参见例如Froning等人，Protein Science,2017,26:2021-38。Liu等人，J.Biol.Chem.2015,290:7535-62。Lewis等人，Nature Biotechnology,2014,32:191-202。
在一些实施例中，本文提供的方法进一步包括在Fc区中引入修饰以促进抗体(例如，双特异性抗体)的两条重链的异源二聚化。
重链和轻链可变结构域中的取代突变
本文提供了一种改进抗体的重链和轻链的配对(例如优先配对)的方法，该方法包括将轻链可变结构域(VL)的94位处或VL的96位处的至少一个氨基酸(例如，“原始氨基酸”)从不带电荷的残基取代为带电荷的残基的步骤，该带电荷的残基选自天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，该方法包括将94位处和96位处两者的氨基酸(例如原始氨基酸)从不带电荷的残基取代为带电荷的残基(例如D、R、E或K)的步骤。在一些实施例中，该方法包括提供其中引入了上述取代的抗体。在一些实施例中，该方法包括提供结合本文其他地方描述的一个(或多个)示例性靶标的抗体(诸如双特异性或多特异性抗体)。
当在第一多肽与第二多肽之间发生配对的同时存在一个或多个额外的不同多肽(例如，额外的重链和/或轻链)，优先配对描述了第一多肽(例如重链)与第二多肽(例如轻链)的配对模式。在一些实施例中，当HC1与至少LC1和LC2共表达时，如果HC1/LC1重链-轻链配对的量大于HC1/LC2配对的量，则优先配对发生在抗体(例如，双特异性抗体)的例如HC1与LC1之间。同样，当HC2与至少LC1和LC2共表达时，如果HC2/LC2重链-轻链配对的量大于HC2/LC1配对的量，则优先配对发生在多特异性抗体(例如，双特异性抗体)的例如HC2与LC2之间。HC1/LC1、HC1/LC2、HC2/LC1和HC2/LC2配对可通过本领域已知的方法(例如，液相色谱质谱(LCMS))来进行测量，如本文其他地方进一步详细描述的。
在一些实施例中，术语“原始氨基酸”是指紧接在例如用带电荷的氨基酸(诸如D、R、E或K)进行取代之前，存在于特定位置(例如，VL的94位和/或96位)处的氨基酸。在一些实施例中，术语“不带电荷的氨基酸”或“不带电荷的残基”是指在生理pH(例如，介于约6.8与约7.5之间、介于约6.9与约7.355之间，或介于约6.95与7.45之间的pH)下既不带正电荷(例如质子化)也不带负电荷(例如去质子化)的氨基酸。在一些实施例中，“带电荷的氨基酸”是指在生理pH(例如，介于约6.8与约7.5之间、介于约6.9与约7.355之间，或介于约6.95与7.45之间的pH)下带正电荷(例如质子化)或带负电荷(例如去质子化)的氨基酸。在一些实施例中，不带电荷的氨基酸残基为并非D、R、E或K的氨基酸残基。在一些实施例中，94位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被D取代。在一些实施例中，96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被R取代。在一些实施例中，94位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被D取代，并且96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被R取代。
在一些实施例中，该方法进一步包括将重链可变结构域(VH)的95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从不带电荷的残基取代为带电荷的残基，该带电荷的残基选自天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被D取代。在一些实施例中，VL的94位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被D取代，VL的96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被R取代，并且VH的95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被D取代。
还提供了一种改进抗体的重链和轻链的配对(例如同源配对，即同源VH和VL、Fab以及HC和LC的优先配对)的方法，该方法包括将重链可变结构域(VH)的95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从不带电荷的残基取代为带电荷的残基的步骤，该带电荷的残基选自天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被D取代。
本文还提供了一种改进抗体的重链和轻链的配对(例如同源配对)的方法，该方法包括将轻链可变结构域(VL)的91位处、VL的94位处或VL的96位处的至少一个氨基酸(例如“原始氨基酸”)从非芳族残基取代为芳族残基的步骤，该芳族残基选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，该方法包括将91位处、94位处或96位处的至少两个氨基酸(例如原始氨基酸)从非芳族残基取代为芳族残基的步骤，该芳族残基选自W、F和Y。在一些实施例中，该方法包括将94位处和96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从非芳族残基取代为芳族残基的步骤，该芳族残基选自W、F和Y。在一些实施例中，该方法包括将91位处、94位处和96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)中的每一者从非芳族残基取代为芳族残基的步骤，该芳族残基选自W、F和Y。在一些实施例中，该方法包括提供其中引入了上述取代的抗体。在一些实施例中，该方法包括提供结合本文其他地方描述的一个(或多个)示例性靶标的抗体(诸如双特异性或多特异性抗体)。
在一些实施例中，“原始氨基酸”是指紧接在用芳族氨基酸(例如W、F和Y)进行取代之前，存在于VL的91位处、94位处和/或96位处的氨基酸(例如，非芳族氨基酸)。在一些实施例中，术语“非芳族氨基酸”或“非芳族残基”是指不包含芳族环的氨基酸。在一些实施例中，“非芳族残基”是指并非W、F或Y的氨基酸残基。
在一些实施例中，91位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被Y取代。在一些实施例中，94位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被Y取代。在一些实施例中，96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被W取代。在一些实施例中，91位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被Y取代，并且94位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被Y取代。在一些实施例中，91位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被Y取代，并且96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被W取代。在一些实施例中，94位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被Y取代，并且96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被W取代。在一些实施例中，91位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被Y取代，94位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被Y取代，并且96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被W取代。
在一些实施例中，该方法进一步包括将重链可变结构域(VH)的95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从不带电荷的残基取代为带电荷的残基，该带电荷的残基选自天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，该方法进一步包括将重链可变结构域(VH)的95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从非芳族残基取代为芳族残基，该芳族残基选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)。
在一些实施例中，将一个或多个上述取代引入抗体片段，例如，包含VL结构域和VH结构域的抗体片段。此类抗体片段包括但不限于例如Fab、Fab’、单特异性F(ab’)2、双特异性F(ab’)2、单臂抗体、ScFv、Fv等。
在一些实施例中，其中引入一个或多个上述取代的抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施例中，抗体包含κ轻链。在一些实施例中，抗体包含λ轻链。在某些实施例中，VL包含KV1或KV4人种系家族的框架序列。在一些实施例中，VH包含HV2或HV3人种系家族的框架序列。在一些实施例中，抗体包含鼠Fc区。在一些实施例中，抗体包含人Fc区，例如人IgG Fc区(例如人IgG1、人IgG2、人IgG3m或人IgG4 Fc区)。在一些实施例中，抗体为单特异性抗体。在一些实施例中，抗体为多特异性抗体，例如，双特异性抗体。
在某些实施例中，其中引入一个或多个上述取代的抗体为双特异性抗体，该双特异性抗体包含与第一VH(VL1)配对的第一VL(VL1)和与第二VH(VH2)配对的第二VL(VL2)，其中VL1包含Q38K取代突变，VH1包含Q39E取代突变，VL2包含Q38E取代突变，VH2包含Q39K取代突变，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，VL1包含Q38E取代突变，VH1包含Q39K取代突变，VL2包含Q38K取代突变，VH2包含Q39E取代突变，其中氨基酸编号是根据Kabat。对本领域普通技术人员显而易见的是，术语“VL1”、“VH1”、“VL2”和“VH2”为任意名称，并且在本文的任何实施例中的例如“VL1”和“VL2”可颠倒。
另外地或可替代地，在一些实施例中，其中引入了一个或多个上述取代的抗体为包含第一重链(HC1)、第一轻链(LC1)、第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)的双特异性抗体，该第一重链包含第一CH1结构域(CH11)，该第一轻链包含第一CL结构域(CL1)，该第二重链包含第二CH1结构域(CH12)，该第二轻链包含第一CL结构域(CL2)。对于本领域普通技术人员显而易见的是，术语“HC1”、“HC2”、“LC1”、“LC2”等为任意名称，并且在本文的任何实施例中的例如“HC1”和“HC2”可颠倒。即，在H1的CH1结构域和L1的CL结构域中的上述任何突变可替代地在H2的CH1结构域域和L2的CL结构域中。在一些实施例中，该方法进一步包括用E取代CH11中的S183，用K取代CL1中的V133，用K取代CH12中的S183，以及用E取代CL2中的V133，其中氨基酸编号根据EU索引。在一些实施例中，该方法进一步包括用K取代CH11中的S183，用E取代CL1中的V133，用E取代CH12中的S183，以及用K取代CL2中的V133，其中氨基酸编号根据EU索引。参见例如Dillon等人，(2017)MABS 9(2):213-230和WO2016/172485。在一些实施例中，HC1进一步包含第一CH2(CH21)结构域和/或第一CH3(CH31)结构域。另外地或可替代地，在一些实施例中，HC2进一步包含第二CH2(CH22)结构域和/或第二CH3(CH32)结构域。在一些实施例中，CH32被改变，使得在CH31/CH32界面内，一个或多个氨基酸残基被一个或多个具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在CH32的表面上产生与CH31相互作用的突起，且CH31被改变，使得在CH31/CH32界面内，一个或多个氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在CH31的表面上产生与CH32相互作用的空腔。在一些实施例中，CH31被改变，使得在CH31/CH32界面内，一个或多个氨基酸残基被一个或多个具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在CH31的表面上产生与CH32相互作用的突起，且CH32被改变，使得在CH31/CH32界面内，一个或多个氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在CH32的表面上产生与CH31相互作用的空腔。在一些实施例中，突起是杵突变，例如包含T366W的杵突变，其中氨基酸编号是根据EU索引。在一些实施例中，空腔为臼突变，例如臼突变包含T366S、L368A和Y407V中的至少一个、至少两个或全部三个，其中氨基酸编号是根据EU索引。提供了关于杵臼结构突变的其他细节，例如US 5,731,168、US 5,807,706、US 7,183,076，其内容全文以引用方式并入本文。在一些实施例中，双特异性抗体的HC1/LC1对与第一抗原结合，并且双特异性抗体的HC2/LC2对与第二抗原结合。在一些实施例中，双特异性抗体的HC1/LC1对与第一抗原的第一表位结合，并且双特异性抗体的HC2/LC2对与第一抗原的第二表位结合。
提供了一种制备(诸如修饰或工程化)抗体(例如，双特异性抗体)以获得具有改进的优先重链/轻链配对的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)的方法，该方法包括将轻链可变结构域(VL)的94位处和/或VL的96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从不带电荷的残基取代为带电荷的残基以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)，该带电荷的残基选自天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，该方法包括至少将94位处和96位处两者的氨基酸(例如原始氨基酸)从不带电荷的残基取代为带电荷的残基(例如D、R、E或K)以获得经修饰的抗体(例如，双特异性抗体)的步骤。在一些实施例中，经修饰的抗体(例如，双特异性或多特异性抗体)与本文其他地方描述的示例性靶标结合。在许多情况下，与这些靶标结合的抗体的重链和轻链的序列可公开获得，并且可进行比对并映射至Kabat编号方案，然后针对Kabat序列数据库进行扫描以识别待取代的位置。
在一些实施例中，94位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被D取代以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)。在一些实施例中，96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被R取代以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)。在一些实施例中，94位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被D取代，并且96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被R取代以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)。
在一些实施例中，该方法进一步包括将重链可变结构域(VH)的95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从不带电荷的残基取代为带电荷的残基以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)，该带电荷的残基选自天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被D取代以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)。在一些实施例中，VL的94位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被D取代，VL的96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被R取代，并且VH的95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被D取代以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)。
还提供了一种制备(诸如修饰或工程化)抗体(例如，双特异性抗体)以获得具有改进的优先重链/轻链配对的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)的方法，该方法包括将重链可变结构域(VH)的95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从不带电荷的残基取代为带电荷的残基以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)，该带电荷的残基选自天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被D取代以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)。
