具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1试验材料

1.1供试菌株

萨姆松链霉菌XJC-2-6(Streptomyces samsunensis XJC-2-6)(下文简称“链霉菌2-6”)从采集自中国南海珊瑚样品中分离、筛选得到，于2017年10月23 日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017620。其形态特征、培养特征、生理生化特征和16S rRNA分子生物学特征鉴定等参见“专利号：201711435432.5，专利名称：一种萨姆松链霉菌及其应用”的中国专利，本发明在此不再赘述。

1.2供试病原菌

香蕉枯萎病菌4号生理小种F.oxysporum f.sp.cubense Race 4(ATCC 76255)(Foc TR4)。

1.3供试培养基

本章研究中所用主要培养基见表1。

表1发酵培养基及配方

1.4主要试剂

本研究使用的主要试剂见表2。

表2主要生化试剂及来源

1.5主要仪器

本研究所用部分主要仪器见表3。

表3主要仪器

2试验方法和结果

所有实验一式三份进行，设置三个重复，数据结果表示为平均值±标准偏差(SD)。通过方差分析(ANOVA；SAS 9.2)评估每个处理中获得的平均值之间的差异，p<0.05表示统计学上差异显著。

2.1链霉菌发酵及代谢产物提取

将链霉菌2-6接入ISP2液体培养基中，于28℃、180r/min条件下，震荡培养4d。按5％的接种量，将新鲜的菌液接入装有1L M6液体培养基的5L三角瓶中，于28℃180r/min振荡培养8d，获得发酵液120L。以1:1(v/v)比例与无水乙醇混合，超声萃取1h，过滤并收集上清液，45℃条件下减压浓缩所10L。用乙酸乙酯以1:1(v/v)体积超声萃取5次(2L/次，30min)，合并乙酸乙酯相，45℃条件下减压浓缩，除去乙酸乙酯，得到乙酸乙酯浸膏26.33g。经活性检验，乙酸乙酯浸膏对Foc TR4病原菌具有明显的抑菌活性。

2.2 TLC检测

TLC分析方法，用0.3mm毛细吸管吸取样品，距离GF254硅胶板底部1cm 处点样，待溶剂挥发干后进行展开。采用直立上行展开法对样品进行展开，在层析缸中预先加入展开剂，20min后置入薄层层析板，进行层析，当展开剂的前沿距离硅胶板边缘1.0cm时取出硅胶层析板，并标记溶剂前沿的位置，在紫外分析仪254nm处观察结果并计算Rf值。

2.3 TLC-bioautography生物活性测定

以香蕉枯萎病4号生理小种(Foc TR4)为靶标病原菌，采用TLC-生物自显影法(TLC-bioautography)进行代谢产物抑菌活性检测。配置PDA培养基，接入 Foc TR4，于24℃下培养7-10d，加入10mL无菌水洗脱孢子，制备分生孢子悬浮液，加入适量PDB液体培养基，配成浓度为3.0×10⁵孢子/mL的孢子悬浮混合液。粗提物溶解在甲醇中配制成20mg/mL的浓度，使用标定的毛细管在TLC板上点4μL和8μL的样品，在TLC板上均匀喷洒(Foc TR4)孢子悬浮液(3.0×10⁵孢子/mL)三次，将TLC板置于湿润的盒子里，于25℃培养箱中12h光照，12h黑暗，昼夜交换培养4d，当TLC板上出现空白区，表明真菌生长受抑制，该粗提物中含有抗真菌成分，并记录抑菌圈直径。

2.4乙酸乙酯浸膏硅胶柱层析

用甲醇将乙酸乙酯浸膏溶解，加入等体积正己烷，萃取三次，除去浸膏中油脂等小极性组分，剩下甲醇层样品完全干燥后，加入少量CH₂Cl₂(DCM)溶解(未完全溶解需滴加少许MeOH)，称取等量100-200目硅胶，滴加样液均匀拌样，待硅胶样品完全干燥后备用。取少量样品进行硅胶薄层层析(TLC)检测，选择CH₂Cl₂/MeOH体系作为洗脱液，将浸膏进行正相硅胶柱层析(200-300目)。用 CH₂Cl₂/MeOH体系进行梯度洗脱(v/v:100％CH₂Cl₂，100:1，80:1，60:1，40:1， 30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，100％MeOH)，收集流分，每管收集10mL，经 TLC检测合并得7个组分(Fr.A～Fr.G)。采用TLC-bioautography法进行抑菌活性检测，靶标病原菌为Foc TR4，得活性组分Fr.A。活性组分甲醇溶出反复进行硅胶柱层析纯化。

