一种猪伪狂犬病毒ep0蛋白的单克隆抗体、制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种猪伪狂犬病毒ep0蛋白的单克隆抗体、制备方法和应用 (Monoclonal antibody of porcine pseudorabies virus EP0 protein, preparation method and application ) 是由 王迪 赵鸿远 陈冬杰 于 2021-10-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种猪伪狂犬病毒EP0蛋白的单克隆抗体、制备方法和应用,属于基因工程技术领域,其单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。本发明筛选获得了3株能够稳定分泌与EP0蛋白发生特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C5、4C6和3B5。经单抗亚型鉴定,发现2C5为IgG2b/κ型,3B5和4C6均为IgG1/κ型。本发明所制备的针对RPV EP0蛋白的单克隆抗体能够为进一步分析EP0蛋白的功能提供研究基础。(The invention discloses a monoclonal antibody of porcine pseudorabies virus EP0 protein, a preparation method and application, belonging to the technical field of genetic engineering, wherein the monoclonal antibody comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, the amino acid sequence of the heavy chain variable region is shown as SEQ ID No.5, and the amino acid sequence of the light chain variable region is shown as SEQ ID No. 11. The invention screens and obtains 3 hybridoma cell strains 2C5, 4C6 and 3B5 which can stably secrete monoclonal antibodies which can specifically react with EP0 protein. Through monoclonal antibody subtype identification, 2C5 is IgG 2B/kappa type, and 3B5 and 4C6 are both IgG 1/kappa type. The monoclonal antibody aiming at the RPV EP0 protein prepared by the invention can provide a research basis for further analyzing the function of the EP0 protein.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种猪伪狂犬病毒EP0蛋白的单克隆抗体、制备方法和应用。
背景技术
猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，猪疱疹病毒属。PRV可以感染多种家畜及野生动物，主要引起发热﹑奇痒(猪除外)以及脑脊髓炎等症状，危害极其严重，是OIE规定必须上报的疫病之一。母猪感染PRV后，能够引起母猪繁殖障碍，如怀孕母猪的流产、死胎、弱胎甚至木乃伊胎。仔猪感染PRV后，能够引起仔猪出现神经症状，2周龄内的仔猪会发病死亡，致死率高达100％。成年猪耐过后呈现潜伏感染的特点，这也是其难以防治的重要原因。PRV病毒粒子呈椭圆或圆形，直径110-150nm之间，主要由脂质间膜、间质层、核衣壳以及病毒基因组四部分组成。其基因组为线性双链DNA，长约150kb，可分为独特长片段(UL)、独特短片段(US)及短区段两侧的末端重复序列(TRS)和内部重复序列(IRS)。全长基因组可编码73个基因，根据转录时间顺序，可分为立早、早期、早/晚、晚期四类基因。EP0是PRV基因组编码的最主要的早期基因。迄今为止，EP0蛋白的功能尚未完全研究清楚，但PRV的EP0与HSV-1的ICP0同源，在结构和功能上应有相似之处，故推测EP0蛋白可能在PRV的潜伏感染和激活过程中起着重要作用。有研究表明EP0是病毒基因组转录和复制的一个转录激活因子，体外提取的EP0重组蛋白可在细胞核提取物中促进人工合成的TATA box的启动子转录的起始。此外，EP0蛋白还具有拮抗干扰素调节的抗病毒作用，有利于PRV在宿主体内建立潜伏感染。
为了深入研究EP0蛋白在病毒感染中发挥的作用，并实现对PRV病毒感染的准确诊断，开发EP0蛋白特异性单克隆抗体，对深入研究EP0蛋白生物学功能具有重要意义，也将有助于PRV诊断检测试剂的开发。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病毒EP0蛋白的单克隆抗体、制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明使用原核表达系统表达并纯化了EP0蛋白，免疫BALB/c小鼠，制备了特异性针对PRV EP0的单克隆抗体，并分析了单克隆抗体的特性，为更好地研究EP0蛋白功能提供了物质基础。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种猪伪狂犬病毒EP0蛋白的单克隆抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。