还提供了一种制备(诸如修饰或工程化)抗体(例如，双特异性抗体)以获得具有改进的优先重链/轻链配对的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)的方法，该方法包括将轻链可变结构域(VL)的91位处、VL的94位处和/或VL的96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从非芳族残基取代为芳族残基以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)，该芳族残基选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，该方法包括将91位处、94位处或96位处的至少两个氨基酸(例如原始氨基酸)从非芳族残基取代为芳族残基以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)的步骤，该芳族残基选自W、F和Y。在一些实施例中，该方法包括将94位处和96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从非芳族残基取代为芳族残基以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)的步骤，该芳族残基选自W、F和Y。在一些实施例中，该方法包括将91位处、94位处和96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)中的每一者从非芳族残基取代为芳族残基以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)的步骤，该芳族残基选自W、F和Y。在一些实施例中，经修饰的抗体(例如，双特异性或多特异性抗体)与本文其他地方描述的示例性靶标结合。
在一些实施例中，91位处的氨基酸(例如，原始氨基酸)被Y取代以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)。在一些实施例中，94位处的氨基酸(例如，原始氨基酸)被Y取代以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)。在一些实施例中，96位处的氨基酸(例如，原始氨基酸)被W取代以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)。在一些实施例中，91位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被Y取代，并且94位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被Y取代以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)。在一些实施例中，91位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被Y取代，并且96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被W取代以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)。在一些实施例中，94位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被Y取代，并且96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被W取代以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)。在一些实施例中，91位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被Y取代，94位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被Y取代，并且96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被W取代以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)。
在一些实施例中，该方法进一步包括将重链可变结构域(VH)的95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从不带电荷的残基取代为带电荷的残基以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)，该带电荷的残基选自天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，该方法进一步包括将重链可变结构域(VH)的95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从非芳族残基取代为芳族残基以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)，该芳族残基选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)。
在一些实施例中，制备(诸如修饰或工程化)抗体(例如，双特异性抗体)的方法包括修饰VH和/或VL，例如通过将一个或多个上述取代引入VH和/或VL以获得经修饰的VH和/或经修饰的VL，并将经修饰的VH和/或经修饰的VL移植至抗体(例如，双特异性抗体)上以获得经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)。
在一些实施例中，已根据本文所述的方法而被取代、修饰和/或工程化的VH/VL对经受至少一个亲和力成熟步骤(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个亲和力成熟步骤)。亲和力成熟为一个过程，例如通过本文所述的方法获得的抗体的重链/轻链对通过该过程而受到选择增加对靶标(例如，靶配体或靶抗原，如下文进一步详细描述的)的亲和力的方案的影响(参见Wu等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA.95,6037-42)。关于抗体的亲和力成熟的细节也详述于例如Merchant等人(2013)Proc Natl Acad Sci U S A.110(32):E2987-96；Julian等人(2017)Scientific Reports.7:45259；Tiller等人(2017)Front.Immunol.8:986；Koenig等人(2017)Proc Natl Acad Sci U S A.114(4):E486-E495；Yamashita等人(2019)Structure.27,519 527；Payandeh等人(2019)J CellBiochem.120:940-950；Richter等人(2019)mAbs.11(1):166-177；Cisneros等人(2019)Mol.Syst.Des.Eng.4:737-746中。在某些实施例中，通过本文方法获得的重链/轻链对的VH和/或VL中的一个或多个氨基酸位置被随机化(即，在除上述那些位置之外的位置处，即VL中的91位、94位和/或96位，以及任选地VH中的95位)以产生重链/轻链变体文库。然后筛选VH/VL变体的文库，以识别对靶标具有所需亲和力的那些变体。因此，在某些实施例中，本文所述的方法进一步包括以下步骤：(a)在一个或多个位置处诱变或随机化通过本文方法获得的重链/轻链对的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3，以产生VH/VL变体文库，(b)用靶标(例如，靶配体或靶抗原)接触VH/VL变体文库，(c)检测靶标与VH/VL变体的结合，以及(d)获得特异性结合靶标的VH/VL变体。如上所述，抗原结合结构域变体中的VL中的91位、94位和/或96位以及任选地VH中的95位不被进一步靶向以用于随机化。用于诱变抗体(或其片段抗原结合片段)的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3的方法为本领域已知的，并且在本文其他地方讨论。在本文其他地方提供了关于文库和文库筛选的细节。
在某些实施例中，本文所述的方法进一步包括以下步骤：(e)确定特异性结合靶标的VH/VL变体(即，亲和力成熟的VH/VL对)的核酸序列。在一些实施例中，本文所述的方法进一步包括以下步骤：(f)将亲和力成熟的VH/VL对移植至抗体(例如，双特异性抗体)上以成为亲和力成熟的经修饰的抗体(例如，亲和力成熟的经修饰的双特异性抗体)。在一些实施例中，本文所述的方法进一步包括以下步骤：(g)评估亲和力成熟的VH/VL对例如使用下面所述的方法来表现出优先配对/优先组装的程度。
本文还提供了根据上述任何一种方法或方法组合而产生的抗体(例如，单特异性、双特异性或多特异性抗体)或抗体片段。
抗体重链和轻链的优先配对/优先组装
如上所述，当在第一多肽与第二多肽之间发生配对的同时存在一个或多个额外的不同多肽(例如，额外的重链和/或轻链)，优先配对描述了第一多肽(例如重链)与第二多肽(例如轻链)的配对模式。当HC1与至少LC1和LC2共表达时，如果HC1/LC1重链-轻链配对的量大于HC1/LC2配对的量，则优先配对(例如，同源配对)发生在抗体(例如，双特异性抗体)的例如HC1与LC1之间。同样，当HC2与至少LC1和LC2共表达时，如果HC2/LC2重链-轻链配对的量大于HC2/LC1配对的量，则优先配对(例如，同源配对)发生在多特异性抗体(例如，双特异性抗体)的例如HC2与LC2之间。HC1/LC1、HC1/LC2、HC2/LC1和HC2/LC2配对可通过本领域已知的方法(例如，液相色谱质谱(LCMS))来进行测量，如本文其他地方进一步详细描述的。
在某些实施例中，本文提供的方法用于生成(例如产生)抗体(例如，双特异性抗体)，其中HC1优先与LC1配对。另外地或可替代地，本文提供的方法用于生成(例如产生)抗体(例如，双特异性抗体)，其中HC2优先与LC2配对。在某些实施例中，本文提供的方法用于生成(例如产生)抗体(例如，双特异性抗体)，其中HC1优先与LC1配对，并且HC2优先与LC2配对。在某些实施例中，当通过本文提供的方法产生的抗体(例如，双特异性抗体)的HC1与HC2、LC1和LC2共表达时，包含所需配对(例如，HC1/LC1和HC2/LC2)的双特异性抗体以如下相对产率进行生产：至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约71％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约99％或超过约99％，包括介于这些值之间的任何范围。包含所需配对(例如，HC1/LC1和HC2/LC2)的双特异性抗体的相对产率可使用例如质谱来确定，如实例中所述。
在某些实施例中，使用本文提供的方法产生的抗体(例如，双特异性抗体)的所表达的多肽以经改进的特异性来进行组装，以减少错误配对的重链和轻链的产生。在某些实施例中，在生产过程中，本文提供的抗体(例如，双特异性抗体)的CH1的VH结构域与LC1的VL结构域进行组装(例如，优先组装)。
评估正确配对/优先配对/优先组装的方法
根据本文所述的方法制备的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)的HC1与LC1的优先配对、正确配对和/或优先组装可使用本领域普通技术人员公知的多种方法中的任一种来确定。例如，经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)中的HC1与LC1的优先配对程度可经由轻链竞争测定(LCCA)来确定。于2013年10月3日提交的国际专利申请PCT/US2013/063306描述了LCCA的各种实施例，并且其全文出于所有目的以引用方式并入本文。该方法允许对共表达的蛋白质混合物内的重链与特异性轻链的配对进行定量分析，并可用于确定当重链和轻链共表达时，一个特定的免疫球蛋白重链是否选择性地与两个免疫球蛋白轻链中的任何一个相关联。该方法如下文所简述：至少一条重链和两条不同的轻链在细胞中以使得重链为限制性配对反应物的比率进行共表达；任选地将分泌蛋白与细胞分离；将与重链结合的免疫球蛋白轻链多肽与剩余分泌蛋白分离，以产生分离的重链配对部分；检测分离的重链部分中每条不同轻链的量；并且分析分离的重链部分中每条不同轻链的相对量，以确定至少一条重链与其中一条轻链选择性配对的能力。
在某些实施例中，经由质谱法(诸如液相色谱-质谱法(LC-MS)天然质谱法、酸性质谱法等)来测量根据本文提供的方法制备的经修饰的抗体(诸如，经修饰的双特异性或多特异性抗体)的HC1与LC1的优先配对。质谱法用于使用相对异源二聚体群体的分子量差异来定量包括每条轻链在内的该相对异源二聚体群体，以识别每个不同的种类。在某些实施例中，正确或优先配对由如本文所述的LC-MS来确定。在某些实施例中，测量Fv或Fab的正确或优先配对。
多特异性抗体形式
根据本文提供的方法制备的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)可与本领域已知的多种双特异性或多特异性抗体形式中的任一种一起使用。本领域已经开发了多种形式，以解决由具有多种结合特异性的分子提供的治疗时机。已经描述了若干方法制备双特异性抗体，其中特异性抗体轻链或片段与特异性抗体重链或片段配对。
例如，CH1/CL界面中的促进同源Fab的选择性配对或HC和LC配对的突变在Dillon等人(2017)MABS 9(2):213-230和WO2016/172485中描述，其内容全文以引用方式并入本文。
杵臼结构为用于抗体的CH3结构域的异源二聚化技术。先前，杵臼结构技术已应用于生产具有单一公共轻链(LC)的人全长双特异性抗体(Merchant等人，“An efficientroute to human bispecific IgG.”Nat Biotechnol.1998；16:677 81；Jackman等人，“Development of a two-part strategy to identify a therapeutic humanbispecific antibody that inhibits IgE receptor signaling.”J Biol Chem.2010；285:20850 9。)另参见WO1996027011，其全文出于所有目的以引用方式并入本文。
可进一步修饰使用本文提供的方法产生的抗体(例如，双特异性抗体),以包含其他异源二聚化结构域，该结构域具有相对于同源二聚体而形成异源二聚体的强烈偏好。说明性实例包括但不限于例如WO2007147901(等人Novo Nordisk：描述离子相互作用)；WO 2009089004(Kannan 等人Amgen： 描述静电转向效应)； WO 2010/034605(Christensen等人-Genentech；描述卷曲螺旋)。另参见例如Pack,P.&Plückthun,A.,Biochemistry 31,1579-1584(1992)，描述亮氨酸拉链，或Pack等人，Bio/Technology 11,1271-1277(1993)，描述螺旋-转-螺旋螺基序。短语“异源多聚化结构域”和“异源二聚化结构域”在本文可互换使用。在某些实施例中，使用本文提供的方法产生的抗体(例如，双特异性抗体)包含一个或多个异源二聚化结构域。
美国专利公开号2009/0182127(Novo Nordisk,Inc.)描述了通过修饰Fc界面处和轻-重链对的CH1:CL处的氨基酸残基来产生双特异性抗体，其降低了一对链的轻链与另一对链的重链相互作用的能力。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983))及“杵臼结构”工程化(参见，例如，美国专利号5,731,168，以及Atwell等人，J.Mol.Biol.270:26-35(1997))。多特异性抗体也可通过以下方法来制备：工程化静电转向效应，以用于制备抗体Fc-异源二聚体分子(参见，例如，WO 2009/089004)；交联两种或更多种抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980和Brennan等人，Science,229:81(1985))；以及使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)以及WO 2011/034605)。
多特异性抗体也可以以不对称形式提供，其中在具有相同抗原特异性的一个或多个结合臂中具有结构域交叉，即通过交换VH/VL结构域(参见，例如，WO 2009/080252和WO2015/150447)、CH1/C)结构域(参见，例如，WO 2009/080253)或完整的Fab臂(参见，例如，WO2009/080251、WO 2016/016299，还参见Schaefer等人，PNAS,108(2011)1187-1191，以及Klein等人，MAbs 8(2016)1010-20)。在一方面，多特异性抗体包含交叉Fab片段。术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换型Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交叉Fab片段包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区1(CH1)组成的多肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。还可以通过将荷电或非荷电的氨基酸突变引入结构域界面以指导正确的Fab配对，以对不对称Fab臂进行工程化。参见，例如，WO 2016/172485。
在Klein等人(2012)mAbs 4:6,653-663和Spiess等人(2015)“Alternativemolecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies.”Mol.Immunol.67(2015)95-106中提供了对各种双特异性和多特异性抗体形式的综述.
