一种复合发酵剂的制备方法及其在辣椒发酵增香中的应用
阅读说明：本技术 一种复合发酵剂的制备方法及其在辣椒发酵增香中的应用 (Preparation method of compound leavening agent and application of compound leavening agent in pepper fermentation and flavor enhancement ) 是由 吴继红 李美伦 劳菲 袁林 李婧 潘鑫 胡小松 廖小军 于 2021-05-20 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种复合发酵剂的制备方法及其在辣椒发酵增香中的应用,具体地,本发明提出了一种复合发酵剂,包括：植物乳杆菌菌液和二孢接合酵母菌菌液,所述植物乳杆菌菌液和二孢接合酵母菌菌液的体积比为(1～1.5):1。利用该种复合发酵剂接种发酵辣椒,能够提高发酵辣椒的抗氧化能力和挥发性风味物质的种类及含量(尤其是苯乙醇、芳樟醇等发酵辣椒关键风味物质的含量),使得接种发酵辣椒的风味浓郁且品质优良、稳定。(The invention provides a preparation method of a compound leavening agent and application of the compound leavening agent in pepper fermentation and flavor enhancement, and particularly provides the compound leavening agent which comprises the following steps: the lactobacillus plantarum bacterial liquid and the zygosaccharomyces bisporus bacterial liquid are mixed according to the volume ratio of (1-1.5) to 1. The compound leaven is used for inoculating fermented peppers, so that the oxidation resistance of the fermented peppers and the types and the contents of volatile flavor substances (especially the contents of key flavor substances of the fermented peppers such as phenethyl alcohol, linalool and the like) can be improved, and the inoculated fermented peppers are rich in flavor, excellent in quality and stable.)
技术领域
本发明属于食品发酵
技术领域
，具体涉及一种复合发酵剂的制备方法及其在辣椒发酵增香中的应用。背景技术
发酵辣椒是我国传统特色发酵食品，至今已有数百年历史，其不仅风味独特，还具有防止脂肪积累和降血脂等功效。发酵辣椒多采用自然发酵的方法制得，即完全利用环境中的微生物以及辣椒表面的天然菌群来完成发酵过程，这种发酵方式制得的辣椒风味浓郁，但存在生产周期长，产品品质易受环境条件、加工批次等因素影响，同时还易遭到不利微生物(如葡萄球菌属的病原微生物和造成腐败“生花”现象的真菌等)的侵害等问题。
因此，发酵辣椒采用何种发酵方式至关重要。
发明内容
随着微生物纯培养技术的发展，发酵辣椒的生产方式试图由自然发酵转为接种发酵，接种发酵是通过向原料中接种功能微生物进行发酵，以此实现发酵过程的可控化和产品质量的均一化。由于不同微生物的代谢能力千差万别，因此选用何种微生物用于接种发酵至关重要。针对自然发酵辣椒存在着生产周期长、产品质量不稳定的问题和目前接种发酵辣椒存在着风味寡淡的问题。本发明所要解决的技术问题是，现有技术中的不足和缺陷，提供一种复合发酵剂的制备方法及其在辣椒发酵增香中的应用。本发明提供了一种植物乳杆菌和二孢接合酵母菌复合接种发酵辣椒的方法，该复合发酵剂的应用显著提高了发酵辣椒的抗氧化能力及挥发性风味物质的种类及含量(尤其是苯乙醇、芳樟醇等发酵辣椒中的关键风味物质的含量)，使得接种发酵辣椒的风味浓郁且品质优良。
在本发明的第一方法，本发明提出了一种复合发酵剂。根据本发明的实施例，所述复合发酵剂包括：植物乳杆菌菌液和二孢接合酵母菌菌液，所述植物乳杆菌菌液和二孢接合酵母菌菌液的体积比为(1～1.5):1。发明人发现，该复合发酵剂的应用显著提高了发酵辣椒的抗氧化能力及挥发性风味物质的种类及含量(尤其是苯乙醇、芳樟醇等发酵辣椒中的关键风味物质的含量)，使得接种发酵辣椒的风味浓郁且品质优良。