链霉菌2-6乙酸乙酯浸膏经硅胶薄层层析(TLC)点样检测后，选取 CH₂Cl₂/MeOH体系作为流动相洗脱。将26.33g粗提物经硅胶柱层析(200-300 目)，CH₂Cl₂/MeOH体系梯度洗脱(v/v:100％CH₂Cl₂，100:1，80:1，60:1，40:1， 30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，100％MeOH)，共收集65管流分，经TLC检测后，合并得7个组分Fr.A(2.0782g)，Fr.B(3.0783g)，Fr.C(5.5961g)，Fr.D(0.7065 g)，Fr.E(1.3725g)，Fr.F(0.9760g)，Fr.G(1.5719g)，Foc TR4为靶标病原菌，经TLC-direct bioautography抑菌活性检测，得到主要活性组分Fr.A(2.0782g)。

2.5活性组分Sephadex LH-20凝胶柱层析

经硅胶柱层析、TLC检测、生物活性测定后所得活性组分，用少量甲醇溶解，湿法上样，经Sephadex LH-20凝胶柱层析分离(3cm×150cm)。用 CH₂Cl₂/MeOH(v/v:2:1)流动相进行洗脱，收集流分，每管收集8mL，经TLC 检测合并得组分。采用TLC-bioautography法进行抑菌活性检测，靶标病原菌为 Foc TR4，得活性组分Fr.A-4。

将活性组分Fr.A经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用CH₂Cl₂/MeOH(2:1) 洗脱剂进行洗脱，共收集51管流分，经TLC检测后，合并得5个组分Fr.A-1 (0.9233g)，Fr.A-2(0.1685g)，Fr.A-3(0.2759g)，Fr.A-4(0.3396g)，Fr.A-5(0.1922 g)，经TLC-directbioautography抑菌活性检测，得到较高活性组分Fr.A-4(0.3396 g)。

2.6活性组分RP-HPLC分离纯化

高效液相色谱半制备条件为：Agilent 1100，UV/RID检测器，柱温30℃；色谱柱为YMC Pack ODS-A(250×10mm，5μm)；流动相为MeOH/H2O；检测波长分别为210，230,254和305nm；手动进样，进样量为50μL；流速为0.2 mL/min。

经Sephadex LH-20凝胶柱层析得到的活性组分Fr.A-4，通过RP-HPLC反复分离纯化，得到高纯度单体化合物A1(5.1mg,MeOH:H₂O＝60:40,2mL/min,tR ＝59min)、A5(9.1mg,MeOH:H₂O＝60:40,2mL/min,tR＝59min)、A6(3.2mg, MeOH:H₂O＝60:40,2mL/min,tR＝59min)、A7(15.3mg,MeOH:H₂O＝60:40, 2mL/min,tR＝30.5min)。经抑菌活性检测，确定A7为高活性化合物，进行结构鉴定。