进一步地，还包括前导序列和恒定区；所述重链前导序列的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述轻链前导序列的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
本发明还提供编码如上述的单克隆抗体的基因，编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQID No.8所示。
本发明还提供包含上述的基因的表达载体。
本发明还提供包含上述的表达载体的宿主细胞。
本发明还提供一种如上述的单克隆抗体的制备方法，包括培养上述的宿主细胞，表达抗猪伪狂犬病毒EP0蛋白的单克隆抗体的步骤。
本发明还提供如上述的单克隆抗体在制备检测或辅助诊断猪伪狂犬病毒的试剂中的应用。
本发明还提供如上述的单克隆抗体在制备检测或辅助诊断猪伪狂犬病毒EP0蛋白的试剂中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
全长EP0基因中的GC含量为69％，GC含量较高，导致EP0基因扩增难度较高，本发明采用在扩增体系中加入DMSO的方式，增加其扩增效率，成功扩增了EP0全长基因。
本发明利用原核表达系统表达了PRV的EP0蛋白，并使用镍柱进行纯化，将纯化的重组EP0蛋白免疫BALB/c小鼠，并在其血清效价达到要求后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，通过ELISA筛选获得了3株能够稳定分泌与EP0蛋白发生特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C5、4C6和3B5，成功制备了EP0蛋白的单克隆抗体。经IFA和Western blot验证，3株单克隆抗体均可与感染PRV的PK-15细胞特异性反应，证明其具有良好的特异性。单克隆抗体亚型鉴定结果显示2C5为IgG2b/κ型，3B5和4C6均为IgG1/κ型。综上所述，本发明所制备的针对RPV EP0蛋白的单克隆抗体能够为进一步分析EP0蛋白的功能提供研究基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为EP0基因的PCR扩增；其中，M：DNA 分子质量标准；1：EP0基因扩增产物；
图2为EP0蛋白的SDS-PAGE及Western Blot鉴定；其中，A：EP0蛋白的SDS-PAGE鉴定；B：EP0蛋白的Western Blot鉴定；M：预染蛋白分子质量标准；1：EP0蛋白16℃表达沉淀；2：EP0蛋白16℃表达上清；3：EP0蛋白25℃表达沉淀；4：EP0蛋白25℃表达上清；5：EP0蛋白37℃表达沉淀；6：EP0蛋白37℃表达上清；7：pET28a空载对照；
图3为EP0蛋白的纯化；其中，M：预染蛋白分子质量标准；1：EP0纯化前；2：EP0纯化后；3：pET28a空载对照；
图4为MAb 4C6、2C5和3B5和重组EP0蛋白反应的WB检测；其中，1：重组EP0蛋白；2：pET28a空载对照；
图5为MAb 4C6、2C5和3B5与PRV的IFA结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1.材料和方法
1.1毒株、载体和试剂
PRV HB1201毒株是2012年从河北分离并保存在陕西省安康学院；PET28a载体、PK-15细胞和SP2/0细胞均由陕西省安康学院保存。病毒基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；EcoRI和HindIII限制性内切酶购自NEB公司；pEASY-blunt载体、Trans 5α感受态、BL21感受态、BL21(DE3)感受态、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、抗His标签单克隆抗体、HRP标记的抗鼠二抗、FITC标记抗鼠二抗和Western Blot kit均购自北京全式金生物技术有限公司；KOD Fx Neo购自ToYoBo公司；单抗亚类鉴定试剂盒购自博奥龙免疫技术有限公司。
1.2 EP0基因扩增
以GenBank中PRV HB1201株EP0基因序列(No.KU057086.1)为模板，扩增EP0全长基因。
上游引物为EP0-F(SEQ ID No.13)：CGGAATTCGACTGCCCCATCTGCCTGGACGTC，下游引物为EP0-R(SEQ ID No.14)：CCCAAGCTTTCAGTCGTCGTCCTGGGTGA，其中划横线部分分别为EcoRI和HindIII酶切位点。
EP0基因扩增体系：KOD Fx Neo:1μl；2×PCR Buffer:25μl；2mM dNTPs:10μl；EP0-F:0.5μl；EP0-R:0.5μl；PRV DNA:2μl；DMSO:0.5μl；ddH2O:10.5μl。
扩增程序:98℃2min；98℃10s，60℃30s，68℃30s(35循环)；68℃7min；4℃∞。
将扩增的EP0基因经胶回收后连接pEasy-blunt载体，并转化Trans 5α感受态细胞，经PCR鉴定和测序分析获得正确的重组pEASY-blunt-EP0并提取其质粒。
1.3 EP0基因原核表达载体的构建
将pEASY-blunt-EP0重组质粒经EcoRI和HindIIII双酶切后，与同样酶切处理的pET28a载体连接，构建重组pET28a-EP0质粒，并将其转化至Trans 5α感受态细胞。将阳性菌落经PCR鉴定后进行测序分析，挑选测序正确的阳性克隆扩繁后提取其质粒。
1.4重组EP0蛋白的原核表达鉴定及纯化
将pET28a-EP0重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆菌落扩繁并进行表达。当菌液OD600达到0.6～0.8时，添加终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，分别在16℃、25℃和37℃过夜诱导表达，同时设立pET28a空载表达菌作为阴性对照。诱导完成后分别收集菌体蛋白沉淀和上清，用SDS-PAGE和Western Blot验证其表达情况。在确定重组EP0蛋白最佳的表达条件后，将其大量表达并进行Ni柱纯化。