根据本发明的实施例，上述复合发酵剂进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述植物乳杆菌为FL-8。植物乳杆菌FL-8现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.22197，保藏时间为2021年4月16日，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
根据本发明的实施例，所述活化植物乳杆菌液中植物乳杆菌的活菌数为1～2×107 cfu/mL。
根据本发明的实施例，所述二孢接合酵母菌为XJ-26。二孢接合酵母菌XJ-26现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.22198，保藏时间为2021年4月16日，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院 3号。
根据本发明的实施例，所述活化二孢接合酵母菌液中二孢接合酵母菌的活菌数为2～4×107cfu/mL。
上述优选的植物乳杆菌FL-8和二孢接合酵母菌XJ-26均是从自然发酵辣椒中分离筛选得到的优势菌。植物乳杆菌FL-8对四种常见的食源性致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和英诺克李斯特氏菌)具有较强的抑制作用；并且该菌株具有优良的抗氧化能力，其对DPPH自由基的清除率在70％以上，对ABTS阳离子自由基的清除率接近60％，铁离子还原能力为593.21μmol/L；另外该菌株具有较强的亚硝酸盐降解能力，在MRS培养基中培养24h后，其对亚硝酸盐的降解率高达99％；二孢接合酵母菌XJ-26具有良好的产醇和产酯潜力。植物乳杆菌FL-8和二孢接合酵母菌XJ-26能够协同存在，将其复合接种发酵辣椒，能够保证产品的食用安全性，提高发酵辣椒的抗氧化能力，促进苯乙醇、芳樟醇等发酵辣椒特征风味物质的形成，有效提升发酵辣椒品质。
根据本发明的实施例，所述植物乳杆菌菌液和二孢接合酵母菌菌液的体积比为1:1。发明人发现，在该比例下两种活菌数的数量级更一致，有助于促进两种微生物的共同生长和发酵，减少微生物间的干扰。
在本发明的再一方面，本发明还提出了一种复合发酵剂的制备方法，所述复合发酵剂由植物乳杆菌菌液(Lactiplantibacillus plantarum)和二孢接合酵母菌菌液(Zygosaccharomyces bisporus)按1︰1的体积比混合配制而成。复合发酵剂中的植物乳杆菌菌液由植物乳杆菌FL-8(Lactiplantibacillus plantarum)制得，植物乳杆菌FL-8现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.22197，保藏时间为2021年4月16日，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院 3号；复合发酵剂中的二孢接合酵母菌菌液由二孢接合酵母菌(Zygosaccharomyces bisporus)XJ-26制成，二孢接合酵母菌XJ-26现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.22198，保藏时间为2021年4月16日，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在本发明的再一方面，本发明还提出了一种制备复合发酵剂的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)将植物乳杆菌菌液进行培养、活化处理，以便得到活化植物乳杆菌液；2)将二孢接合酵母菌菌液进行培养、活化处理，以便得到活化二孢接合酵母菌液；3)将所述活化植物乳杆菌液、二孢接合酵母菌液进行混合处理，以便得到所述复合发酵剂，其中所述活化植物乳杆菌液、二孢接合酵母菌液的体积比为(1～1.5):1。需要说明的是，该步骤前的编号对顺序没有限定作用，可以先制备活化植物乳杆菌液，也可先制备活化二孢接合酵母菌液，也可同时制备活化植物乳杆菌液和活化二孢接合酵母菌液。
根据本发明的实施例，上述方法进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述植物乳杆菌为FL-8。
根据本发明的实施例，所述活化植物乳杆菌液中植物乳杆菌的活菌数为1～2×107 cfu/mL。
根据本发明的实施例，所述二孢接合酵母菌为XJ-26。
根据本发明的实施例，所述活化二孢接合酵母菌液中二孢接合酵母菌的活菌数为2～4×107cfu/mL。
