一种高纯度安丝菌素的制备方法
阅读说明：本技术 一种高纯度安丝菌素的制备方法 (Preparation method of high-purity ansamitocin ) 是由 肖红亮 刘吉东 郭明 袁建栋 于 2020-03-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于工业微生物技术领域,具体涉及一种高纯度安丝菌素的制备方法。本发明的高纯度安丝菌素的制备方法,包括以下步骤：对安丝菌素发酵液进行预处理,之后加入助滤剂压滤得到菌丝渣；用极性溶剂对菌丝渣进行浸提,过滤,得到浸提液；浓缩除去浸提液中的溶剂,得浓缩液,然后加入不相溶于水的萃取剂进行萃取；将萃取出的有机相依次进行浓缩、降温结晶,得到安丝菌素粗品A；将粗品A用混合溶剂结晶得到粗品B,所述混合溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷中的任意一种与正己烷、正庚烷中的任意一种的组合；用极性混合溶剂对粗品B进行结晶,得到晶体C,干燥即得高纯度安丝菌素成品。本发明方法得到的安丝菌素纯度达到92％以上。(The invention belongs to the technical field of industrial microorganisms, and particularly relates to a preparation method of high-purity ansamitocin. The preparation method of the high-purity ansamitocin comprises the following steps: pretreating ansamitocin fermentation liquor, and then adding a filter aid for filter pressing to obtain hypha residues; leaching the mycelium residues with a polar solvent, and filtering to obtain a leaching solution; concentrating to remove solvent in the leaching solution to obtain concentrated solution, and then adding an extractant which is not dissolved in water for extraction; concentrating the extracted organic phase, cooling and crystallizing to obtain crude ansamitocin A; crystallizing the crude product A with a mixed solvent to obtain a crude product B, wherein the mixed solvent is a combination of any one of ethyl acetate and dichloromethane and any one of n-hexane and n-heptane; and crystallizing the crude product B by using a polar mixed solvent to obtain a crystal C, and drying to obtain a high-purity ansamitocin finished product. The purity of the ansamitocins obtained by the method provided by the invention reaches more than 92%.)
技术领域
本发明属于工业微生物
技术领域
，具体涉及一种高纯度安丝菌素的制备方法。背景技术