1.5 EP0蛋白单克隆抗体(mAb)的制备
取纯化后的重组EP0蛋白与弗氏完全或不完全佐剂进行小鼠多次免疫，并在二次免疫7d后，取小鼠尾血并用间接ELISA方法对血清抗体效价进行测定。待血清抗体效价达到1:10000以上时，表面重组蛋白免疫效果良好，对其进行三次免疫和加强免疫后可取小鼠脾脏进行细胞融合并对杂交瘤细胞孔进行阳性筛选。具体免疫、效价测定、融合及阳性克隆筛选操作步骤采用本领域常规方法进行。
1.6 MAb WB鉴定
将表达纯化后的重组EP0蛋白进行SDS-PAGE分离后转移到硝酸纤维素膜(NC膜)后用40g/L脱脂乳-PBS室温封闭2h。以筛选的MAb作为一抗，以SP2/0细胞培养液作为阴性对照，37℃孵育1h。PBST洗涤3次，每次5min。以HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗(1:10000稀释)，37℃反应1h后进行洗涤。用ECL底物显色液进行显色后观察结果。
1.7 MAb亚型鉴定
使用小鼠单抗亚类鉴定试剂盒鉴定所获得的MAb亚型，具体步骤如下：将纯化的重组EP0蛋白包被酶标板(100μl/孔)后4℃过夜。将筛选的阳性杂交瘤细胞培养上清加至包被的酶标板中(100μl/孔)，37℃孵育30min，PBST清洗5遍；将试剂盒的八种HRP标记物加入酶标板中(100μl/孔)，37℃孵育30min，PBST清洗5遍，随后加入TMB显色液(100μl/孔)，室温避光显色20min，2M H2SO4终止反应后用酶标仪进行读数即可判定结果。
1.8 MAb间接免疫荧光鉴定
将状态良好的PK-15细胞铺于24孔细胞培养板，待细胞长至90％以上时，感染1MOI的PRV HB1201株，并设置未感染组作为阴性对照。在PRV感染6h后，弃掉培养基，加入无水冰乙醇固定细胞，室温固定15min后PBS洗3次，加入阳性杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1h后PBS洗3次，再加入FITC标记的山羊抗鼠IgG，37℃避光孵育1h，置于倒置荧光显微镜下观察。
2.结果
2.1 EP0基因的扩增
以RPV HB1201株为模板，成功扩增了EP0基因(图1)，目的基因片段大小为1101bp，大小与理论值相符。将其进一步连接如pEASY-blunt和pET28a载体，通过测序证实其序列及插入位置准确无误。
2.2 EP0蛋白的表达与鉴定
将正确构建的pET28a-EP0重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞后，经过不同温度(16℃、25℃、37℃)诱导表达后对其进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定。如图2所示，SDS-PAGE(图2A)结果表明，在不同表达温度的沉淀和上清中均能看到EP0表达条带，大小约为65ku，以16℃沉淀、25℃沉淀、25℃上清和37℃沉淀中表达居多。Western Blot(图2B)结果也表明，16℃沉淀、25℃沉淀、25℃上清和37℃沉淀反应条带较明显。为了方便纯化，本试验选取25℃诱导表达条件进行大量表达，并对其表达上清进行镍柱纯化。
2.3 EP0蛋白的纯化
选取25℃诱导温度对EP0进行大量表达并对其上清通过镍柱纯化，纯化后利用SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示，纯化后EP0蛋白浓度达到85％以上，将其分装存放于-20℃后用于小鼠免疫。
2.4单克隆抗体的筛选和亚型鉴定
经细胞融合成功进行ELISA检测并进行三次亚克隆后，筛选出三株杂交瘤阳性细胞株，如表1所示，分别命名为2C5、3B5和4C6。用单抗亚类鉴定试剂盒分别对获得的三株阳性杂交瘤分泌的抗体亚型进行测定，结果显示2C5为IgG2b/κ型，3B5和4C6均为IgG1/κ型。
表1单克隆抗体的ELISA及亚型鉴定
2.5单克隆抗体的WB鉴定
为了进一步验证所筛选的单克隆抗体的特性，利用WB检测所获得的三株抗体与重组EP0蛋白的反应情况。如图4所示，MAb 4C6、2C5和3B5均能和重组EP0蛋白反应，且不与pET-28a空载体对照反应，说明获得的三株单克隆抗体能够特异性识别EP0蛋白。
2.6单克隆抗体的IFA鉴定
以获得的三株MAb作为一抗，对PRV感染的PK-15细胞进行IFA分析。结果如图5所示，MAb 2C5和4C6均能与PRV感染的PK-15细胞反应，而3B5不能与PRV感染的PK-15细胞反应。
经效价测定，MAb 2C5和4C6效价均能达到1：32000以上，MAb 3B5效价能达到1：8000。
2.7单克隆抗体可变区基因与序列
对单克隆抗体2C5进行测序，其结果如下：
(1)重链：
1)小鼠IgG1，DNA序列(D46642/G943401H)：
前导序列(SEQ ID No.1)：ATGGAAAGGCACTGGATCTTTCTACTCCTGTTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCC；
可变区序列(SEQ ID No.2)：CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCAGCAACACTATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGCATACATTAATCCTAGCAGTGGTTATGTATATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCACTCTATTACTGTGCAAGAGGAGGTTACCACGGTGGTAACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCGCCGTCTCCTCA；
恒定区(SEQ ID No.3)：GCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCACTG；
