一种用于防治急性高原反应的藏药复方及其保健产品
阅读说明：本技术 一种用于防治急性高原反应的藏药复方及其保健产品 (Tibetan medicine compound for preventing and treating acute altitude stress and health-care product thereof ) 是由 米玛 陈静 雷海民 王鹏龙 于 2021-11-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于防治急性高原反应的藏药复方及其保健产品的制备方法,它是由以下重量份的藏药组成：芫根0.2～0.4份,沙棘1.2～2.0份,石榴籽1.0～1.5份。本处方是基于石榴普安散处方增减衍生的民间验方,已有三十多年的应用历史,体内外实验证明,本发明具有良好的抗氧化、耐缺氧、抗疲劳作用,且不良反应少、安全性高,对急性高原反应有良好的预防作用,可有效降低急性高原反应的发病率。三味藏药均属药食同源,制备成的速溶茶口味酸甜,绿色健康,携带方便,消费者依从性高,符合三效、三小、五方便的原则,具备较高的使用价值和广阔的开发前景。(The invention discloses a Tibetan medicine compound for preventing and treating acute altitude sickness and a preparation method of a health-care product thereof, wherein the Tibetan medicine compound is composed of the following Tibetan medicines in parts by weight: 0.2-0.4 part of common turnip, 1.2-2.0 parts of sea buckthorn and 1.0-1.5 parts of pomegranate seeds. The prescription is a folk prescription derived based on the increase and decrease of the prescription of the pomegranate Puan powder, has more than thirty years of application history, and in vitro and in vivo experiments prove that the pomegranate extract powder has good effects of resisting oxidation, anoxia and fatigue, has few adverse reactions and high safety, has a good prevention effect on acute altitude reaction, and can effectively reduce the incidence of the acute altitude reaction. The three Tibetan medicines are both homologous in medicine and food, and the prepared instant tea is sour and sweet in taste, green, healthy, convenient to carry, high in compliance of consumers, in line with the principles of three effects, three little effects and five convenience, and has high use value and wide development prospect.)
技术领域
本发明涉及藏药及天然药物领域，尤其涉及一种防治急性高原反应的藏药复方及其保健产品的制备方法。
背景技术