安丝菌素(Ansamitocin，结构如式1所示)是一种美登素类(Maytansinoid)抗生素，主要是从微生物比如橙色珍贵束丝放线菌(ActinosynnemapretiosumATCC31565)发酵生产或高等植物中分离获得，具有抗肿瘤、抗结核杆菌、抗细菌等多种药理活性。
Higsahide等人在1977年从诺卡氏菌C-15003的发酵液中分离出的一种新的有潜在抗癌活性的安莎霉素，组分按C-3连接不同长度的碳链，可分为P-0、P-1、P-2、P-3、P-3'、P-4和P-4'，其中连接异丁基的安丝菌素P-3(AP-3)的活性最强，在所有发酵产生的安丝菌素中产量也较高，所以安丝菌素P-3常作为发酵的目标产物，其能通过阻碍微管形成从而阻止细胞的有丝分裂使细胞死亡，在体外及荷瘤动物中具有显著的抗肿瘤作用。
安丝菌素P-3是抗肿瘤药DM1的化学前体。DM1是一种叫做美登醇的化疗药物经过化学修饰合成后的一种化学小分子，DM1可以通过连接分子(linker)与具有靶向性的抗体偶联，制备成具有靶向性的抗肿瘤药物，减少化疗的副作用，并增强疗效。罗氏公司用于治疗乳腺癌的新药T-DM1(trastuzumab-DM1,曲妥珠单抗-DM1)即抗体药物赫赛汀-DM1的偶联药物，在晚期乳腺癌患者身上使用可使肿瘤生长发展时间比拉帕替尼推迟3.2个月。
目前，关于安丝菌素的文献多为发酵工艺类报道，少数关于分离纯化的文献所述方法也较为模糊或工艺太过复杂，偏向于少量样品制备，不适于大规模生产。如CN102731526A、CN102732581A和US7432088所述方法需要用到正相硅胶层析或中压反向硅胶层析；而US6573074B2和US20020015984采用全发酵液萃取，消耗溶剂量太大，且萃取前需要将发酵液加热至75℃，会导致萃取溶剂大量挥发污染环境和增加操作风险。
因此，本领域急需找到一种提高产品的收率和纯度的同时，降低生产成本、操作步骤简单且对环境较为友好的纯化方法，以克服上述现有技术中存在的缺陷，满足工业化生产的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高纯度安丝菌素的制备方法，该方法得到的安丝菌素同时具有较高的纯度和收率。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种高纯度安丝菌素的制备方法，包括以下步骤：
1)对安丝菌素发酵液进行预处理，之后加入助滤剂压滤得到菌丝渣；
2)用极性溶剂对步骤1)中的菌丝渣进行浸提，过滤，得到浸提液；
3)浓缩除去步骤2)浸提液中的溶剂，得浓缩液，然后向浓缩液中加入不相溶于水的萃取剂进行萃取；
4)将萃取出的有机相依次进行浓缩、降温结晶，得到安丝菌素粗品A；
5)将步骤4)中的粗品A用混合溶剂结晶得到粗品B，所述混合溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷中的任意一种与正己烷、正庚烷中的任意一种的组合；
6)用极性混合溶剂对粗品B进行结晶，得到晶体C，干燥即得高纯度安丝菌素成品，所述极性混合溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的任意一种与水的组合；
步骤1)中的预处理为调节安丝菌素发酵液的pH至2.0～5.0。优选的，调节安丝菌素发酵液的pH至3.8～4.2。通过上述调节pH可以使安丝菌素发酵液中的蛋白质和菌丝体聚集成团，提高过滤效率。
步骤1)中的助滤剂为珍珠岩或硅藻土。
步骤1)中每升安丝菌素发酵液对应加入20～60g助滤剂。优选的，每升安丝菌素发酵液对应加入30～50g助滤剂。
步骤2)中的极性溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的任意一种或几种，每千克菌丝渣对应使用2～5L极性溶剂进行浸提。优选的，每千克菌丝渣对应使用3～4L极性溶剂进行浸提。
步骤2)中浸提的时间为6～15h。优选的，浸提时间为6～8h。
步骤3)中不相容于水的萃取剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷或甲苯，所述萃取剂的加入量为浓缩液体积的0.5～2倍，萃取的时间为1～5h。优选的，所述萃取剂的加入量为浓缩液体积的1～2倍，萃取的时间为4～5h。