根据本发明的实施例，所述植物乳杆菌菌液和二孢接合酵母菌菌液的体积比为1:1。发明人发现，在该比例下两种活菌数的数量级基本一致，有助于促进两种微生物的共同生长和发酵，减少微生物间的干扰。
上述优选的植物乳杆菌FL-8和二孢接合酵母菌XJ-26均是从自然发酵辣椒中分离筛选得到的优势菌。植物乳杆菌FL-8对四种常见的食源性致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和英诺克李斯特氏菌)具有较强的抑制作用；并且该菌株具有优良的抗氧化能力，其对DPPH自由基的清除率在70％以上，对ABTS阳离子自由基的清除率接近60％，铁离子还原能力为593.21μmol/L；另外该菌株具有较强的亚硝酸盐降解能力，在MRS培养基中培养24h后，其对亚硝酸盐的降解率高达99％；二孢接合酵母菌XJ-26具有良好的产醇和产酯潜力。植物乳杆菌FL-8和二孢接合酵母菌XJ-26能够协同存在，将其复合接种发酵辣椒，能够保证产品的食用安全性，提高发酵辣椒的抗氧化能力，促进苯乙醇、芳樟醇等发酵辣椒特征风味物质的形成，有效提升发酵辣椒品质。
在本发明的再一方面，本发明还提出了一种复合发酵剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)植物乳杆菌菌液的制备：吸取100μL保藏于冻存管中的植物乳杆菌菌液，接入8mL MRS液体培养基中，37℃恒温培养20～26h，得到种子液。将种子液按2％(v/v)的接种量接入MRS培养基中，37℃培养20～26h。然后将活化两代的植物乳杆菌菌液在4℃、 10000g条件下离心15min，弃上清液，用等体积的无菌生理盐水溶液复悬菌体，得到复悬液，此时植物乳杆菌的活菌数为1～2×107cfu/mL。
(2)二孢接合酵母菌菌液的制备：吸取100μL保藏于冻存管中的二孢接合酵母菌菌液，接入8mL YPD液体培养基中，30℃恒温培养20～26h，得到种子液。将种子液按2％ (v/v)的接种量接入YPD培养基中，30℃培养20～26h。然后将活化两代后的二孢接合酵母菌菌液在4℃、10000g条件下离心15min，弃上清液，用等体积的无菌生理盐水溶液复悬菌体，得到复悬液，此时二孢接合酵母菌的活菌数为2～4×107cfu/mL。
(3)复合发酵剂的制备：将上述步骤(1)和(2)制备得到的菌悬液，按按1︰1的体积比进行混合，得到复合发酵剂。
在本发明的再一方面，本发明还提出了前面所述的复合发酵剂或如前面所述的方法制备得到的复合发酵剂在制备发酵辣椒中的用途。根据本发明实施例的复合发酵剂提高了发酵辣椒的抗氧化能力及挥发性风味物质的种类及含量(尤其是苯乙醇、芳樟醇等发酵辣椒中的关键风味物质的含量)，使得接种发酵辣椒的风味浓郁且品质优良。
在本发明的再一方面，本发明还提出了一种发酵辣椒。根据本发明的实施例，所述发酵辣椒包括：活化植物乳杆菌和二孢接合酵母菌。根据本发明实施例的发酵辣椒的风味浓郁且品质优良。
根据本发明的实施例，上述发酵辣椒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述植物乳杆菌为FL-8。
根据本发明的实施例，所述二孢接合酵母菌为XJ-26。
上述优选的植物乳杆菌FL-8和二孢接合酵母菌XJ-26均是从自然发酵辣椒中分离筛选得到的优势菌。植物乳杆菌FL-8对四种常见的食源性致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和英诺克李斯特氏菌)具有较强的抑制作用；并且该菌株具有优良的抗氧化能力，其对DPPH自由基的清除率在70％以上，对ABTS阳离子自由基的清除率接近60％，铁离子还原能力为593.21μmol/L；另外该菌株具有较强的亚硝酸盐降解能力，在MRS培养基中培养24h后，其对亚硝酸盐的降解率高达99％；二孢接合酵母菌XJ-26具有良好的产醇和产酯潜力。植物乳杆菌FL-8和二孢接合酵母菌XJ-26能够协同存在，将其复合接种发酵辣椒，能够保证产品的食用安全性，提高发酵辣椒的抗氧化能力，促进苯乙醇、芳樟醇等发酵辣椒特征风味物质的形成，有效提升发酵辣椒品质。
在本发明的再一方面，本发明还提出了一种制备发酵辣椒的方法。根据本发明的实施例，上述方法包括：利用前面所述的复合发酵剂或如前面所述的方法制备得到的复合发酵剂发酵辣椒，以便获得发酵辣椒。根据本发明实施例制备得到的发酵辣椒风味浓郁且品质优良。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述复合发酵剂的添加量为2.5～3.5％(v/w，单位g/mL)。发明人发现，复合发酵剂添加量过多或过少均会影响发酵产品的品质。发酵剂添加量过少会导致发酵周期延长；而发酵剂添加量过多虽然会缩短发酵周期，但这会影响发酵过程中发酵辣椒风味的积累和产生。