急性高原反应是高海拔地区的常见疾病，如不能控制将会发展为高原肺水肿、高原脑水肿及高原肺动脉高压，严重危害藏区游客、百姓身体健康，影响藏区经济发展和安全工作。目前，抗高原反应药物主要分为中草药、藏药、西药和中西药结合药物等，以降低机体在缺氧条件下的耗氧速度，增加各组织器官的产氧速度，减少机体的缺氧损伤，提高机体内超氧化物歧化酶的含量等机制为主。由于藏区交通与资源的压力，迫切需要发开一种简易便携、安全有效的保健品用于急性高原反应的防治。
藏药是中华民族传统医药中的重要组成部分之一，它是融合了中药学、印度药学和大食药学的智慧而孕育成的伟大精髓，经过千百年临床实践证明，勤劳勇敢的藏民族凭着具有本民族特色的藏药,用他们的智慧和劳动同恶劣的自然环境进行抗争。高原反应作为藏区的常见疾病之一，应用藏药治疗具有悠久的历史。芫根，藏语名为“妞玛”，载于藏医学名著《四部医典》中，具有滋补增氧、开胃消食之效，对抗缺氧、抗疲劳、降血脂，以及缓解水土不服等症状有极高调节补充作用。石榴子，藏语名为“赛朱”，载于《晶珠本草》，酸甘性润，温中健胃，能够治疗胃寒引起的胃痛、消化不良、呕吐等。沙棘首载于《月王药诊》，能够治疗高脂血症，促进血液循环，此外对于气管炎、肺气肿具有良好疗效。三味藏药功能相互辅佐，常配伍使用，应用于如芫根沙棘片、十七味寒水石丸、石榴普安丸等成药，针对高原反应引起的头痛、呕吐、胸闷等症状具有协同增效的作用。本方源自藏药成方制剂石榴普安散，又名“赛朱更代”，可以益胃火，除痰湿，温肾，用于治疗“培根甲布”，“木布”病，胃火，衰弱，消化不良，腰部冷痛，小便不利，妇女血病等。本民间验方依托石榴普安散中大量应用石榴子和沙棘二药，用于温胃补阳，扶正肺气，来应对急性高原反应引起的恶心呕吐、食欲不振、尿少、胸闷气短、乏力等症状，又辅佐以芫根滋补增氧、开胃消食，可以显著缓解水土不服引起的急性症状，已经临床实践多年，本方虽然具有悠久的应用历史但是目前相关产品还处于空缺阶段，以藏区特有的药物资源为基础，开发品质高、疗效好的藏药产品具有十分广阔的市场前景。
发明内容
基于以上问题，本发明提供一种用于防治急性高原反应的藏药复方及其保健产品，本产品的优势在于原料药食两用，安全性高，口味良好，形成配伍后效果增强，且工艺简单，产品易携，以填补本藏方在防治急性高原反应的产品空白，解决药品不便携的问题。
本产品的制备工艺如下：
1)将2-4份芫根，12-20份沙棘，10-15份石榴子净选，粉碎过后混合，加入600-1000重量份的水煎煮1-2小时，自然冷却至常温，过滤，弃滤渣，得到粗提液。
2)将上述粗提液真空冷冻干燥后，加入50-300重量份的水，混匀，静置，将所得溶液过滤，滤液在90-110℃温度下灭菌5-10分钟，喷雾干燥，所得茶粉包装入袋即得所述具有防治急性高原反应的藏药速溶茶。
对制得的藏药速溶茶进行分析，测得固体饮料中异鼠李素的含量为1.31mg/g，完全溶解时间为17-20s，溶解性测定条件为：将5g藏药速溶茶倒入200mL 45-50℃的水中持续搅拌。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：本发明藏药复方速溶茶的制备
1.原料芫根20g、沙棘150g、石榴子100g。
2.制备方法
1)筛选质量上成的芫根、沙棘、石榴子鲜品，洗净后沥干，芫根切成5mm左右的薄片，于真空干燥器(真空度：100pa；温度：-28℃～-30℃；加热板温度；65℃-70℃；时间：16h)中干燥，收集干燥完毕的芫根片、沙棘、石榴子，称重，粉碎，过50目筛，混合，得到藏药组合粗品(水分含量小于10％)，加入10L的水煎煮1小时，自然冷却至常温，过滤，弃滤渣，得到粗提液9.64L。
2)将上述粗提液真空冷冻干燥(工作压力40pa，升华温度-50℃，解析温度60℃)后，加入3L的水，搅拌混匀，静置，将所得溶液过滤，滤液在90-110℃温度下灭菌5-10分钟，喷雾干燥后(热风进口温度100～110℃，出口温度55～60℃，以每小时1.5～4L的进料量)，干法制粒，过筛整粒所得茶粉包装入袋即得所述具有防治急性高原反应的藏药速溶茶。
3)对制得的藏药速溶茶进行分析，测得固体饮料中异鼠李素的含量为1.24mg/g，完全溶解时间为17-20s，溶解性测定条件为：将5g藏药速溶茶倒入200mL 45-50℃的水中持续搅拌。
4)对制得的藏药速溶茶进行分析，采用高效液相色谱标准曲线法进行含量测定，测得固体饮料中异鼠李素的含量为1.47mg/g，完全溶解时间为15-20s。