步骤4)中降温至0～30℃结晶。优选的，降温至20～30℃。
步骤6)中的干燥为减压干燥。
所述减压干燥的温度为30～60℃，时间为8～16h。
步骤5)中乙酸乙酯、二氯甲烷中的任意一种与正己烷、正庚烷中的任意一种的体积比为1：0.5～5。
步骤6)极性混合溶剂中甲醇、乙醇或丙酮与水的体积比均为1：0.1～5。
步骤3)和步骤4)中的浓缩均为减压浓缩。所述减压浓缩的温度为45～60℃。
步骤4)中浓缩后结晶前的体系中安丝菌素的浓度为10～30g/L。优选为20～30g/L。
本发明高纯度安丝菌素的制备方法，与现有技术相比，主要优点在于，本发明中经过萃取剂萃取第一次结晶处理后的粗品A中强极性杂质和影响含量的非色谱杂质几乎完全去除，产品含量大幅提升；然后经过第二次结晶去除绝大部分色素以及第三次极性混合溶剂结晶调节P-2、P-4等组分比例，安丝菌素P-3单组分HPLC纯度达到92.8％，安丝菌素多组分HPLC总纯度达到99.6％。另外，本发明方法不使用硅胶纯化工艺，不会消耗大量溶剂以及产生废硅胶等固体废物，对环境较为友好且节约大量成本。
本发明的高纯度安丝菌素的制备方法，不仅提高了产品质量，而且在较大程度上减轻了工艺操作和对设备的要求，降低了生产成本，而且对环境友好，适合工业化生产。
附图说明
图1为实施例1中浸提液的HPLC图谱；
图2为实施例1中安丝菌素粗品A的HPLC图谱；
图3为实施例1中高纯度安丝菌素白色晶体的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不意味着对本发明有任何限制。
实施例1
本实施例高纯度安丝菌素的制备方法，包括以下步骤：
1)安丝菌素发酵液放罐4000L，发酵单位为624ug/ml(安丝菌素含量2496g)，采用盐酸将安丝菌素发酵液pH调节至4.05，之后加入珍珠岩120kg，板框压滤，得到739kg菌丝渣；
2)将步骤1)中的菌丝渣用3200L乙醇浸提，搅拌8h，压滤，得到浸提液3500L，安丝菌素的浓度606ug/ml(安丝菌素的质量为2121g)，对浸提液进行HPLC分析，HPLC的图谱见图1，具体数据见表1，由表1可知，此时安丝菌素P-3的纯度为74.8％；
3)将步骤2)中的浸提液于50℃下浓缩至无溶剂流出，剩余约1600L，加入1000L乙酸丁酯，室温下搅拌萃取2h，分液，得到萃取有机相900L，安丝菌素的浓度2056ug/ml(安丝菌素的质量为1850g)；
4)将步骤3)中的萃取有机相进行浓缩，降温至20℃结晶，得安丝菌素粗品A3110g，粗品A中目标物安丝菌素P-3的含量56％(1741g)；对安丝菌素进行HPLC分析，HPLC的图谱见图2，具体数据见表2，由表2数据可得，安丝菌素P-3的纯度为84.6％；
5)将粗品A加入35L乙酸乙酯-正己烷的混合溶剂(乙酸乙酯与正己烷的体积比为1：1)进行结晶，得到粗品B 2295g，其中粗品中安丝菌素P-3的含量63％(1446g)；
6)向粗品B中加入40L丙酮水溶液(丙酮与水的体积比为1：1.67)进行结晶，得到潮晶C1354g，潮晶C中安丝菌素P-3的含量58％(785g)；
7)将潮晶C于45℃减压干燥12h，得到高纯度安丝菌素白色晶体959g，对高纯度安丝菌素白色晶体进行HPLC分析，其HPLC的图谱见图3，其数据见表3，安丝菌素P-3纯度92.8％，安丝菌素多组分总纯度99.6％，P-3单组分含量92.0％(882g)，总收率35.3％。
本实施例中对安丝菌素的HPLC检测方法具体如下：
反相HPLC分析采用的色谱柱为C18(4um，4.6*250mm)，柱温40℃；以乙腈(B)-水(A)体系梯度洗脱，流速为1.0ml/min，并在234nm下UV检测，运行50min；待测样品用乙腈溶解成浓度约500ug/ml，进样量为20ul。
上述梯度洗脱具体为：0min，55％A相，45％B相；20min，55％A相，45％B相；35min，20％A相，80％B相；40min，20％A相，80％B相；41min，55％A相，45％B相；50min，55％A相，45％B相。
表1安丝菌素浸提液的HPLC数据