在一些实施例中，通过本文提供的方法制备的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)被重新格式化为上述任何多特异性抗体形式，以进一步确保正确的重/轻链配对。
抗体的生产和纯化
培养宿主细胞
在某些实施例中，根据本文提供的方法制备的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性或多特异性抗体)可通过以下方法来提供：(a)将一组编码HC1、HC2、LC1和LC2的多核苷酸引入宿主细胞；以及(b)培养宿主细胞以产生抗体(例如，双特异性或多特异性抗体)。在某些实施例中，将编码LC1和LC2的多核苷酸以预先确定的比率(例如，摩尔比或重量比)引入宿主细胞。在某些实施例中，将编码LC1和LC2的多核苷酸引入宿主细胞，使得LC1:LC2的比率(例如，摩尔比或重量比)为约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1.5:1、约2:1、约2.5:1、约3:1、约3.5:1、约4:1、约4.5:1、约5:1或约5.5:1，包括介于这些值之间的任何范围。在某些实施例中，该比率为摩尔比。在某些实施例中，该比率为重量比。在某些实施例中，将编码HC1和HC2的多核苷酸以预先确定的比率(例如，摩尔比或重量比)引入宿主细胞。在某些实施例中，将编码HC1和HC2的多核苷酸引入宿主细胞，使得HC1:HC2的比率(例如，摩尔比或重量比)为约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1.5:1、约2:1、约2.5:1、约3:1、约3.5:1、约4:1、约4.5:1、约5:1或约5.5:1，包括介于这些值之间的任何范围。在某些实施例中，该比率为摩尔比。在某些实施例中，该比率为重量比。在某些实施例中，将编码HC1、HC2、LC1和LC2的多核苷酸以预先确定的比率(例如，摩尔比或重量比)引入宿主细胞。在某些实施例中，将编码HC1、HC2、LC1和LC2的多核苷酸引入宿主细胞中，使得HC1+HC2:LC1,+LC2的比率(例如，摩尔比或重量比)为约5:1、约5:2、约5:3、约5:4、约1:1、约4:5、约3:5、约2:5或约1:5，包括介于这些值之间的任何范围。在某些实施例中，将编码LC1、LC2、HC1和HC2的多核苷酸引入宿主细胞，使得LC1+LC2:HC1,+HC2的比率(例如，摩尔比或重量比)为约1:1:1:1、约2.8:1:1:1、约1.4:1:1:1、约1:1.4:1:1、约1:2.8:1:1、约1:1:2.8:1、约1:1:1.4:1、约1:1:1:2.8或约1:1:1:1.4，包括介于这些值之间的任何范围。在某些实施例中，该比率为摩尔比。在某些实施例中，该比率为重量比。
在某些实施例中，产生根据本文提供的方法制备的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性或多特异性抗体)进一步包括确定用于引入细胞的多核苷酸的最佳比率。在某些实施例中，质谱法用于确定抗体产率(例如，双特异性抗体产率)，并且调节最佳链比率以最大化蛋白质产率(例如，双特异性抗体产率)。在某些实施例中，产生根据本文提供的方法生成的抗体(例如，双特异性或多特异性抗体)进一步包括从细胞培养物中收获或回收抗体。在某些实施例中，产生根据本文提供的方法生成的抗体(例如，双特异性或多特异性抗体)进一步包括纯化收获或回收的抗体。
用于产生根据本文提供的方法制备的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)的宿主细胞可在多种培养基中进行培养。市售培养基诸如Ham's F10(Sigma)、基本必需培养基((MEM),(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良的Eagle培养基((DMEM),Sigma)适用于培养宿主细胞。另外，在Ham等人，Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes等人，Anal.Biochem.102:255(1980)，美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195或美国再公告专利30,985中描述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。这些介质中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必要的补充剂。培养条件诸如温度、pH值等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，对于普通技术人员而言是显而易见的。
收获或回收并纯化抗体
在相关方面，产生根据本文所述方法制备的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)包括在允许经修饰的抗体表达的条件下，培养上述宿主细胞；并且回收(例如收获)经修饰的抗体.在某些实施例中，产生根据本文所述方法制备的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)进一步包括纯化回收的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)以获得基本上同质的制剂，例如，以用于进一步的测定和用途。
根据本文所述方法制备的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)可在细胞内产生，或直接分泌至培养基中。如果此类经修饰的抗体在细胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤移除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。在根据本文所述方法制备的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)分泌至培养基中的情况下，通常首先使用市售蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)来浓缩来自此类表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂诸如PMSF可以包含在前述任何步骤中以抑制蛋白水解作用并且抗生素可以包含在内以防止外来污染物的生长。
可采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法从细胞获得根据本文所述方法制备的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)的基本上同质的制剂。以下程序是合适的纯化程序的示例：在免疫亲和柱或离子交换柱上分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅胶上或在阳离子交换树脂(如DEAE)上的色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和凝胶过滤，例如使用Sephadex G-75。
另外地或可替代地，可使用例如羟基磷灰石层析法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法来纯化使用本文所述方法制备的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)，其中亲和层析是优选的纯化技术。
在某些方面，将衍生自如上所述的细胞培养基的制剂施加到蛋白A固定的固相上，以使经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)与蛋白A特异性结合。然后洗涤固相以去除与固相非特异性地结合的污染物。经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)通过洗脱到包含离液剂或温和去污剂的溶液中而从固相中回收。示例性离液剂和温和去污剂包括但不限于盐酸胍、尿素、高氯酸锂、精氨酸、组氨酸、SDS(十二烷基硫酸钠)、吐温、Triton和NP-40，所有这些均可商购。
蛋白A作为亲和配体的适用性取决于抗体(例如，双特异性抗体)中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人，EMBOJ.5:15671575(1986))。亲和配体所附接的基质大多是琼脂糖，但也可以使用其他基质。机械稳定的基质，诸如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)，具有比琼脂糖更快的流速和更短的处理时间。当经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)包含CH3结构域时，Bakerbond树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)可用于纯化。取决于待回收的抗体(例如，双特异性抗体)，也可使用其他蛋白质纯化技术，诸如在离子交换柱上进行分级、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅胶上进行的色谱、在肝素上进行的色谱、在阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上进行的色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可使用pH为约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液对包含经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱，优选在低盐浓度下进行(例如，约0-0.25M盐)。经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)的产生可替代地或附加地(对于任何前述特定方法)包括透析包含多肽混合物的溶液。
文库和文库筛选
本文还提供了表现出优先配对的重链/轻链对(或其抗原结合片段)的文库。
例如，本文提供了包含多个抗原结合结构域变体的文库，每个抗原结合结构域变体均包含不同的抗体重链结构域(VH)和不同的抗体轻链结构域(VL)，其中每个VH均包含不同的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列，其中每个VL均包含不同的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列，并且其中每个VL的94位处或每个VL的96位处的至少一个氨基酸为选自天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)的带电荷的残基，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，每个VL的94位和96位处的两个氨基酸均为独立地选自D、R、E和K的带电荷的残基。在一些实施例中，每个VL的94位处的氨基酸均为D。在一些实施例中，每个VL的96位处的氨基酸均为R。在一些实施例中，每个VL的94位处的氨基酸均为D，并且每个VL的96位处的氨基酸均为R。在一些实施例中，每个VH的95位处的氨基酸均为选自D、R、E和K的带电荷的残基。在一些实施例中，每个VH的95位处的氨基酸均为D。在一些实施例中，每个VL的94位处的氨基酸均为D，每个VL的96位处的氨基酸均为R，并且每个VH的95位处的氨基酸均为D。
本文还提供了包含多个抗原结合结构域变体的文库，每个抗原结合结构域变体均包含不同的抗体重链结构域(VH)和不同的抗体轻链结构域(VL)，其中每个VH均包含不同的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列，其中每个VL均包含不同的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列，并且其中每个VL的91位处、每个VL的94位处或每个VL的96位处的至少一个氨基酸为选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)的芳族残基，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，每个VL的91位处、94位处或96位处(例如，91位和94位、91位和96位或者94位和96位)的至少两个氨基酸为选自W、F和Y的芳族残基。在一些实施例中，每个VL的91位处的氨基酸为Y。在一些实施例中，每个VL的94位处的氨基酸为Y。在一些实施例中，每个VL的96位处的氨基酸为W。在一些实施例中，每个VL的91位处的氨基酸为Y，并且每个VL的94位处的氨基酸为Y。在一些实施例中，每个VL的91位处的氨基酸为Y，并且每个VL的96位处的氨基酸为W。在一些实施例中，每个VL的94位处的氨基酸为Y，并且每个VL的96位处的氨基酸为W。在一些实施例中，每个VL在91位处的氨基酸为Y，每个VL的94位处的氨基酸为Y，并且每个VL的96位处的氨基酸为W。在一些实施例中，每个VH的95位处的氨基酸为选自天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)的带电荷的残基，其中氨基酸编号是根据Kabat。在一些实施例中，每个VH的95位处的氨基酸为选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)的芳族残基。
在某些实施例中，文库为多肽文库(例如本文所述的任何多肽中的多个)。在某些实施例中，本文提供的多肽文库为多肽展示文库。可筛选此类多肽展示文库以选择和/或进化具有所需特性的结合蛋白，以用于多种效用，包括但不限于治疗、预防、兽医、诊断、试剂或材料应用。在某些实施例中，文库为核酸文库(例如本文所述的任何核酸中的多个)，其中每个核酸(或一组核酸)编码本文所述的不同抗原结构域结合变体。在一些实施例中，文库为多个宿主细胞(例如，原核或真核宿主细胞)，每个均包含(并且例如，表达)不同的核酸(或一组核酸)，其中每个不同的核酸(或一组核酸)编码本文所述的不同抗原结构域结合变体
在某些实施例中，本文提供的文库包含至少2、3、4、5、10、30、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500、10000、25000、50000、75000、100000、250000、500000、750000、1000000、2500000、5000000、7500000、10000000或超过10000000个不同的抗原结合结构域，包括介于这些值之间的任何范围。在某些实施例中，本文提供的文库具有约2、约5、约10、约50、约100、约250、约500、约750、约103、约104、约105、约106、约107、约108、约109、约1010、约1011、约1012、约1013、约1014或超过约1014(诸如约1015或约1016)的序列多样性，包括介于这些值之间的任何范围。
在某些实施例中，本文提供的文库经由基因工程产生。先前已经描述了用于诱变和随后的文库构建的多种方法(以及用于筛选或选择的适当方法)。此类诱变方法包括但不限于例如易错PCR、环改组或寡核苷酸定向诱变、随机核苷酸插入或重组前的其他方法。关于这些方法的更多细节在例如Abou-Nadler等人(2010)Bioengineered Bugs 1,337-340；Firth等人(2005)Bioinformatics 21,3314-3315；Cirino等人(2003)Methods Mol Biol231,3-9；Pirakitikulr(2010)Protein Sci 19,2336-2346；Steffens等人(2007)J.BiomolTech 18,147-149和其他文献中描述。因此，在某些实施例中，提供了经由基因工程技术产生的多特异性抗原结合蛋白文库。