化合物A7为深棕色固体，分子式为C₈H₁₀O₃，熔点133-135，质谱(EI,70eV)), m/z:154[M]⁺,139,121,109,95,79。¹H-NMR(600MHz,CD₃OD)δ_H 4.68(1H,d,J ＝2.5Hz,H-3),4.08(1H,d,J＝2.5Hz,H-2),6.00(1H,s,H-5),6.44(1H,m,J＝16.0 Hz,1.2Hz,H-6),6.83(1H,dq,J＝16.0Hz,1.2Hz,H-7),1.94(3H,dd,J＝6.5Hz,1.2 Hz,CH₃-8)；¹³C-NMR(150MHz,CD₃OD)δ_C 205.60(C-1),82.41(C-2),78.11(C-3), 170.83(C-4),125.92(C-5),126.42(C-6),141.83(C-7),19.49(C-8)。¹H-NMR谱显示，在低场区有3个双键氢信号：δ_H 6.83(dq,J＝16.0Hz,1.2Hz,1H)，6.44(m,J＝ 16.0Hz,1.2Hz,1H)，6.00(s,1H)；2个连氧氢信号：δ_H 4.08(d,J＝2.5Hz,1H),4.68 (d,J＝2.5Hz,1H)；高场区有1个甲基氢信号：δ_H 1.94(dd,J＝6.5Hz,1.2Hz,3H)；³C-NMR和DEPT谱显示，该化合物共含有8个碳原子，低场区有1羰基碳信号：δ_C 205.60，4个双键碳信号：δ_C 170.83，141.83，125.92，126.42，确定化合物含有两个双键；2个连氧碳信号：δ_C 82.41，78.11，从化学位移判断为典型的环上羟基取代结构，可推断化合物含有两个羟基取代；高场区有1个甲基碳信号：δ_C 19.49。根据化合物¹H-NMR、¹³C-NMR和DEPT谱，查阅文献比对，发现化合物A7波谱数据与文献中报道一致，确定化合物A7为terrein(Raistrick et al.,1935； Kim et al.,2005；Asfour et al.,2019)。通过2D-NMR图谱解析出化合物A7的平面结构，如图2所示，该化合物核磁数据见表4。

表4化合物A7的NMR数据(J单位：Hz)

¹H-NMR代表600MHz；¹³C-NMR代表150MHz。

2.7活性成分A7对Foc TR4菌丝生长的抑菌作用

链霉菌代谢产物对香蕉枯萎病菌丝生长的抑制活性通过生长速率法进行评估(Sharma et al.,2016；Sharma et al.，2017)。将溶于无菌水(10.0mg/ml)的活性成分A7添加到45-50℃的PDA培养基中，采用2倍连续稀释法制备不同活性成分浓度的PDA平板，平板终浓度分别为100.0、50.0、25.0、12.5、6.25、和3.125μg/mL，以添加等量的无菌水为对照。将Foc TR4的真菌菌饼(Φ＝5mm) 接种到每个平板中央，于28±2℃下培养，直到对照菌丝到达平板边缘。测定各菌落垂直直径的平均值。每个处理重复3次。菌丝生长抑制率的计算公式如下 (Nimaichand et al.,2015)：

式中：C是对照组菌落平均直径，T是处理组菌落平均直径。

采用生长速率法，测定100.0、50.0、25.0、12.5、6.25和3.125μg/mL浓度下活性成分A7对靶标病原菌Foc TR4菌丝生长的影响，如图3所示。通过测量菌落直径和模型计算，求得毒力回归方程，如表5所示，计算得化合物A7的EC₅₀、 EC₇₅和EC₉₅分别为25.76μg/mL、86.30μg/mL和491.37μg/mL。活性成分浓度与菌丝生长抑制呈正相关，浓度越大，抑制作用越强。

表4化合物A7对Foc TR4的抑菌作用

2.8活性成分A7对Foc TR4病原菌形态及细胞内超微结构的影响

分别采用扫描电镜和透射电镜观察法，研究链霉菌活性成分A7对Foc TR4 病原菌菌丝、病原菌分生孢子及病原菌细胞内超微结构的致畸作用。

(1)扫描电镜观察Foc TR4病原菌菌丝体变化

用打孔器在靶标病原菌Foc TR4菌落边缘取0.5cm菌饼接入含活性成分 A7平板中央。28℃培养5d后，在菌落边缘用刀片切取菌丝尖端并尽量切去培养基，用2.5％(w/v)戊二醛溶液4℃固定过夜，磷酸缓冲液漂洗三次，然后用30％、 50％、70％、90％的乙醇逐级脱水一次，100％乙醇脱水两次，每次20min，最后用乙酸异戊酯洗脱乙醇两次，每次30min，真空干燥后喷金观察。

从图4可观察到，对照组的菌丝表面致密光滑，形状均匀、饱满，完整性良好，菌丝周围产生大量小孢子。而经活性成分A7处理后，病原菌菌丝表面粗糙、不平整，菌丝萎缩、变细，完整性遭到破坏，发生断裂和破裂的现象，分生孢子产生受到抑制。通过本实验可以发现化合物A7能够破坏病原菌的菌丝结构，进而抑制了病原菌的生长和分生孢子的产生。