根据本发明的实施例，所述发酵是在28～30℃下避光发酵10天进行的。
根据本发明的实施例，所述辣椒中含有食盐，所述食盐的含量为4～8％(w/w，单位g/g)。发明人发现，添加食盐既有抑制病原菌等杂菌生长的作用，又能促进其风味释放并赋予其独特的滋味与口感。目前自然发酵辣椒的含盐量在10％左右及以上，从营养健康的角度出发，本发明期望减少食盐添加量。而如果食盐添加量过低，则无法保证抑菌效果和品质特征；食盐添加量过高会影响复合发酵剂菌种的活性，延长发酵周期。因而本发明实施例的食盐添加量既能有效抑菌，又能营养健康。
在本发明的再一方面，本发明还提供了一种发酵辣椒的制备方法，具体步骤如下：
(1)挑选新鲜、成熟的红螺丝椒，清洗、去蒂、去籽后，置于破碎机中破碎30s；
(2)添加4～8％(w/w)的食用盐到步骤(1)得到的辣椒中，搅匀；
(3)将步骤(2)得到的辣椒进行超高压非热杀菌处理，压力参数：500～600MPa，处理时间：10min。
(4)将复合发酵剂按2.5～3.5％(v/w)的接种量添加至步骤(3)得到的辣椒中，在28～30℃下避光发酵10天。
与现有技术相比，本发明的至少具有如下优势至少之一：
1.根据本发明实施例的复合发酵剂所含活菌数量多，且所用菌种均是从自然发酵辣椒中分离筛选得到的优势菌，鉴于以上两菌株对辣椒基质具有良好的适应性且能够协同存在，故选择将其用于接种发酵辣椒，省去了菌种驯化环节，该种复合发酵剂接种发酵辣椒后能够迅速启动发酵，缩短发酵时间，提高发酵效率。
2.根据本发明实施例的复合发酵剂由植物乳杆菌FL-8和二孢接合酵母菌XJ-26组成，其中植物乳杆菌FL-8具有较强地抑制致病微生物生长的能力、降解亚硝酸盐的能力和优良的抗氧化能力，具有突出的发酵潜力和应用价值。
3.根据本发明实施例的植物乳杆菌FL-8和二孢接合酵母菌XJ-26复合接种发酵辣椒，不仅能够显著提高发酵辣椒的抗氧化能力，还能够提升发酵辣椒的风味品质，提高醇类、酯类等重要风味物质的种类和含量，促进苯乙醇、芳樟醇等发酵辣椒特征风味物质的积累，使得接种发酵辣椒的风味浓郁，有效地改进了目前接种发酵辣椒因菌种单一造成的风味寡淡的缺点，也有助于发酵辣椒实现可控化、标准化生产，保证产品品质的稳定。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的复合发酵剂接种发酵辣椒与对照组辣椒的抗氧化能力对比图；
图2是根据本发明实施例的复合发酵剂接种发酵辣椒与对照组辣椒的风味组成对比图
图3是根据本发明实施例的复合发酵剂接种发酵辣椒与对照组辣椒的芳樟醇、苯乙醇含量对比图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
植物乳杆菌和二孢接合酵母菌序列：
(1)植物乳杆菌FL-8(Lactiplantibacillus plantarum)
GGGGACTGCTATAGATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTAATGATTGGTGCTTGCAT CATGAATTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCC AGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCG CATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTAT TAGCTAGATGGTGAGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGG GTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA GGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAA GGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTC AGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGG TTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGG GAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAG ATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAG GCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACG ATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGC ATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCC GCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGT CTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGG TGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG CGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGT GACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGG CTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGG AATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACA CACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTA GGAACCAGCCGCCTAAGGTAAACAAT
(2)二孢接合酵母菌XJ-26(Zygosaccharomyces bisporus)
CTCCCCGTTTTTTGTATCTTAAGTTCAGCGGGTAATCCTACCTGATTTGAGGTCAA GCTTAGAGAGTATTGTTTGCCAAAGGCGCGCAGAAAAGTTCGATATTTCTATCACCCA CCTCAGTCTCCAGCAACCTGTCTGCCGAGTCGGTAAAACCTAATACGACATTTGGTTA AAGGAAAATAGAGGAGGAGCCAGACGTTTCCGCCTAAAACTCTTCTCTAGACGCATC CCCAAAAGGCTTGCAATTTCAAGCTAACCCAGTTTTAACAGAGTATCACTCACTACCA AACACAAGTGTTTGAGAAGGAAATGACGCTCAAACAGGCATGCCCCCTGGAATACCA AGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTA CGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAA AGTTTTGAATATTATAATTTTTTTTTTGTATTCATTTGACTGTGTGTAAAATAAAAAATAA AAATATTGTTTGTGTTTACCTCTGGGAGTAGATAGATTTTCATCATCCTCCCAAAGAAG AAAAATAGTAGAAACTCCACTGTGTGTAAATTGTAAGCCGAAGCAGTAGAAGCTCCCT CTACTCTAGACCGCGCAACTAAGCGCAGGCCCAAAAGCAAAAGAAAGAGCCGAAAA ACTCTACTGCCCCATTGACTTGCCAATCAGATTTTTTCTATAATGATCCTTCCGAGTCCC CCCCACCGGGAAGGGTTC
实施例1植物乳杆菌和二孢接合酵母菌的分离、纯化与鉴定
本发明提供的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)FL-8和二孢接合酵母菌 (Zygosaccharomyces bisporus)XJ-26均分离于自然发酵辣椒。将自然发酵辣椒用无菌生理盐水进行梯度稀释，取适宜梯度的样品稀释液涂布至MRS培养基和YPD培养基，MRS培养基于37℃恒温培养48h，YPD培养基于30℃恒温培养48h。挑取具有典型乳酸菌和酵母菌菌落形态特征的单菌落进行平板划线纯化，将纯化后的菌种接入35％(v/v)甘油保护剂中冻存。
挑取单菌落进行分子生物学鉴定，乳酸菌利用通用引物(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)进行PCR扩增，酵母菌利用通用引物(ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4： TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行PCR扩增，扩增产物送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。利用BLAST程序，将菌株的基因序列与NCBI数据库中已知菌株的序列进行相似性比对。菌株FL-8与植物乳杆菌gp108(ID：KM495895.1)的相似度为99.93％，故确定其为植物乳杆菌。菌株XJ-26与二孢接合酵母菌CBS:702(ID：KY106028.1)的相似度为99.03％，故确定其为二孢接合酵母菌。