在某些实施例中，本文提供的文库经由体外翻译产生。简而言之，体外翻译需要将蛋白质-编码序列克隆至含有启动子的载体中，通过用RNA聚合酶转录克隆序列来产生mRNA，以及例如使用无细胞提取物、通过体外翻译该mRNA来合成蛋白质。可简单地通过改变经克隆的蛋白质-编码序列来产生所需的突变蛋白。许多mRNA可在小麦胚芽提取物或兔网织红细胞裂解物中有效翻译。关于体外翻译的更多细节在例如Hope等人(1985)Cell 43,177-188；Hope等人(1986)Cell 46,885-894；Hope等人(1987)EMBO J.6,2781-2784；Hope等人(1988)Nature 333,635-640；以及Melton等人(1984)Nucl.Acids Res.12,7057-7070中描述。
因此，提供了编码本文所述的多肽展示文库的多个核酸分子。本文还提供了可操作地连接至多个核酸分子的表达载体。还提供了通过提供编码本文所述的多个抗原结合结构域的多个核酸并表达该核酸，来制作本文提供的文库的方法。
在某些实施例中，本文提供的文库经由化学合成产生。固相和液相肽合成的方法为本领域公知的，并且在例如Methods of Molecular Biology,35,Peptide SynthesisProtocols，(M.W.Pennington和B.M.Dunn编辑)，Springer,1994；Welsch等人(2010)CurrOpin Chem Biol 14,1-15；Methods of Enzymology,289,Solid Phase PeptideSynthesis，(G.B.Fields编辑)，Academic Press,1997；Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins，(P.Lloyd-Williams、F.Albericio和E.Giralt编辑)，CRC Press,1997；Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,A Practical Approach，(W.C.Chan、P.D.White编辑)，Oxford University Press,2000；Solid Phase Synthesis,APractical Guide，(S.F.Kates、F Albericio编辑)，Marcel Dekker,2000；P.Seneci,Solid-Phase Synthesis and Combinatorial Technologies,John Wiley&Sons,2000；Synthesis of Peptides and Peptidomimetics(M.Goodman，总编辑，A.Felix、L.Moroder、C.Tmiolo编辑)，Thieme,2002；N.L.Benoiton,Chemistry of Peptide Synthesis,CRCPress,2005；Methods in Molecular Biology,298,Peptide Synthesis andApplications，(J.Howl编辑)Humana Press,2005；以及Amino Acids,Peptides andProteins in Organic Chemistry，第3卷，Building Blocks,Catalysts and CouplingChemistry，(A.B.Hughs编辑)Wiley-VCH,2011中详细描述。因此，在某些实施例中，提供了经由化学合成技术产生的多特异性抗原结合蛋白文库。
在某些实施例中，本文提供的文库为展示文库。在某些实施例中，展示文库为噬菌体展示文库、噬菌粒展示文库、病毒展示文库、细菌展示文库、酵母展示文库、λgt11文库、CIS展示文库，以及体外区室化文库，或核糖体展示文库。制备和筛选此类展示文库的方法为本领域技术人员公知的并且在例如Molek等人(2011)Molecules 16,857-887；Boder等人，(1997)Nat Biotechnol 15,553-557；Scott等人(1990)Science 249,386-390；Brisette等人(2007)Methods Mol Biol 383,203-213；Kenrick等人(2010)Protein EngDes Sel 23,9-17；Freudl等人(1986)J Mol Biol 188,491-494；Getz等人(2012)MethodsEnzymol 503,75-97；Smith等人(2014)Curr Drug Discov Technol 11,48-55；Hanes等人(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94,4937-4942；Lipovsek等人，(2004)J Imm Methods290,51-67；Ullman等人，(2011)Brief.Funct.Genomics,10,125 134；Odegrip等人(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101,2806-2810；以及Miller等人(2006)Nat Methods 3,561-570中描述。
在某些实施例中，本文提供的文库为例如通过Szostak等人，US 6258558、US6261804、US 5643768和US 5658754中所述的技术而产生的RNA-蛋白融合文库。在某些实施例中，本文提供的文库为DNA-蛋白文库，如例如US 6416950中所述。
筛选方法
可筛选本文提供的文库以识别对目标靶标(例如，抗原)具有高亲和力的抗原结合变体。因此，本文提供了一种获得结合目标靶标(例如，本文其他地方描述的目标靶标)的抗原结合变体的方法。
在某些实施例中，该方法包括：a)在允许目标靶标与文库中的特异性结合该靶标的抗原结合结构域变体结合的条件下，接触本文所述的文库，(b)检测靶标与特异性结合该靶标的抗原结合结构域变体的结合(例如，检测包含靶标和特异性结合该靶标的抗原结合结构域变体的复合物)，以及(c)获得特异性结合该靶标的抗原结合结构域变体。在一些实施例中，该方法进一步包括使因此识别的抗原结合结构域变体经过至少一个亲和力成熟步骤，其中不选择VL中91位处、94位处和/或96位处的氨基酸以用于随机化。在一些实施例中，不选择VH中95位处的氨基酸以用于随机化。
在一些实施例中，该方法进一步包括产生抗体(诸如双特异性抗体或多特异性抗体)，该抗体包含结合目标靶标的抗原结合结构域变体(例如，结合目标靶标的亲和力成熟的抗原结合结构域变体)。
在某些实施例中，提供了包含靶标和特异性结合该靶标的抗原结合结构域变体的复合物。在某些实施例中，该方法进一步包括确定抗原结合结构域变体的VH和/或VL的核酸序列。
亲和力成熟为一个过程，在该过程中，抗原结合结构域变体受到选择增加对靶标(例如，靶配体或靶抗原)的亲和力的方案的影响(参见Wu等人(1998)Proc Natl Acad SciUSA.95,6037-42)。在某些实施例中，在从文库筛选中识别后，特异性结合第一靶配体的抗原结合结构域变体被进一步随机化(即，在除上述那些位置之外的位置处，即VL中的91位、94位和/或96位，以及任选地VH中的95位)。例如，在某些实施例中，获得特异性结合第一靶配体的抗原结合结构域变体的方法进一步包括：(e)诱变或随机化先前识别的抗原结合结构域变体CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3，以产生进一步的抗原结合结构域变体，(f)将第一靶配体与进一步随机化的抗原结合结构域变体接触，(g)检测靶标与进一步随机化的抗原结合结构域变体的结合，和以及(h)获得特异性结合靶标的进一步随机化的抗原结合结构域变体。如上所述，抗原结合结构域变体中的VL中的91位、94位和/或96位以及任选地VH中的95位不被进一步靶向以用于随机化。用于诱变抗原结合结构域的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3的方法为本领域已知的，并且可包括例如随机诱变、CDR行走诱变或顺序和并行优化、通过基于结构的合理设计而进行的诱变、位点特异性诱变、基于酶的诱变、基于化学的诱变，以及用于合成抗体基因生产的基因合成方法。参见，例如，Yang等人1995,CDR Walking Mutagenesis for the Affinity Mutationof a Potent Human Anti-HIV-1 Antibody into the Picomolar Range,J.Mol.Biol.254:392-40，和Lim等人，2019,Review:Cognizance of Molecular Methodsfor the Generation of Mutagenic Phage Display Antibody Libraries for AffinityMaturation,Int.J.Mol.Sci,20:1861，其内容均通过引用整体并入本文。
在某些实施例中，该方法进一步包括(i)确定特异性结合靶标的抗原结合结构域变体的核酸序列。
在某些实施例中，进一步随机化的抗原结合结构域变体包含至少一个或至少两个随机化的CDR，该至少一个或至少两个随机化的CDR先前未在第一文库中随机化。可执行多轮随机化(即，除了在VL中的91位处、94位处和/或96位处以及任选地VH中的95位处之外)、筛选和选择，直至获得对靶标具有足够亲和力的抗原结合结构域变体。因此，在某些实施例中，步骤(e)-(h)或步骤(e)-(i)重复一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或超过十次，以便识别特异性结合第一靶配体的抗原结合结构域变体。在一些实施例中，已经过两轮或更多轮随机化、筛选和选择的抗原结合结构域变体以至少与已经过一轮随机化、筛选和选择的抗原结合结构域变体的亲和力一样高的亲和力结合靶标。
可通过本领域已知的任何技术来筛选本文所述的抗原结合结构域变体的文库，以用于进化特异性结合靶配体的新的或改进的结合蛋白。在某些实施例中，靶配体固定在固体支持物(诸如，柱树脂或微量滴定板孔)上，并且靶配体与候选多特异性抗原结合蛋白的文库(例如本文所述的任何文库)接触。选择技术可为例如，噬菌体展示(Smith(1985)Science 228,1315-1317)、mRNA展示(Wilson等人(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:3750-3755)细菌展示(Georgiou等人(1997)Nat Biotechnol 15:29-34)、酵母展示(Boder和Wittrup(1997)Nat.Biotechnol.15:553-5577)或核糖体展示(Hanes和Plückthun(1997)Proc Natl Acad Sci U S A 94:4937 4942以及WO2008/068637)。
在某些实施例中，抗原结合结构域变体的文库为噬菌体展示文库。在某些实施例中，提供了展示本文所述的抗原结合结构域变体的噬菌体颗粒。在某些实施例中，提供了展示本文所述的抗原结合结构域变体的噬菌体颗粒，该抗原结合结构域变体能够与靶配体结合。
噬菌体展示是一种技术，通过该技术将多个多特异性抗原结合蛋白变体展示为与噬菌体颗粒的表面上的外壳蛋白融合的融合蛋白(Smith,G.P.(1985)Science,228:1315-7；Scott,J.K.和Smith,G.P.(1990)Science 249:386；Sergeeva,A.等人(2006)Adv.DrugDeliv.Rev.58:1622-54)。噬菌体展示的效用在于如下事实，即可以迅速且有效地对选择性随机化的蛋白质变体(或随机克隆的cDNA)的大型文库进行分类，以寻找与靶分子进行高亲和力结合的那些序列。
在噬菌体上的多肽(Cwirla,S.E.等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378)或蛋白质(Lowman,H.B.等人(1991)Biochemistry,30:10832；Clackson,T.等人(1991)Nature,352:624；Marks,J.D.等人(1991),J.Mol.Biol.,222:581；Kang,A.S.等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363)文库的展示已用于从数百万的多肽或寡肽筛选具有特异性结合特性的多肽或寡肽(Smith,G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.,2:668；Wu等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA.May 95,6037-42)。多价噬菌体展示方法已用于通过与丝状噬菌体的基因III或基因VIII融合来展示小随机肽和小蛋白质。(Wells和Lowman,Curr.Opin.Struct.Biol.,3:355-362(1992)，以及其中引用的参考文献。)在单价噬菌体展示中，蛋白质或肽文库与基因III或其一部分融合，并在野生型基因III蛋白质的存在下以低水平进行表达，使得噬菌体颗粒展示融合蛋白的一个拷贝或不展示融合蛋白的任何拷贝。相对于多价噬菌体，活动性效应降低，使得分选基于内在配体亲和力，并使用噬菌粒载体，这简化了DNA操作。(Lowman和Wells,Methods:A companion to Methods inEnzymology,3:205-0216(1991)。)
对抗原结合结构域变体的噬菌体文库进行分选需要大量变体的构建和繁殖、使用靶配体进行亲和纯化的程序以及评估结合富集的结果的手段(参见例如US 5223409、US5403484、US 5571689和US 5663143)。
大多数噬菌体展示方法使用丝状噬菌体(例如M13噬菌体)。λ形噬菌体展示系统(参见WO1995/34683,US 5627024)、T4噬菌体展示系统(Ren等人(1998)Gene 215:439；Zhu等人(1998)Cancer Research,58:3209-3214；Jiang等人(1997)Infection&Immunity,65:4770-4777；Ren等人(1997)Gene,195:303-311；Ren(1996)Protein Sci.,5:1833；Efimov等人(1995)Virus Genes,10:173)以及T7噬菌体展示系统(Smith和Scott(1993)Methods inEnzymology,217:228-257；US.5766905)也是已知的。