表2安丝菌素粗品A的HPLC数据
表3高纯度安丝菌素白色晶体的HPLC数据
峰号
化合物名
保留时间(min)
面积(mAU*s)
面积％
1
5.946
4.30497
0.0322
2
9.141
4.47450
0.0335
3
AP-2
13.573
715.95087
5.3581
4
14.582
12.70156
0.0951
5
AP-3
18.101
1.23964e4
92.7739
6
AP-3'
19.237
100.97854
0.7557
7
25.329
33.90541
0.2537
8
AP-4
26.318
93.22408
0.6977
总计
1.33619e4
100.0000
实施例2
本实施例高纯度安丝菌素的制备方法，包括以下步骤：
1)安丝菌素发酵液放罐4300L，发酵单位为574ug/ml(安丝菌素含量2648g)，采用盐酸将安丝菌素发酵液pH调节至4.02，之后加入珍珠岩120kg，板框压滤，得到726kg菌丝渣；
2)将步骤1)中的菌丝渣用2600L乙醇浸提，搅拌6h，压滤，得到浸提液3700L，安丝菌素的浓度594ug/ml(安丝菌素的质量为2198g)；
3)将步骤2)中的浸提液于50℃下浓缩至无溶剂流出，剩余约1500L，加入1500L甲苯，室温下搅拌萃取4h，分液，得到萃取有机相1060L，安丝菌素的浓度1692ug/ml(安丝菌素的质量为1793g)；
4)将步骤3)中的萃取有机相进行浓缩，降温至30℃结晶，得粗品A 3464g，安丝菌素P-3的含量49％(1697g)；
5)将粗品A加入35L乙酸乙酯-正庚烷的混合溶剂(乙酸乙酯与正庚烷的体积比为1：2.5)进行结晶，得到粗品B 2710g，安丝菌素P-3的含量60％(1626g)；
6)向粗品B中加入26L丙酮水溶液(丙酮与水的体积比为1：1)进行结晶，得到潮晶C1461g，安丝菌素P-3的含量77％(1125g)；
7)将潮晶C于45℃减压干燥12h，得到高纯度安丝菌素白色晶体1198g，安丝菌素P-3纯度92.7％，安丝菌素多组分总纯度99.5％，P-3单组分含量93.6％(1121g)，总收率42.3％。
实施例3
本实施例高纯度安丝菌素的制备方法，包括以下步骤：
1)安丝菌素发酵液放罐3800L，发酵单位为585ug/ml(安丝菌素含量2223g)，采用盐酸将安丝菌素发酵液pH调节至3.8，之后加入珍珠岩120kg，板框压滤，得到698kg菌丝渣；
2)将步骤1)中的菌丝渣用3800L乙醇浸提，搅拌8h，压滤，得到浸提液3800L，安丝菌素的浓度495ug/ml(安丝菌素的质量为1881g)；
3)将步骤2)中的浸提液于50℃下浓缩至无溶剂流出，剩余约1600L，加入1200L甲苯，室温下搅拌萃取1h，分液，得到萃取有机相1300L，安丝菌素的浓度1432ug/ml(安丝菌素的质量为1862g)；
4)将步骤3)中的萃取有机相进行浓缩，降温至10℃结晶，得粗品A 2760g，安丝菌素P-3的含量59％(1628g)；
5)将粗品A加入35L乙酸乙酯-正己烷的混合溶剂(乙酸乙酯与正己烷的体积比为1：0.75)进行结晶，得到粗品B 2469g，安丝菌素P-3的含量61％(1506g)；
6)向粗品B中加入30L丙酮水溶液(丙酮与水的体积比为1：2)进行结晶，得到潮晶C1391g，安丝菌素P-3的含量71％(988g)；
7)将潮晶C于45℃减压干燥10h，得到高纯度安丝菌素白色晶体959g，安丝菌素P-3纯度94.0％，安丝菌素多组分总纯度99.4％，P-3单组分含量94.2％(903g)，总收率40.6％。
在本发明的其它实施例中，步骤1)中的助滤剂珍珠岩可以替换为硅藻土。
在本发明的其它实施例中，步骤2)中还可以采用甲醇、丙酮或乙酸乙酯对菌丝渣进行浸提。
在本发明的其它实施例中，步骤3)中的萃取剂还可以为乙酸乙酯或二氯甲烷。
在本发明的其它实施例中，步骤5)中的混合溶剂还可以为二氯甲烷-正己烷或二氯甲烷-正庚烷。
在本发明的其它实施例中，步骤6)中的极性混合溶剂为甲醇的水溶液或乙醇的水溶液。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。