具体通过以下实验例证本发明的药效学。
实施例2：体外抗氧化试验
1.DPPH自由基清除实验
1.1实验方法
精密称量1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，用无水乙醇配制成浓度为0.2mM的DPPH溶液，然后吸取100μL DPPH溶液加到96孔板中，每孔中加入100μL不同浓度的待测样品溶液，每个浓度下设置三个复孔，震荡摇匀后，置于室温(20～25℃)下避光孵育30min，对照组用无水乙醇代替待测样品溶液进行测定，同样设置三个复孔，酶标仪上测定该体系在517nm波长处的吸光度值A517，实验平行重复三次。
计算公式为：
DPPH自由基清除率(％)＝(A对照-A样品)/A对照×100％
对照组：DPPH+无水乙醇；
空白组(样品)：待测样品溶液+无水乙醇；
空白组(阳性药)：阳性药+乙醇
1.2实验结果
表1本发明速溶茶DPPH自由基清除率表
2.OH自由基清除实验
2.1实验方法
精密量取30μL不同浓度的待测样品溶液于96孔板中，然后每孔中依次加入30μL5.0mM邻菲罗啉溶液、50μL 5.0mM FeSO4溶液、50μL15.0mM EDTA-2Na溶液、30μL 0.2m MPBS缓冲液(pH7.4)，混匀后，加入30μL 1.0％H2O2溶液，于37℃恒温培养箱中孵育1h，酶标仪测定该溶液体系在536nm波长处的吸光度值A536，每个浓度下设置三个复孔。损伤组用去离子水代替待测样品溶液，非损伤组用去离子水代替待测样品溶液及1.0％H2O2溶液(损伤组和非损伤组分别设置六个复孔)，实验平行重复三次。
计算公式为：
OH自由基清除率(％)＝(A样品-A损伤组)/(A非损伤组-A损伤组)×100％
空白组(样品)：待测样品溶液+190μL水；
空白组(阳性药)：阳性药+190μL水
2.2实验结果
设置浓度梯度为20、16、8、4、2、1mg/mL，进行实验
表2本发明速溶茶OH自由基清除率表
3.超氧阴离子(O2 -)自由基清除实验
3.1实验方法
50mM Tris-HCl溶液的配制:50mL0.1 M三羟甲基氨基甲烷(Tis)溶液与19.9mL0.1mM HCl溶液混匀后，加去离子水稀释至100mL。精密量取80μL不同浓度(0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0mg/mL)的待测样品溶液加入到96孔板中，依次向每孔中加入80μL含1.0mMEDTA的Tris-HCl溶液(50mM PH8.3)、40μL含1.5mM邻苯三酚的0.01mM HCl溶液，每个浓度下设置三个复孔，室温下用酶标仪测定该溶液体系每隔1min在320nm波长处的吸光度值A320，连续测定在0、1、2、3、4、5min时的A320，对照组用含1.0mM EDTA的Tris-HCl溶液(50mMpH8.3)代替待测样品溶液进行测定，设置六个复孔。超氧阴离子诱导的邻苯三酚聚合速率用在320nm处吸光度值的变化(△A/min)来表示，实验平行重复三次
计算公式为:
O2-自由基清除率(％)＝(△Acontrol/min-△Asample/min)/△Acontro/min×100％③(其中，△Acontrol/min:待测样品溶液的诱导速率△Asamole/min:对照组溶液的诱导速率。)
3.2实验结果
表3本发明速溶茶超氧阴离子自由基清除率表
实施例3：HUVEC、H9C2、SY5Y细胞抗缺氧活性评价
1.材料与方法
1.1试剂和仪器
DMEM培养液、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)购自Gibco公司；青霉素、链霉素、PBS购自北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白酶购自吉诺生物制药技术有限公司；MTT试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；仪器包括BIO-RAD酶标仪(山东博科科学仪器有限公司，型号IMARK)。
1.2细胞系
人脐静脉内皮细胞HUVEC、心肌细胞H9C2、人神经母细胞瘤细胞SY5Y购自ATCC公司。
1.3实验方法
1.3.1细胞分组及缺氧模型的建立