2)氨基酸序列：
前导序列(SEQ ID No.4)：MERHWIFLLLLSVTAGVHS；
可变区序列(SEQ ID No.5)：QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTSNTMHWVKQRPGQGLEWIAYINPSSGYVYYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSALYYCARGGYHGGNYAMDYWGQGTSVAVSS；
恒定区(SEQ ID No.6)：AKTTPPSVYPL；
(2)轻链：
1)小鼠κ，DNA序列(D46652/G943401K)：
前导序列(SEQ ID No.7)：ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATATTGCTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGG；
可变区序列(SEQ ID No.8)：GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCAAGCAATCTTATAATCTGTACGCGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA；
恒定区(SEQ ID No.9)：CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCAATCGTCGACC；
2)氨基酸序列：
前导序列(SEQ ID No.10)：MDSQAQVLILLLLWVSGTCG；
可变区序列(SEQ ID No.11)：DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLYAFGGGTKLEIK；
恒定区(SEQ ID No.12)：RADAAPTVSIFQSST。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 国家开放大学
<120> 一种猪伪狂犬病毒EP0蛋白的单克隆抗体、制备方法和应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaaaggc actggatctt tctactcctg ttgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcc 57
<210> 2
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggtccagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacctttacc agcaacacta tgcactgggt aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattgcatac attaatccta gcagtggtta tgtatattac 180
aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcactct attactgtgc aagaggaggt 300
taccacggtg gtaactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt cgccgtctcc 360
tca 363
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccaaaacaa cacccccatc agtctatcca ctg 33
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Glu Arg His Trp Ile Phe Leu Leu Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 5
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Val Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr His Gly Gly Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
1 5 10
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggattcac aggcccaggt tcttatattg ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60
<210> 8
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 300
tacgcgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttccaatcgt cgacc 45
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Cys Gly
20
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
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Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Gln Ser Ser Thr
1 5 10 15
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cggaattcga ctgccccatc tgcctggacg tc 32
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccaagcttt cagtcgtcgt cctgggtga 29