实施例2植物乳杆菌功能特性研究
(1)抑菌能力测定
采用牛津杯琼脂扩散法测定菌株的抑菌性能。选用大肠杆菌CGMCC1.90、金黄色葡萄球菌CGMCC1.89、肠炎沙门氏菌BNCC103307、英诺克李斯特氏菌BNCC186087为指示菌，37℃恒温培养24h后，吸取50μL指示菌稀释液与15mL LB培养基混匀后倒入培养皿，待培养基冷却凝固后，放置牛津杯，向牛津杯内加入200μL的植物乳杆菌菌液，在4℃冰箱放置6h，促进植物乳杆菌菌液扩散，然后37℃恒温培养48h。使用Interscience Scan1200 抑菌圈分析仪测定抑菌圈直径，由表1可知，植物乳杆菌对四种常见致病菌均有抑制作用。
表1植物乳杆菌对四种食源性致病菌的抑制效果
(2)抗氧化能力测定
将植物乳杆菌接种于MRS液体培养基中进行活化，然后离心(4℃，8000rpm/min，离心15min)，取上清液用于测定抗氧化能力，以DPPH自由基清除能力、ABTS阳离子自由基清除能力、亚铁离子还原能力(FRAP法)表征植物乳杆菌的体外抗氧化能力。
DPPH自由基清除能力：取1mL上清液与3mL 0.2mmol/L的DPPH溶液混合，避光反应30min，在517nm处测定吸光值。ABTS阳离子自由基清除能力：使用南京建成生物工程研究所总抗氧化能力测定试剂盒(ABTS法)进行测定；亚铁离子还原能力：使用南京建成生物工程研究所总抗氧化能力试剂盒(FRAP法)进行测定。由表2可知，植物乳杆菌对DPPH自由基的清除率为76.36％，对ABTS自由基的清除率为59.81％，铁离子还原能力为593.21μmol/L，说明该菌株具有优良的抗氧化能力，能够有效预防氧化应激相关疾病的发生。
表2植物乳杆菌的抗氧化能力结果
(3)降解亚硝酸盐能力
将植物乳杆菌活化后，按2％(v/v)的接种量接入添加250μg/mLNaNO2的MRS培养基中，37℃恒温培养24h，参照《GB5009.33-2016食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐含量。研究发现植物乳杆菌具有很强的降解亚硝酸盐能力，培养24h后，亚硝酸盐的降解率达99.43±0.05％。
实施例3复合发酵剂的制备
植物乳杆菌的活化及扩大培养：取100μL保藏在冻存管中的植物乳杆菌菌液，接入8 mLMRS液体培养基中，37℃培养24h，得到种子液。将种子液按2％(v/v)的接种量接入 MRS培养基中，37℃培养24h，进行扩大培养。
二孢接合酵母菌的活化及扩大培养：取100μL保藏在冻存管中的二孢接合酵母菌菌液，接入8mLYPD液体培养基中，30℃培养24h，得到种子液。将种子液按2％(v/v)的接种量接入YPD培养基中，30℃培养24h，进行扩大培养。
将上述方法得到的活化两代的植物乳杆菌菌液和二孢接合酵母菌菌液，在4℃、10000g 条件下离心15min，弃上清液，用0.9％的无菌氯化钠溶液复悬菌体，得到复悬液。此时植物乳杆菌的活菌数和二孢接合酵母菌的活菌数分别为7.19lg cfu/mL和7.53lg cfu/mL。然后将两菌株的复悬液按1︰1的体积比进行混合，得到复合发酵剂。
实施例4复合发酵剂在发酵辣椒中的应用
1.制备植物乳杆菌和二孢接合酵母菌复合接种发酵辣椒
选用新鲜、成熟的红螺丝椒，清洗、去蒂、去籽后，置于破碎机中破碎30s。然后加入4％(w/w)的食用盐，搅匀后，进行高压灭菌处理(处理参数：550MPa，10min)。将实施例3制备得到的复合发酵剂按3％(v/w)的接种量接入辣椒中，30℃发酵10d，该样品标记为4-LZ。
2.制备植物乳杆菌和二孢接合酵母菌复合接种发酵辣椒
选用新鲜、成熟的红螺丝椒，清洗、去籽、去蒂后，置于破碎机中破碎30s。然后加入8％(w/w)的食用盐，搅匀后，进行高压灭菌处理(处理参数：550MPa，10min)。将实例3制备得到的复合发酵剂按3％(v/w)的接种量接入辣椒中，30℃发酵10d，该样品标记为8-LZ。
对比例1：制备未发酵辣椒
取新鲜、成熟的红螺丝椒，清洗、去籽、去蒂后，置于破碎机中破碎30s，然后加入4％(w/w)的食用盐，搅匀后，进行高压灭菌处理(处理参数：550MPa，10min)，该样品标记为4-F0。
对比例2：制备自然发酵辣椒
取新鲜、成熟的红螺丝椒，清洗、去籽、去蒂后，置于破碎机中破碎30s，然后加入4％(w/w)的食用盐，搅匀后，装入干净的容器中，30℃发酵10d，该样品标记为4-SF。
对比例3：制备乳酸菌(植物乳杆菌和类肠膜魏斯氏菌复合)接种发酵辣椒