现在已经开发了基本噬菌体展示概念的许多其他改进和变体。这些改进增强了展示系统筛选肽文库以用于与所选靶分子结合的能力，以及展示具有以下潜力的功能性蛋白的能力：筛选这些蛋白质的所需特性。已经开发了用于噬菌体展示反应的组合反应装置(WO1998/14277)，并且噬菌体展示文库已用于分析和控制双分子相互作用(WO 1998/20169；WO1998/20159)和受约束的螺旋肽的特性(WO 1998/20036)。WO 1997/35196描述了一种分离亲和配体的方法，其中噬菌体展示文库与一种溶液(其中配体将与靶分子结合)和另一种溶液(其中亲和配体将不与靶分子结合)接触，以选择性分离结合配体。WO 1997/46251描述了一种方法，该方法用亲和纯化的抗体对随机噬菌体展示文库进行生物淘选，然后分离结合噬菌体，随后使用微板孔进行微淘选处理以分离高亲和力结合噬菌体。此类方法可应用于本文所公开的抗原结合结构域变体的文库。金黄色葡萄球菌蛋白A作为亲和标签的用途也已有报道(Li等人(1998)Mol Biotech.9:187)。WO 1997/47314描述了使用组合文库(可为噬菌体展示文库)来区分酶特异性的底物消减文库的用途。US 5498538、US 5432018和WO1998/15833中描述了选择特异性结合蛋白的其他方法。US 5723286、US 5432018、US5580717、US 5427908、US 5498530、US 5770434、US 5734018、US 5698426、US 5763192和US5723323中还公开了产生肽文库和筛选这些文库的方法。
示例性抗原/靶分子
可由使用本文提供的方法产生的抗体(例如，双特异性或多特异性抗体)来靶向的分子的实例包括但不限于可溶性血清蛋白及其受体和其他膜结合蛋白(例如，粘附素)。在另一个实施例中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白能够结合选自由以下项组成的组的一种、两种或更多种细胞因子、细胞因子相关蛋白和细胞因子受体：8MPI、8MP2、8MP38(GDFIO)、8MP4、8MP6、8MP8、CSFI(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(αFGF)、FGF2(βFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF1 0、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、g1
IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFN81、IFNG、IFNWI、FEL1、FEL1(EPSELON)、FEL1(ZETA)、IL 1A、IL 1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL1 0、IL 11、IL 12A、IL12B、IL 13、IL 14、IL 15、IL 16、IL 17、IL 17B、IL 18、IL 19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBb3、LTA(TNF-β)、LTB、TNF(TNF-α)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、HGF(VEGFD)、VEGF、VEFGA、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL 11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦蛋白)、PTN和THPO。
在另一个实施例中，靶分子为选自由以下项组成的组的趋化因子、趋化因子受体或趋化因子相关蛋白：CCLI(1-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-Iα)、CCL4(MIP-Iβ)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL 13(MCP-4)、CCL 15(MIP-Iδ)、CCL 16(HCC-4)、CCL 17(TARC)、CCL 18(PARC)、CCL 19(MDP-3b)、CCL20(MIP-3α)、CCL21(SLC/exodus-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCLI(GROI)、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL 10(IP 10)、CXCL 11(1-TAC)、CXCL 12(SDFI)、CXCL 13、CXCL14、CXCL 16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL 1(SCYDI)、SCYEI、XCLI(淋巴细胞趋化因子)、XCL2(SCM-Iβ)、BLRI(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCRI(CKRI/HM145)、CCR2(mcp-IRBIRA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBII)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Rα)、IL8RB(IL8Rβ)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HDF1、HDF1α、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2和VHL。
在另一个实施例中，使用本文提供的方法产生的抗体(例如，双特异性或多特异性抗体)能够结合一个或多个选自由以下项组成的组的靶标：ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；聚集蛋白聚糖；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；ANGPTL；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；AZGP1(锌-a-糖蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF(BLys)；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLRI(MDR15)；BMP1；BMP2；BMP3B(GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B；BMPR2；BPAG1(网蛋白)；BRCA1；C19orf10(IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2(D6/JAB61)；CCL1(1-309)；CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)；CCL13(MCP-4)；CCL15(MIP1δ)；CCL16(HCC-4)；CCL17(TARC)；CCL18(PARC)；CCL19(MIP-3β)；CCL2(MCP-1)；MCAF；CCL20(MIP-3α)；CCL21(MTP-2)；SLC；exodus-2；CCL22(MDC/STC-1)；CCL23(MPIF-1)；CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)；CCL25(TECK)；CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)；CCL27(CTACK/ILC)；CCL28；CCL3(MTP-Iα)；CCL4(MDP-Iβ)；CCL5(RANTES)；CCL7(MCP-3)；CCL8(mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1(CKRI/HM145)；CCR2(mcp-IRβ/RA)；CCR3(CKR/CMKBR3)；CCR4；CCR5(CMKBR5/ChemR13)；CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKBR7/EBI1)；CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9(GPR-9-6)；CCRL1(VSHK1)；CCRL2(L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD22；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A；CD79B；CDS；CD80；CD81；CD83；CD86；CDH1(E-钙粘蛋白)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A(p21/WAF1/Cip1)；CDKN1B(p27/Kip1)；CDKN1C；CDKN2A(P16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；几丁质酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7(claudin-7)；CLN3；CLU(丛生蛋白)；CMKLR1；CMKOR1(RDC1)；CNR1；COL 18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；CR2；CRP；CSFI(M-CSF)；CSF2(GM-CSF)；CSF3(GCSF)；CTLA4；CTNNB1(b-连环蛋白)；CTSB(组织蛋白酶B)；CX3CL1(SCYDI)；CX3CR1(V28)；CXCL1(GRO1)；CXCL10(IP-10)；CXCL11(I-TAC/IP-9)；CXCL12(SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2(GRO2)；CXCL3(GRO3)；CXCL5(ENA-78/LIX)；CXCL6(GCP-2)；CXCL9(MIG)；CXCR3(GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCLI；DPP4；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EPO；ERBB2(Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；F3(TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FGF；FGF1(αFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2(bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3(int-2)；FGF4(HST)；FGF5；FGF6(HST-2)；FGF7(KGF)；FGF8；FGF9；FGFR3；FIGF(VEGFD)；FELl(EPSILON)；FILl(ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRTI(纤连蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1(FRA-1)；FY(DARC)；GABRP(GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNASI；GNRHI；GPR2(CCR10)；GPR31；GPR44；GPR81(FKSG80)；GRCCIO(C10)；GRP；GSN(凝溶胶蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HOP1；组胺和组胺受体；HLA-A；HLA-DRA；HM74；HMOXI；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；1D2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；DFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-l；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；ILIF10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2、ILIRN；IL2；IL20；IL20RA；IL21 R；IL22；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST(糖蛋白130)；EL7；EL7R；EL8；IL8RA；DL8RB；IL8RB；DL9；DL9R；DLK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；ERAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6(a6整合蛋白)；ITGAV；ITGB3；ITGB4(b4整合蛋白)；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5(GC Box BP)；KLF6；KLKIO；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19(角蛋白19)；KRT2A；KHTHB6(毛发特异性H型角蛋白)；LAMAS；LEP(瘦蛋白)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA(TNF-b)；LTB；LTB4R(GPR16)；LTB4R2；LTBR；MACMARCKS；MAG或OMgp；MAP2K7(c-Jun)；MDK；MIB1；中期因子；MEF；MIP-2；MKI67；(Ki-67)；MMP2；MMP9；MS4A1；MSMB；MT3(金属硫蛋白-111)；MTSS1；MUC1(粘蛋白)；MYC；MY088；NCK2；神经黏蛋白；NFKB1；NFKB2；NGFB(NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66(Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1(NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR112；NR113；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZI；OPRD1；P2RX7；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；POGFA；POGFB；PECAM1；PF4(CXCL4)；PGF；PGR；磷酸蛋白聚糖；PIAS2；PIK3CG；PLAU(uPA)；PLG；PLXDC1；PPBP(CXCL7)；PPID；PRI；PRKCQ；PRKDI；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA；PTAFR；PTEN；PTGS2(COX-2)；PTN；RAC2(p21 Rac2)；RARB；RGSI；RGS13；RGS3；RNF110(ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2(亲脂性蛋白B)；SCGB2A1(乳腺球蛋白2)；SCGB2A2(乳腺球蛋白1)；SCYEI(内皮细胞-单核细胞激活细胞因子)；SDF2；SERPINA1；SERPINA3；SERP1NB5(乳腺丝抑蛋白)；SERPINE1(PAI-1)；SERPDMF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPPI；SPRR1B(Sprl)；ST6GAL1；STABI；STAT6；STEAP；STEAP2；TB4R2；TBX21；TCPIO；TOGFI；TEK；TGFA；TGFBI；TGFB1II；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBRI；TGFBR2；TGFBR3；THIL；THBSI(血小板反应蛋白-1)；THBS2；THBS4；THPO；TIE(Tie-1)；TMP3；组织因子；TLR1；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TLR10；TNF；TNF-a；TNFAEP2(B94)；TNFAIP3；TNFRSFIIA；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6(Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10(TRAIL)；TNFSF11(TRANCE)；TNFSF12(AP03L)；TNFSF13(April)；TNFSF13B；TNFSF14(HVEM-L)；TNFSF15(VEGI)；TNFSF18；TNFSF4(OX40配体)；TNFSF5(CD40配体)；TNFSF6(FasL)；TNFSF7(CD27配体)；TNFSFS(CD30配体)；TNFSF9(4-1BB配体)；TOLLIP；Toll样受体；TOP2A(拓扑异构酶Ea)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TRPC6；TSLP；TWEAK；VEGF；VEGFB；VEGFC；多功能蛋白聚糖；VHL C5；VLA-4；XCL1(淋巴细胞趋化因子)；XCL2(SCM-1b)；XCRI(GPR5/CCXCRI)；YY1；和ZFPM2。