将HUVEC、H9C2、SY5Y细胞分为4组，分别为对照组、模型组、速溶茶低浓度组及速溶茶高浓度组。对照组细胞培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，3～5d换液1次；模型组细胞放置于三气培养箱中，箱内温度保持37℃，持续通入含有5％CO2+95％N2的混合气体，造成HUVEC、H9C2、SY5Y细胞缺氧12h，迅速更换培养液，将HUVEC、H9C2、SY5Y细胞移至细胞培养箱(37℃、5％CO2)中继续培养12h，恢复细胞供氧；速溶茶低浓度组、高浓度组分别用1.25mg/mL、20mg/mL速溶茶处理细胞12h后，再以模型组同样的方式处理细胞。
1.3.2细胞增殖率检测
取生长状态良好的HUVEC、H9C2、SY5Y细胞培养于96孔板内，每孔加入20μL MTT溶液，混合均匀并培养4h，小心吸弃孔内上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜，混合均匀后用酶标仪检测570nm吸光度度值。
2.结果
表4本发明速溶茶促进缺氧状态下HUVEC、H9C2、SY5Y细胞活力表
与对照组相比，p＜0.05(1)；与对照组相比，p＜0.05(2)。
实施例4：小鼠耐缺氧试验
1.材料与方法
1.1试剂和仪器
本发明的速溶茶，由实施例一的方法制备。钠石灰，电子天平，电子秒表等。
1.2实验动物
ICR小鼠40只，体重18-22g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物室温度控制在20℃-25℃，相对湿度为45％-55％。昼夜为12h/12h，自由摄水和饮食。
1.3实验方法
1.3.1剂量设置
实验设置四个组，分别为三个实验组，一个对照组，每组小鼠9只。三个实验组速溶茶的剂量分别为0.15、0.65和1.30g/kg，对照组给予蒸馏水，均灌胃给药，每天1次，连续30d，灌胃容积为0.1mL/10g体重。
1.3.2常压耐缺氧试验
于末次给药后30min，将各组小鼠分别放入装有10g钠石灰的500mL磨口瓶内(每瓶1只)，以呼吸停止为死亡特征，记录小鼠存活时间。
2.结果
表5本发明速溶茶对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响(i±s)
实施例5：小鼠急性毒性试验
1.材料与方法
1.1试剂和仪器
本发明的速溶茶浓缩，由实施例一的方法制备。电子天平等。
1.2实验动物
ICR小鼠20只，体重18-22g，雌雄各半，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物室温度控制在20℃-25℃，相对湿度为45％-55％。昼夜为12h/12h，自由摄水和饮食。
1.3实验方法
禁食12h后按6g/kg单次灌胃藏药速溶茶混悬物。
2.结果
在2周观察期内，小鼠精神状态良好,未见毒性反应与死亡情况。雌性小鼠终体重(31.2±3.6)g,雄性(37.1±3.8)g。按急性毒性分级标准评价，藏药速溶茶属无毒级。
实施例6：人群口尝评价法
选择48名健康志愿者为受试者，对速溶茶的酸度和甜度进行评价，评价前温水漱口，品尝时在口中作漱口动作，停留10s后吐出，口感分为入口、10s内味道及口腔残余后味，根据口感进行打分，品尝完一种溶液后漱口至无味道残留，再品尝下一种溶液。
表6口感评价等级
表7本发明速溶茶口感评价结果
根据结果可知，91.6％以上的受试者认为其微酸，95.8％以上的受试者认为口感微甜，总体来看本发明口感较好，酸甜适宜。
药效学实验证明，本发明藏药速溶茶对于DPPH、OH自由基和超氧阴离子具有极强的清除作用，体外抗氧化作用显著；在细胞模型上能有效抵抗缺氧诱导的心肌细胞、血管内皮细胞、神经母瘤细胞损伤；体内动物实验证明其能显著提高缺氧小鼠生存率，且对于正常小鼠无毒性。药剂学实验证明，本发明藏药速溶茶溶解速度快，起效迅速，且风味俱佳，消费者适应性强。综上所述，本发明藏药复方及其保健产品-藏药速溶茶对于急性高原反应具有疗效好，起效快，安全性高的特点，此外其原料易得，运输方便，具有广阔市场，适合大规模开发与生产。
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