取新鲜、成熟的红螺丝椒，清洗、去籽、去蒂后，置于破碎机中破碎30s，然后加入4％(w/w)的食用盐，搅匀后，进行高压灭菌处理(处理参数：550MPa，10min)。参照实施例3方法，将实施例3中的“二孢接合酵母菌菌液”替换为“类肠膜魏斯氏菌菌液”，制备植物乳杆菌与类肠膜魏斯氏菌的复合发酵剂，然后按3％(v/w)的接种量接入辣椒中， 30℃发酵10d，该样品标记为4-LW。
对比例4：制备未发酵辣椒
基本方法同对比例1，区别在于将食盐添加量由“4％”替换为“8％”，该样品标记为8-F0。
对比例5：制备自然发酵辣椒
基本方法同对比例2，区别在于将食盐添加量由“4％”替换为“8％”，该样品标记为8-SF。
对比例6：制备乳酸菌(植物乳杆菌和类肠膜魏斯氏菌复合)接种发酵辣椒
基本方法同对比例3，区别在于将食盐添加量由“4％”替换为“8％”，该样品标记为8-LW。
发酵辣椒抗氧化能力的测定：称取1g发酵辣椒样品，加入20mL 80％甲醇水溶液，超声提取30min后，8000g离心10min，取上清液(即稀释20倍的提取液)作为待测液，用于测定抗氧化能力。以DPPH自由基清除率、ABTS阳离子自由基清除率和亚铁还原能力(FRAP法)为抗氧化能力评价指标，具体测定方法同实施例2。自然发酵辣椒(SF)、植物乳杆菌与类肠膜魏斯氏菌复合接种发酵辣椒(LW)和植物乳杆菌与二孢接合酵母菌复合接种发酵辣椒(LZ)的抗氧化能力结果见图1。在加盐量为4％的辣椒体系中，LZ接种发酵辣椒对DPPH自由基的清除率、ABTS阳离子自由基的清除率和亚铁离子还原能力分别为58.15％、23.67％和197.16μmol/L，以上指标均高于自然发酵辣椒(SF)和乳酸菌接种发酵辣椒(LW)。在加盐量为8％的辣椒体系中，LZ接种发酵辣椒对DPPH自由基的清除率、ABTS阳离子自由基的清除率和亚铁离子还原能力分别为48.41％、22.85％和172.03 μmol/L，均明显高于自然发酵辣椒(SF)和乳酸菌接种发酵辣椒(LW)。本发明优选得到的植物乳杆菌和二孢接合酵母菌复合发酵剂，与自然发酵辣椒和乳酸菌发酵辣椒相比，能明显提高产品的抗氧化能力。
发酵辣椒挥发性风味物质的测定：采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱 (HS-SPME-GC-MS)测定发酵辣椒的风味。样品前处理：准确称取1g样品于顶空瓶中，加入3mL饱和氯化钠溶液和50μL稀释10-6的2-辛醇标品，混匀。顶空萃取条件：在70℃平衡15min后插入DVB/CAR/PDMS萃取头，在70℃下萃取40min，转入GC解吸5min。 GC-MS条件：使用DB-WAX色谱柱，载气为氦气，流速为1mL/min；升温程序：40℃保持3min，以5℃/min的速度升温至150℃，再以10℃/min的速度升温至250℃，保持10min。质谱条件：电离方式EI，离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃，电子轰击能量为70eV，采用全扫描模式(scan mode)采集信号。最后，利用NIST14标准谱库与目标化合物进行鉴定，以2-辛醇为内标物用于计算各化合物含量。
由图2可知，发酵辣椒中醇类、酯类、烃类、酮类等风味物质的种类及含量均高于未发酵辣椒，微生物发酵使得辣椒风味更为丰富。在加盐量为4％的辣椒体系中，本发明优选的复合发酵剂接种发酵辣椒中的醇类、烃类、酸类等物质含量均明显高于其他对照发酵组。在加盐量为8％的辣椒体系中，本发明优选的复合发酵剂接种发酵辣椒的醇类、酯类、烃类、醛类等物质含量均明显高于其他对照发酵组，其中苯乙醇和芳樟醇是接种发酵辣椒主要的醇类物质，这些风味物质的阈值较低并具有花香、果香等特殊风味，已有研究报道指出芳樟醇、苯乙醇是发酵辣椒的关键香气物质。由图3可以看出，在本发明优选的发酵剂接种发酵辣椒中检出芳樟醇含量为857.73±40.81μg/kg(4-LZ组)和391.43±5.48μg/kg(8-LZ 组)，显著高于未发酵辣椒、自然发酵辣椒和乳酸菌接种发酵辣椒中芳樟醇的含量；另外，该发酵剂接种发酵辣椒的苯乙醇含量分别为194.51±29.45μg/kg(4-LZ组)和278.37±3.69 μg/kg(8-LZ组)，显著高于自然发酵辣椒的苯乙醇含量，而苯乙醇在未发酵辣椒和乳酸菌接种发酵辣椒中均未检出。综上所述，本发明优选到的植物乳杆菌和二孢接合酵母菌复合发酵剂具有优良的发酵效果和风味形成能力，该种复合发酵剂接种发酵辣椒有助于提高发酵辣椒的花香、果香等香气属性，使得发酵辣椒风味更为丰富、浓郁。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学
<120> 一种复合发酵剂的制备方法及其在辣椒发酵增香中的应用
<130> BI3210781
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