使用本文提供的方法产生的抗体(例如，双特异性或多特异性抗体)的优选分子靶标分子包括：CD蛋白，诸如CD3、CD4、CDS、CD16、CD19、CD20、CD34、CD64、CD200；ErbB受体家族的成员，诸如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，诸如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整合蛋白和αv/β3整合蛋白，包括其α或β亚基(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子，诸如VEGF-A、VEGF-C；组织因子(TF)；α干扰素(αIFN)；TNFα，白介素，诸如IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-S、IL-9、IL-13、IL 17 AF、IL-1S、IL-13Rα1、IL13Rα2、IL-4R、IL-5R、IL-9R、IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；RANKL、RANK、RSV F蛋白、蛋白C等。
在一个实施例中，使用本文提供的方法产生的抗体(例如，双特异性或多特异性抗体)结合低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-1或LRP-8或转铁蛋白受体以及选自由以下项组成的组的至少一种靶标：1)β-分泌酶(BACE1或BACE2)、2)α-分泌酶、3)γ-分泌酶、4)τ-分泌酶、5)淀粉样前体蛋白(APP)、6)死亡受体6(DR6)、7)淀粉样β肽、8)α-突触核蛋白、9)帕金蛋白、10)亨廷顿蛋白、11)p75 NTR和12)半胱天冬酶-6
在一个实施例中，使用本文提供的方法而产生的抗体(例如，双特异性或多特异性抗体)与选自由以下项组成的组的至少两种靶分子结合：IL-1α和IL-1β、IL-12和IL-1S；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-5和IL-4；IL-13和IL-1β；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MEF；IL-13和TGF-～；IL-13和LHR激动剂；IL-12和TWEAK、IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAMS、IL-13和PED2、IL17A和IL 17F、CD3和CD19、CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD3S和CD13S；CD3S和CD20；CD3S和CD40；CD40和CD20；CD-S和IL-6；CD20和BR3、TNFα和TGF-β、TNFα和IL-1β；TNFα和IL-2、TNFα和IL-3、TNFα和IL-4、TNFα和IL-5、TNFα和IL6、TNFα和IL8、TNFα和IL-9、TNFα和IL-10、TNFα和IL-11、TNFα和IL-12、TNFα和IL-13、TNFα和IL-14、TNFα和IL-15、TNFα和IL-16、TNFα和IL-17、TNFα和IL-18、TNFα和IL-19、TNFα和IL-20、TNFα和IL-23、TNFα和IFNα、TNFα和CD4、TNFα和VEGF、TNFα和MIF、TNFα和ICAM-1、TNFα和PGE4、TNFα和PEG2、TNFα和RANK配体、TNFα和Te38、TNFα和BAFF、TNFα和CD22、TNFα和CTLA-4、TNFα和GP130、TNF a和IL-12p40、VEGF和HER2、VEGF-A和HER2、VEGF-A和PDGF、HER1和HER2、VEGFA和ANG2、VEGF-A和VEGF-C、VEGF-C和VEGF-D、HER2和DR5、VEGF和IL-8、VEGF和MET、VEGFR和MET受体、EGFR和MET、VEGFR和EGFR、HER2和CD64、HER2和CD3、HER2和CD16、HER2和HER3；EGFR(HER1)和HER2、EGFR和HER3、EGFR和HER4、IL-14和IL-13、IL-13和CD40L、IL4和CD40L、TNFR1和IL-1R、TNFR1和IL-6R和TNFR1和IL-18R、EpCAM和CD3、MAPG和CD28、EGFR和CD64、CSPGs和RGM A；CTLA-4和BTN02；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；MAG和RGM A；NgR和RGM A；NogoA和RGM A；OMGp和RGMA；POL-l和CTLA-4；以及RGM A和RGM B。
任选地与其他分子缀合的可溶性抗原或其片段可以用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子，例如受体、其片段(例如，受体的细胞外结构域)可以用作免疫原。可替代地，可以将表达跨膜分子的细胞用作免疫原。此类细胞可衍生自天然来源(例如癌细胞系)，或者可为已经通过重组技术转化以表达跨膜分子的细胞。可用于制备抗体的其他抗原及其形式对于本领域技术人员将是显而易见的。
活性测定
使用本文提供的方法产生的抗体(例如，双特异性或多特异性抗体)可通过本领域已知的各种测定来表征其物理/化学特性和生物学功能。此类测定包括但不限于N末端测序、氨基酸分析、非变性尺寸排阻高压液相色谱(HPLC)、质谱、离子交换色谱和木瓜蛋白酶消化。
在某些实施例中，分析使用本文提供的方法产生的抗体(例如，双特异性或多特异性抗体)的生物活性。在一些实施例中，测试使用本文提供的方法产生的抗体(例如，双特异性或多特异性抗体)的抗原结合活性。本领域已知并可用于本文的抗原结合测定包括但不限于使用诸如蛋白质印迹等的任何直接或竞争性结合测定、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫分析和蛋白A免疫分析。
前述书面描述被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。提供以下实例仅用于说明性目的并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。实际上，除了本文示出和描述的那些之外，根据前述描述，各种修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。
实例
实例1：方法和材料
抗体构建体设计和合成
以下实例中的所有抗体均使用Kabat(Kabat等人，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest.”Bethesda,MD:NIH,1991)和EU(Edelman等人，“The covalentstructure of an entire gammaG immunoglobulin molecule.”Proc Natl Acad Sci U SA 1969；63:78-85)编号系统来分别对可变结构域和恒定结构域进行编号。抗体构建体通过基因合成来生成，并且只要适用，将该抗体构建体亚克隆到表达质粒(pRK5)中，如先前所述(Dillon等人，“Efficient production of bispecific IgG ofdifferent isotypes and species of origin in single mammalian cells.”MAbs2017；9:213-30)。本研究中的所有抗体HC均被去糖基化(N297G突变)并删除了羧基末端赖氨酸(ΔK447)，以减少产物异质性，从而有助于通过LCMS对BsIgG进行准确定量(Dillon等人，下同；Yin等人“Precise quantification of mixtures of bispecific IgG produced insingle host cells by liquid chromatography-Orbitrap high-resolution massspectrometry.”MAbs 2016；8:1467-76)。本研究中所有BsIgG的两种组分HC经工程化以包含第一所列出的抗体中的“杵”突变(例如，T366W)或第二所列出的抗体中的“臼”突变(例如，T366S:L368A:Y407V)，以促进HC异源二聚化(Atwell等人“Stable heterodimers fromremodeling the domain interface of ahomodimer using a phage display library.JMol Biol 1997；270:26-35)。
对于本研究中的一些BsIgG，审慎地进行了FR突变，以在正确配对和错误配对的BsIgG种类之间提供足够的质量差，以用于通过LCMS分析进行更准确的定量。准确定量双特异性IgG产率所需的质量差≤118Da(Yin等人，下同)。具体地，当与抗CD3或变体(在表A中)、抗IL-1β或抗GFRα(表B)组合时，抗体和突变为抗HER2 VL R66G；当与抗ANG2或变体(在表F中)组合时，抗体和突变为抗VEGFA VL F83A；当与抗因子D 25D7 v1或抗IL-33或抗HER2(在表G2中)组合时，抗体和突变为抗CD3 VL N34A:F83A；当与抗CD3结合时，抗体和突变为抗RSPO3 VL F83A；当与抗SIRPα或抗因子D 20D12 v1组合时，抗体和突变为抗EGFR VL F83A；加上当与抗GFRα1(表B或图1A-1F)组合时，抗体和突变为抗IL-4VL N31A:F83A。基于与亲本抗体的比较，所选残基对BsIgG产率没有可检测的影响。
抗体表达与纯化
所有BsIgG在HEK293衍生的细胞中瞬时表达，如先前所述(Dillon等人，同上)。将对应于两种LC和两种HC的四个质粒共转染至细胞(ThermoFisher Scientific)中。每个实验的LC DNA均不同，并且报道了具有最佳HC:LC比率的最高双特异性产率，如先前所述(Dillon等人，同上)。两种HC的比率固定为1:1。转染的细胞培养物(30mL)在37℃下振荡生长7天。来自经过滤的细胞培养上清液的BsIgG通过蛋白A亲和色谱法(AF-rProtein A,Tosoh Bioscience)以高通量方式进行纯化。通过使用SEC-300柱(10mm×300mm，3μm粒径，Sepax Technology)的尺寸排阻色谱法来移除杂质，诸如聚集体和半IgG1。使用1.5的消光系数A0.1％ 280nm来计算IgG1浓度。在蛋白A色谱法之后，将蛋白质浓度乘以洗脱体积来估计纯化产率。
通过SECHPLC对BsIgG进行分析表征
BsIgG样品(20μL)在等度条件下经由尺寸排阻色谱法在连接至HPLC柱(UltiMate 3000,Thermo Fisher Scientific)的SuperSW3000柱(4.6×150mm,4μm)(Tosoh Bioscience)上进行色谱分离。流动相为pH 7.2的200mM磷酸钾和250mM氯化钾，流速为0.3mL/min，在280nm波长处进行吸光度测量。
通过高分辨率LCMS来确定BsIgG产率
如先前所述，经由质谱法(Thermo FisherPlus Extended MassRange)来对BsIgG产率(正确配对的LC种类相对于所有三个错误配对的IgG1种类的强度)执行定量，并且假设在不同质量峰之间没有应答偏差(参见Yin等人，下同)。
对于变性质谱，将样品(3μg)注射至使用Dionex3000快速分离液相色谱(RSLC)系统加热至80℃的反相液相色谱柱(Thermo FisherScientific,2.1mm×50mm)上。使用二元梯度泵以300μL/min的速度在4.5min内递送溶剂A(包含0.1％甲酸和0.02％三氟乙酸的99.88％水)和溶剂B(包含9.88％水加上0.1％甲酸和0.02％三氟乙酸的90％乙腈)作为20％至65％的溶剂B的梯度。溶剂在0.1min内阶跃式变化为90％的溶剂B，并在90％处保持6.4min以清洁色谱柱。最后，在0.1min内将溶剂阶跃式变化为20％的溶剂B，并保持3.9min以用于重新平衡。样品使用以下参数、经由电喷雾电离进入质谱仪以进行在线分析，以用于数据采集：3.90kV喷雾电压；325℃毛细管温度；200S-lens射频电平；ESI源中15鞘气流速和4辅助气流速；1,500至6,000m/z的扫描范围；脱溶剂化，源内CID 100eV，CE 0；m/z 200处的分辨率为17,500；正极性；10次微扫描；3E6 AGC靶标；固定的AGC模式；0平均；25V源直流偏置；8V注射平极直流；7V平极间透镜；6V弯曲平极直流；0V转移多极直流调整偏置；0V C-Trap入口透镜调整偏置；捕集气体压力设置为2。
对于天然质谱，将样品(10μg)注射至使用Dionex3000 RSLC系统加热至30℃的AcquityBEH尺寸排阻色谱柱(Waters,4.6mm×150mm)上。等度色谱运行(10min)利用了包含50mM醋酸铵(pH 7.0，流速为300μL/min)的水性流动相。
样品使用以下参数、经由电喷雾电离进入质谱仪以进行在线分析，以用于数据采集：4.0kV喷雾电压；320℃毛细管温度；200S-lens射频电平；ESI源中4鞘气流速和0辅助气流速；300至20,000m/z的扫描范围；脱溶剂化，源内CID 100eV，CE 0；m/z 200处的分辨率为17,500；正极性；10次微扫描；1E6 AGC靶标；固定的AGC模式；0平均；25V源直流偏置；8V注射平极直流；7V平极间透镜；6V弯曲平极直流；0V转移多极直流调整偏置；0V C-Trap入口透镜调整偏置；捕集气体压力设置为2。
使用Protein Metrics Intact软件和Thermo Fisher BIOPHARMA3.0软件来分析所采集的质谱数据。来自每个样品的去卷积频谱的正确配对的LC种类的信号强度用于相对于三个错误配对的IgG1种类的定量。HC同源二聚体和半IgG或者无法检测，或者以痕量存在，从计算中排除。通过使用先前描述的代数公式，从BsIgG和双LC错误配对的IgG1的同质量混合物中估计正确的LC配对的BsIgG(参见Yin等人，下同)。
BsIgG的SDS-PAGE凝胶分析
由蛋白A和尺寸排阻色谱法纯化的BsIgG通过SDS-PAGE进行分析。在存在和不存在DTT的情况下制备样品，以分别用于分析在还原和非还原条件下的电泳迁移率。将与样品染料混合的样品在含有DTT的情况下在95℃下加热5min或者在不含DTT的情况下加热1min，然后在120V下在4-20％Tris-甘氨酸凝胶(Bio-Rad)上进行电泳。然后将凝胶用GELCODETM蓝色蛋白染色液(Thermo Fisher Scientific)进行染色并且在水中脱色。为每个样品装载等量的蛋白质(6μg)。
动力学结合实验
在BIAcore T200仪器(GE Healthcare)上使用表面等离子体共振来执行动力学结合实验。抗Fab(GE Healthcare)被固定[约12000共振单位(RU)]在CM5传感器芯片上。亲本和突变Fab被捕获至固定的表面上，并评估分析物的结合。使用3分钟的注射时间、50μl/min的流速在25℃的温度下，用如下分析物浓度来生成传感图：0、0.293、1.17、4.6875、18.75、75、300nM HER2-ECD(内部)和VEGF-C(Cys156Ser)(R&D Systems，目录号752-VC)；0、0.0195、0.0781、0.3125、1.25、5、20mM VEGF165(R&D Systems，目录号293-VE)和IL-13(内部)；0、0.0732、0.293、1.17、4.6875、18.75、75nM MET-R Fc(R&D Systems，目录号8614-MT)、IL-1β(R&D Systems，目录号201-LB/CF)、EGFR Fc(R&DSystems，目录号344-ER)；0、0.976、3.906、15.625、62.5、250nM生物素化CD3(内部)。在注射分析物之后监测解离900秒。所用的运行缓冲液为10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，0.003％EDTA，0.05％Tween(HBS-EP+,GE Healthcare)。每次注射10mM甘氨酸(pH 2.1)之后，芯片表面均会再生。使用双空白参考(零分析物浓度的分站和空白参考细胞)校正传感图。然后通过制造商提供的软件使用1:1Langmuir模型来分析传感图。
实例2：阐明重链/轻链配对偏好以促进单细胞中双特异性IgG的组装
前言
在此处描述的研究中，高通量生产和高分辨率LCMS分析(Dillon等人“Efficientproduction of bispecific IgG of different isotypes and species of origin insingle mammalian cells.”MAbs 2017；9:213-30；Yin等人Precise quantification ofmixtures of bispecific IgG produced in single host cells by liquidchromatography-Orbitrap high-resolution mass spectrometry.”MAbs 2016；8:1467-76)用于调查99个不同的抗体对，该抗体对含有杵臼结构HC但不含Fab突变，以用于BsIgG的产率。三分之一的抗体对显示出高(>65％)BsIgG产率，与强固有同源HC/LC链配对偏好一致。对于此类抗体对，在两个CH1/CL结构域界面处安装先前确定的电荷突变(Dillon等人，“Efficient production of bispecific IgG of different isotypes and species oforigin in single mammalian cells.”MAbs 2017；9:213-30)以增强BsIgG的生产。接下来，我们研究了BsIgG的高产率是否需要一个或两个臂中的同源链配对偏好。突变分析用于识别CDR H3和L3中有助于高BsIgG产率的特异性残基。然后将CDR H3和L3以及所识别的特异性残基插入其他可用的、不相关的抗体中(该抗体显示随机HC/LC链配对)，以确定它们对BsIgG产率的影响。最后，突变分析用于研究链间二硫键对BsIgG的产率的影响。
组成抗体对对于BsIgG产率的影响
先前，对于两种双特异性抗体(即抗EGFR/MET和抗IL-13/IL-4)，观察到在含有杵臼结构重链(HC)突变但不含Fab臂突变的情况下的BsIgG的高产率(>65％)(Dillon等人，下同)。为了研究同源重链/轻链(HC/LC)配对偏好的强度和发生频率，使用较大的抗体对组合(n＝99)以产生BsIgG。为简单起见，本研究中的所有双特异性抗体均用人IgG1HC恒定结构域来进行构建。六种与IL-13、IL-4、MET、EGFR、HER2或CD3结合的抗体(Dillon等人，下同)用于构建所有15种可能的BsIgG1的基质。接下来，这六种抗体被主要为κLC同种型的14种额外抗体置换，其中该LC同种型为三种λLC同种型(抗DR5、抗α5β1，抗RSPO2)(参见下面的表A)。在表A中，通过使用专有比对工具将LC和HC序列与人抗体种系基因谱系进行比较来识别种系基因家族。报道了与种系基因区段最接近的匹配。本研究中使用的所有抗体均为人源化抗体，除了三种完全人抗体(抗CD33、抗PDGF-C、抗Flu B)。
表A：针对LC/HC配对偏好而评估的不同抗体的种系基因家族和LC同种型分析。
KV＝κ可变；LV＝λ可变，HV＝重链可变；na＝不可用。
1.Merchant M,Ma X,Maun HR,Zheng Z,Peng J,Romero M,Huang A,Yang NY,Nishimura M,Greve J等人，Monovalent antibody design and mechanism of action ofonartuzumab,a MET antagonist with anti-tumor activity as a therapeuticagent.Proc Natl Acad Sci U S A 2013；110:E2987-96。
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接下来，下面表B中显示的抗体对以优化的链比率在HEK293衍生的细胞中共表达，并且BsIgG的产率用先前描述的方法的改进版本来进行确定(参见Dillon等人、Yin等人，下同)。没有抗体对包含Dillon等人(下同)描述的Fab突变。所有双特异性抗体对均包含用于重链异源二聚化的杵臼结构突变。
在抗体对的共表达和蛋白A色谱法之后，纯化的IgG1池通过尺寸排阻色谱法(SEC)进行进一步纯化，以移除在由高分辨率LCMS定量之前存在的任何少量聚集体和半IgG1。使用先前开发的代数公式(参见Yin等人，下同)来估计在也包含LC-错义IgG1的同质量(即，相同分子质量)混合物中正确组装的BsIgG的产率。表B中显示的数据为来自优化的LC DNA比率的BsIgG的产率。BsIgG产率>65％以粗体表示。mAb-1的HC包含“臼”突变(T366S:S368A:Y407V)，并且mAb-2的HC包含“杵”突变(T366W)(Atwell等人“Stable heterodimers fromremodeling the domain interface of a homodimer using a phage displaylibrary.”J Mol Biol 1997；270:26-35)。
表B：用于研究BsIgG产率的半抗体对
NA＝不适用；单特异性抗体。
99个独特抗体对的BsIgG1的产率在很大范围内变化：22％-95％(参见表B)。引人注目的是，对于大多数(>80％)的抗体对，观察到了非随机HC/LC配对(>30％的BsIgG1的产率)；对于33个和48个抗体对，分别看到了BsIgG1的高(>65％)产率和中间(30％-65％)产率。测量了两个抗体对(抗MET/DR5和抗IL-13/DR5)的BsIgG1的近定量(>90％)形成。
图1A-1F显示了用于BsIgG1的低产率(<30％，例如抗LGR5/IL-4，参见图1A和1B)、中间产率(30％-65％，例如抗SIRPα/IL-4，参见图1C和1D)和高产率(>65％，例如抗MET/DR5，参见图1E和1F)的代表性实例的高分辨率LCMS数据。相应的抗体对被瞬时共转染至HEK293衍生的细胞中。在通过高分辨率LCMS定量BsIgG1产率之前，IgG1种类通过蛋白A色谱法和尺寸排阻色谱法进行纯化，如Dillon等人(下同)和Yin等人(下同)所述。图1A、1C和1E所示的数据为电荷状态38+和39+的质量包络，并且图1B、1D和1F显示了相应的去卷积数据并且提供了代表不同IgG1种类存在的示意图。
所研究的每种抗体的BsIgG1产率在很大范围内变化，这取决于其配偶抗体。例如，抗MET抗体的BsIgG1产率从低至约21％(当与抗IL-33配对时)变化至高达约95％(当与抗DR5配对时)(表B)。为了研究“杵”和“臼”突变对同源HC/LC配对偏好的任何影响，使用包含mAb1中的“杵”突变和mAb2中的“臼”突变的HC来产生BsIgG1，反之亦然(表B)。在所有测试的情况(n＝15)下，BsIgG1的产率受哪个HC包含“杵”和“臼”突变的影响最小(表B)。通过蛋白A色谱法从30mL培养物中回收的IgG种类变化超过约5倍(1.5mg至8.0mg)
上述结果表明，不含Fab突变的BsIgG1的高产率为常见现象，这取决于组成抗体对
CH1/CL界面电荷突变对具有同源HC/LC配对偏好的抗体对的BsIgG1的产率的影响
先前，与杵臼结构HC突变联合的所有四个结构域/结构域界面处的突变的组合(即，VH/VL两者和CH1/CL两者)用于在单个哺乳动物宿主细胞中的不同同种型的BsIgG的近定量组装(参见Dillon等人，下同)。在此，识别出给予BsIgG1的高产率而不含任何Fab突变的抗体对(表B)。这些抗体对的可变结构域序列不同，而恒定域(即IgG1 CH1和k CL)在大多数情况下是相同的。假设对于此类抗体对，仅在两个CH1/CL界面处的突变便可能足以将正确组装的双特异性抗体的产率增强至约100％。选择了十一个不同的抗体对，并且在存在或不存在先前报道的CH1/CL结构域界面电荷突变的情况下比较BsIgG1的产率(参见Dillon等人，下同)。具体地，“杵”臂用CL V133E和CH1 S183K突变进行工程化，并且“臼”臂用CLV133K和CH1 S183E突变进行工程化(参见Dillon等人，下同)。两个CH1/CL界面处的电荷突变使所有抗体对的BsIgG1产率增加了约12％-34％，在大多数(9/11)情况下增加至≥90％BsIgG1产率(图2)。对于图2中的电荷对变体，该对中的第一所列出的抗体包含CL V133E和CH1S183K突变，并且第二所列出的抗体包含CL V133K和CH1 S183E突变(参见Dillon等人，下同)。BsIgG1的90％产率由图2中的虚线水平线表示。CLV133E和CH1 S183K突变不影响抗体对其靶抗原的亲和力(数据未显示)。
在BsIgG的一个臂中的同源HC/LC配对偏好对BsIgG的产率的影响
研究了一些抗体对的所观察到的BsIgG1的高产率的机理基础。针对本研究，选择了两个抗体对，即抗EGFR/MET和抗IL-4/IL-13，这基于它们的BsIgG1产率高且不含Fab突变(参见表B和Dillon等人，下同)。先验地，一个或两个Fab可能表现出同源HC/LC配对偏好，这有助于BsIgG1的高产率。进行了三个链共表达实验以区分这些可能性。具有“杵”或“臼”突变的单个HC(HC1)在Expi293FTM细胞中与其同源LC(LC1)和竞争性非同源LC(LC2)瞬时共表达(图3)。图3中的星号表示HC中存在“杵”或“臼”突变。(抗EGFR、抗IL13和抗HER2的HC包含“杵”突变(T366W)，而抗MET、抗IL4和抗CD3的HC包含“臼”突变(T366S:S368A:Y407V)(参见Atwell等人，“Stable heterodimers from remodeling the domain interface of ahomodimer using a phage display library.J Mol Biol 1997；270:26-35)。)通过蛋白A亲和色谱法和由高分辨率LCMS评估的同源和非同源HC/LC配对的程度，从相应的细胞培养上清液中纯化得到的半IgG种类(参见Dillon等人、Yin等人，下同)。同源HC/LC配对的百分比通过定量半IgG1种类来进行计算。
如下面的表C所示，与非同源抗EGFR LC相比，抗MET HC显示出对其同源LC的强烈偏好(约71％)，而与非同源抗MET LC相比，抗EGFR HC仅显示出对其同源LC的轻微偏好(约56％)。与非同源抗IL-4LC相比，抗IL-13HC显示出对其同源LC的强烈偏好(81％)，而抗IL-4HC未显示出对其同源LC的偏好(49％)。这些数据与以下观点一致，即抗EGFR/MET的高BsIgG1产率分别由抗MET和抗EGFR抗体的强和弱同源HC/LC配对偏好产生。相反，抗IL-13/IL-4的高BsIgG1产率显然反映了单独的抗IL-13抗体的强同源HC/LC配对偏好。因此，一个或两个臂中的同源HC/LC配对偏好对于在单个细胞中的BsIgG1的高产率显然是足够的，而无需Fab突变。
表C：共表达后的抗体同源链偏好的定量。
抗HER2/CD3被选为本研究的对照，这基于它的BsIgG1的低产率(参见表B和Dillon等人，下同)。与非同源抗CD3 LC相比，抗HER2 HC未显示出对其同源LC的配对偏好。类似地，与非同源抗HER2 LC相比，抗CD3 HC未显示出对其同源LC的配对偏好(参见表C)。
当在单个宿主细胞中共表达时，也评估了HC与其同源轻链(LC)或非同源LC的配对。简而言之，将每个HC与其同源LC或非同源LC共转染至HEK293衍生的细胞中。IgG1和半IgG1种类通过蛋白A色谱法从细胞培养上清液中进行纯化，并通过LC-MS进行分析。(Labrijn等人“Efficient generation of stable bispecific IgG1 bycontrolled Fab-arm exchange.”Proc Natl Acad Sci U S A 2013；110:5145-50；SpiessC等人“Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-cultureof bacteria expressing two distinct half-antibodies.”Nat Biotechnol 2013；31:753-8)。同源HC/LC配对的百分比通过定量半IgG1种类来进行计算。通过将抗体浓度乘以从高通量蛋白A色谱法步骤中获得的洗脱体积来估计蛋白质表达产率。抗EGFR、抗IL-13和抗HER2的HC含有“杵”突变(T366W)，而抗MET、抗IL-4和抗CD3的HC含有“臼”突变(T366S:S368A:Y407V)(参见Spiess等人“Alternative molecular formats and therapeuticapplications for bispecific antibodies.”Mol Immunol 2015；67:95-106)。在不存在竞争的情况下，根据所测试的所有六个不同的错配HC/LC对来判断，HC可与非同源LC有效地进行组装(参见下面的表D)。
表D：HC与其同源轻链(LC)或非同源LC配对当在单个宿主细胞中共表达时
抗METCDRL3和CDRH3对抗EGFR/MET BsIgG1的产率的贡献
研究了在抗MET抗体中的序列决定簇，该序列决定簇有助于抗EGFR/MET BsIgG1的高双特异性产率。抗EGFR与抗MET抗体之间的氨基酸序列差异完全位于CDR加上一个额外的框架区(FR)残基，VH 94(紧邻CDR H3)内(图4)。剩余的FR，加上这些抗体的Ck和CH1恒定结构域序列，是相同的(图4)。CDR L3和H3为在抗MET抗体的VH/VL结构域界面处参与最广泛的CDR，如与其抗原复合的抗MET Fab的X射线晶体学结构所证实(蛋白质数据库(PDB)识别码4K3J)(参见Merchant等人“Monovalent antibody design and mechanism of action ofonartuzumab,a MET antagonist with anti-tumor activity as a therapeuticagent.”Proc Natl Acad Sci U S A 2013；110:E2987-96)。这些观察导致如下假设：抗MET抗体的CDR L3和H3可能有助于抗EGFR/MET BsIgG1的高双特异性产率。与该想法一致，用来自抗CD3抗体的相应序列取代抗MET抗体的CDR L3和H3导致双特异性产率显著损失(约85％至33％，图5A)。相反，取代抗EGFR/MET双特异性抗体的抗EGFR臂的CDR L3和H3两者仅导致BsIgG产率小幅降低(约85％至75％图5A)。取代抗EGFR和抗MET臂的CDR L3和H3导致随机HC/LC配对。这些数据支持以下观点，即抗MET的CDR L3和H3对所观察到的抗EGFR/METBsIgG1的高双特异性产率做出了主要贡献，而抗EGFR的CDR L3和H3做出了次要贡献。用相应的抗CD3抗体序列取代来自抗MET抗体的CDR L1和H1或CDR L2和H2对抗EGFR/MET BsIgG的双特异性产率几乎没有影响(图6)。
抗METCDR L3和CDR H3内的残基对抗EGFR/MET BsIgG1的产率的贡献
接下来，研究了抗MET抗体的CDR L3和H3内的残基，该残基有助于抗EGFR/METBsIgG1的高双特异性产率。抗MET Fab的X射线晶体学结构(PDB登录码4K3J)揭示了CDR L3和H3之间的接触残基(图7)并用于指导突变分析的残基的选择。抗MET CDR L3和H3的丙氨酸扫描诱变(Cunningham等人“High-resolution epitope mapping of hGH-receptorinteractions by alanine-scanning mutagenesis.”Science 1989；244:1081-5)用于映射有助于抗EGFR/MET BsIgG1的高双特异性产率的残基。
表E1：抗MET抗体的CDR L3和H3接触残基的丙氨酸扫描诱变
如上面的表E1所示，CDR L3中的VL Y91A突变使所测试的12个单一丙氨酸突变体中的任一者的双特异性产率的降低幅度最大(84％至57％)。CDR L3中仅有的两个丙氨酸取代，即VL Y91A:Y94A，消除了高双特异性产率(84％至23％)。因此，CDR L3残基VL Y91和Y94似乎对抗EGFR/MET BsIgG1的高双特异性产率做出了至关重要的贡献。所有突变体的表达滴度与亲本BsIgG1相当，如通过从蛋白A色谱中回收的产率所估计的(数据未显示)。表E1中显示的数据代表使用优化的HC/LC DNA比率的两个独立实验的±标准偏差(参见表B)。
表E1中的亲本抗MET Fab、和抗MET Fab变体的子集对MET的亲和力经由表面等离子体共振(SPR)来确定。缔合速率(kon)、解离速率(koff)和结合亲和力(KD)显示在表E2中(n.d.表示未检测到结合)。CDR L3中的P95A取代不影响抗MET Fab变体与MET的结合。CDRL3中的其他单一丙氨酸取代在不同程度上降低了亲和力。对于在CDR L3中具有Y91A:Y94A或Y91A:W96A双取代的抗Met Fab变体，未检测到与抗原的结合。
表E2
抗IL13CDR L3和CDR H3对抗IL13/IL14 BsIgG1的产率的贡献
鉴于发现抗MET抗体的CDR L3中的特异性残基对于抗EGFR/MET BsIgG1的高双特异性产率很重要，假定类似的原理可适用于抗IL-13抗体，以有助于抗IL-13/IL-4BsIgG1的高双特异性产率。使用类似的实验策略以研究该可能性。这两个抗体对之间的一个显著差异为抗IL-13和抗IL-4抗体在它们的CDR和FR序列两方面有所不同(图8)，而抗MET和抗EGFR抗体具有相同的FR序列(除了VH 94)而在它们的CDR序列方面有所不同(图4)。
用来自抗CD3抗体的相应序列取代抗IL-13抗体的CDR L3和H3导致抗IL-13/IL-4BsIgG1的双特异性产率的显著损失(约72％至37％，图5B)。相反，当以类似方式取代抗IL-4抗体的CDR L3和H3时，观察到轻微增加(图5B)。这些结果表明，抗IL-13抗体的CDR L3和H3有助于抗IL-13/IL-4BsIgG1的高双特异性产率。
抗IL-13CDR L3和H3的丙氨酸扫描突变分析(Cunningham等人，下同)用于映射有助于抗IL-13/IL-4BsIgG1的高双特异性产率的残基。与IL-13复合的抗IL-13Fab的X射线晶体学结构(PDB登录码4I77，参见Ultsch等人“Structural basis of signaling blockadeby anti-IL-13 antibody lebrikizumab.”J Mol Biol 2013；425:1330-9)揭示了CDR L3和H3之间的接触残基(图9)并用于选择突变分析的残基(下方的表F1)。CDR L3突变VL R96A使CDR L3和H3的所测试的九个单一丙氨酸突变体中的任一者的双特异性产率的降低幅度最大，并消除了高双特异性产率(72％至29％)。CDR H3中仅有的两个丙氨酸取代，即VHD95A:P99A，也消除了高双特异性产率(72％至26％)。所有突变体的表达滴度与亲本BsIgG1相当，如通过从蛋白A色谱中回收的产率所估计的(数据未显示)。表F1中显示的数据代表使用优化的HC/LC DNA比率的两个独立实验的±标准偏差(参见表B)。
表F1：抗IL13抗体的CDR L3和H3接触残基的丙氨酸扫描诱变
因此，根据此处研究的抗EGFR/MET和抗IL-13/IL-4BsIgG1两者来判断，CDR L3和/或H3可能对高双特异性产率做出了至关重要的贡献。
表F1中亲本抗IL-13Fab、和抗IL-13Fab变体的子集对IL-13的亲和力经由SPR来确定。缔合速率(kon)、解离速率(koff)和结合亲和力(KD)显示在表F2中(n.d.表示未检测到结合)。CDR L3中的N92A和D94A取代均不影响抗IL-13Fab变体与IL-13的结合。CDR L3中的R96A取代导致结合亲和力损失约10倍，CDR L3中的D94:R96A双取代也是如此。CDR H3中的其他单一丙氨酸取代在不同程度上降低了亲和力。对于CDR H3中的D95A:P99A双取代，未检测到与抗原的结合。
表E2.
CDR L3和CDR H3对BsIgG1的产率的影响
接下来，执行了一系列实验以确定来自这些抗体的CDR L3和H3是否足以提供其他抗体对的高双特异性产率。选择具有低双特异性产率的两个抗体对，即抗HER2/CD3(22％-24％)和抗VEGFA/ANG2(24％)(参见表B和Dillon等人，见下文)，并且这两个BsIgG1中的每一者的一个臂的CDR L3和H3被来自抗MET或抗IL-13抗体的相应CDR序列取代。对于抗HER2/CD3(图10A)和抗VEGFA/ANG2(图10B)，在四分之三的CDR L3和H3募集情况中观察到BsIgG1的产率显著增加(从约24％至40-65％)。图10A和10B中呈现的数据来自优化的LC DNA比率。图10A和10B中的数据表明从具有同源HC/LC配对偏好的抗体中募集CDR L3和H3可增强不具有配对偏好的BsIgG1的产率，但并非总是如此。
研究了将来自抗IL-13抗体的单个关键残基募集至其他抗体中对BsIgG1产率的影响。参见下面的表G1。氨基酸编号是根据Kabat。包含可变结构域突变的抗体以粗体表示。所显示的数据来自优化的LC DNA比率。在95位处(D95)具有天冬氨酸残基的抗VEGFC未发生突变。
表G1：将来自抗IL13抗体的单个关键残基募集至其他抗体中以研究对BsIgG1产率的影响
当将对抗IL-13的配对偏好的两个或更多个关键残基移植至抗HER2、抗VEGFA或抗VEGFC抗体中的相应位置时，观察到双特异性产率有所增加，尽管小于亲本抗IL-13/IL-4BsIgG1(参见下面的表G2)。在表G2中，包含可变结构域突变的抗体以粗体表示，并且氨基酸编号是根据Kabat。包含可变结构域突变的抗体以粗体下划线文本表示。所显示的数据代表使用优化的LC DNA比率的两个独立实验的平均值±SD。在95位处(D95)具有天冬氨酸残基的抗VEGFC未发生突变。
表G2：将来自抗IL13抗体的关键残基募集至其他抗体中以研究对BsIgG1产率的影响
归结起来，这些结果表明CDR L3的94位处和96位处(Kabat编号)和CDR H3的95位处(Kabat编号)的带电荷的残基(诸如D和R)可向一些但并非所有抗体对赋予配对偏好。
经由SPR来确定表G1和G2中亲本抗HER2、抗VEGFA和抗VEGFC Fab、以及抗HER2、抗VEGFA和抗VEGFC Fab变体的子集对其各自靶标的亲和力。缔合速率(kon)、解离速率(koff)和结合亲和力(KD)显示在表G3中(n.d.表示未检测到结合)。将关键残基从抗IL13转移到其他抗体导致结合亲和力的损失。值得注意的是，抗HER2的CDR-L3中的T94D取代使抗HER2/抗CD3 BsAb的BsIgG1产率从24％增加至几乎50％，但仅使抗HER2对HER2的亲和力降低了20倍。类似地，VEGFA CDR-L3中的V94D:W96R双取代使抗VEGFA/抗ANG2 BsAb的BsIgG1产率从约22％增加至约52％，但仅使抗VEGFA对VEGFA的亲和力降低了约20倍
表G3
与表G1和G2中显示的结果相反，当将抗cMet的配对偏好的关键残基移植至抗HER2、抗VEGFA或抗VEGFC抗体的相应位置时，在大多数情况下几乎没有观察到双特异性产率的增加。参见下面的表G4。在表G4中，包含可变结构域突变的抗体以粗体表示，并且氨基酸编号是根据Kabat。
表G4：将来自抗cMet抗体的关键残基募集至其他抗体中以研究对BsIgG1产率的影响
链间二硫键对BsIgG1的产率的贡献
先前，假设HC与LC之间链间二硫键的形成充当防止链交换的动力学陷阱(Dillon等人，下同)。执行实验以研究HC与LC之间的二硫键是否影响具有明显同源链偏好的两种BsIgG1(抗EGFR/MET和抗IL-13/IL-4)的双特异性产率以及具有随机HC/LC配对的两个对照(抗HER2/CD3和抗VEGFA/VEGFC)的双特异性产率。简而言之，使用半胱氨酸至丝氨酸突变来产生缺乏链间二硫键的BsIgG1变体：LC C214S和HC C220S。通过SDS PAGE来验证工程化的变体中的链间二硫键的移除。样品在还原或非还原条件下进行电泳，如图11所示。分析了四种不同的BsIgG1：抗HER2/CD3(泳道1)；抗VEGFA/VEGFC(泳道2)；抗EGFR/MET(泳道3)；和抗IL13/IL14(泳道4)。如下面的表H所示，根据天然质谱法来判断，未发现链间二硫键影响所测试的四个抗体对中的任一者的BsIgG1产率的明确证据。亲本变体和二硫键工程化的变体的BsIgG1的产率类似。表H中的数据为使用优化的DNA轻链比率的三个生物学重复的平均值±标准偏差。
表H：突变分析以确定HC与LC之间的二硫键对BsIgG1产率的影响。
总而言之，本研究表明，在单细胞中产生BsIgG中的同源HC/LC配对偏好为常见现象，其很大程度上取决于特异性抗体对。从机制上讲，该链配对偏好可能受到CDR H3和L3中的残基的强烈影响。实际上，该配对偏好可用于减少Fab突变的数量，该Fab突变用于驱动单细胞中BsIgG1和可能的其他同种型的BsIgG的产生。
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实例3：实例2中产生的经修饰的抗体的亲和力成熟
表I中的在实例2中产生的示例性抗体经过亲和力成熟，以改进它们对各自靶抗原的亲和力。
表I
*氨基酸编号是根据Kabat。
**参见表G3。
简而言之，将突变引入表I中的抗体的CDR中，以便为每个抗体产生一个或多个多肽文库(例如，噬菌体展示文库或细胞表面展示文库)。被引入每个抗体的CDR-L3和/或CDR-H3中以改进双特异性产率(参见表I)的氨基酸取代保持固定，并且在文库构建期间未随机化。然后通过淘选或细胞分选来对每个文库进行筛选(例如，如Wark等人(2006)Adv DrugDeliv Rev.58:657 670；Rajpal等人(2005)Proc Natl Acad Sci U S A.102:8466 8471所述)，以识别以高亲和力结合靶抗原(即HER2、VEGFA或VEGFC)的抗体变体。然后分离此类变体，并例如经由表面等离子体共振来确定该变体对其靶抗原的亲和力，并与表I中显示的抗体的亲和力和表I中的抗体的来源亲本抗体的亲和力进行比较(参见，例如，表G3)。执行至少一轮(诸如2、3、4、5、6、7、8、9或10轮中的至少任一者)亲和力成熟，以识别高亲和力抗HER2变体、高亲和力抗VEGFA变体和高亲和力抗VEGFC变体。确定对其各自靶抗原具有高亲和力的抗体变体的序列。
接下来，进一步分析在上述筛选中识别的变体以评估它们对双特异性抗体产率的影响。简而言之，高亲和力抗HER2、抗VEGFA和抗VEGFC变体被重新格式化为双特异性抗体。示例性双特异性抗体包括但不限于例如抗HER2/抗CD3、抗VEGFA/抗ANG2和抗VEGFC/抗CD3(参见上面的表G1和G2)。例如根据实例1中所详述的方法，来表达和纯化双特异性抗体。例如经由尺寸排阻色谱法、高分辨率LCMS和/或SDS-PAGE凝胶分析，来评估正确组装的双特异性抗体的产率，如实例1中所详述。使用例如表G1和G2中示出的双特异性抗体来并行执行对照实验。将经由文库筛选所识别的包含高亲和力抗HER2抗体变体、高亲和力抗VEGFA变体或抗VEGFC变体的双特异性抗体的产率与表I中示出的包含抗HER2、抗VEGFA或抗VEGFC抗体的双特异性抗体的产率进行比较。表G3中示出了额外的经修饰的抗体，该额外的经修饰的抗体经过一个或多个亲和力成熟步骤并针对经改进的亲和力和BsAb产率得到进一步测定(即，如上所述)。
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提供前述实例仅用于说明性目的并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。除了本文中示出和描述的之外，本发明的各种修改对于根据说明书前文的本领域技术人员而言将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。
序列表
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<160> 8
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<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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