(2)扫描电镜观察Foc TR4病原菌分生孢子变化

制备Foc TR4孢子悬浮液(1×10⁶CFU/mL)，取5μL孢子悬浮液置于载玻片，用5μLEC₅₀浓度的活性成分A7处理，用无菌水处理作为对照，培养24h。载玻片用2.5％戊二醛4℃固定过夜，磷酸缓冲液漂洗三次，然后用30％、50％、70％、 90％的乙醇逐级脱水一次，100％乙醇脱水两次，每次20min，最后用乙酸异戊酯洗脱乙醇两次，每次30min，真空干燥后喷金观察。

链霉菌2-6的活性成分A7对Foc TR4病原菌分生孢子的作用通过扫描电镜进行观察，如图5所示。SEM图像显示经活性成分处理的病原菌，孢子变形、皱缩、塌陷、弯曲和头部肿大，且完整性遭到破坏，发生断裂与破裂的现象。而对照组孢子饱满，表面光滑，孢子形态完整。通过本实验可以发现化合物A7能够破坏病原菌的分生孢子结构，进而抑制了病原菌的生长。

(3)透射电镜观察Foc TR4病原菌细胞超微结构的变化

用打孔器在靶标菌菌落边缘取0.5cm菌饼接入含活性成分A7平板的正中心。28℃培养5d后，在菌落边缘用刀片切取菌丝尖端并尽量切去培养基，用2.5％ (w/v)戊二醛溶液4℃固定过夜，磷酸缓冲液漂洗三次，然后用30％、50％、 70％、90％的乙醇逐级脱水一次，100％乙醇脱水两次，每次20min，再将样品浸入环氧丙烷置换2次，每次20min。将样品在环氧丙烷：环氧树脂(1:1)溶液中浸泡1h进行包埋后，用钻石刀将包埋物切成70nm超薄切片。切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅分别染色30min，用透射电子显微镜进行观察(Phillips etal., 2003)。

链霉菌2-6的活性成分A7对Foc TR4病原菌细胞超微结构的影响如图6所示。透射电镜观察对照组病原菌细胞形态丰满，结构完整，细胞器种类齐全，细胞壁完整，细胞质均匀，线粒体形态规整，体型均匀(图6A)。经活性化合物处理后，Foc TR4病原菌细胞壁明显变薄，细胞器溶解消失，细胞组织崩解，细胞空泡形成，囊泡出现(图6B)；细胞质电子密度增加，线粒体数量明显增多，线粒体形态异常，表现出表面粗糙塌陷、缺乏基质、内外膜清晰可见，嵴肿胀和结构无序(图6C)。

2.9活性成分A7对Foc TR4病原菌生理代谢的影响

(1)活性成分A7对Foc TR4病原菌细胞壁几丁质酶的影响

N-乙酰葡萄糖胺标准曲线：配制100μg/mL的N-乙酰葡萄糖胺标准液，稀释为20，40，60，80，100μg/mL的梯度标准液。取1mL梯度标准液加入试管，再加入0.5mL硼酸钾(0.8mol/L再加入0.5mL硼酸钾溶液(0.8mol/L)，沸水浴3min，冷却后加入3mL质量分数为1％的DMAB(对二甲氨基苯甲醛)，36℃保温20min，冷却，紫外分光光度仪于波长544nm处测定吸光度。以N-乙酰葡萄糖胺含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

在250mL三角瓶中加入100mL PDB培养基，接入Foc TR4病原菌，同时加入不同浓度梯度的活性成分A7(浓度为3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、 25.0μg/mL和50.0μg/mL)，于180r/min，28℃振荡培养5d，5000r/min离心15 min收集菌丝，并用无菌水冲洗菌丝，水洗3次后待测。称取1.0g菌丝，加入5mL Tris-HCl，冰浴中研磨，10000r/min，4℃离心，取上清液于-20℃保存备用。向洁净的试管中加入不同处理的菌体上清液1.0mL，再加入0.5mL硼酸钾溶液(0.8mol/L)，沸水浴3min，冷却后加入3mL质量分数为1％的DMAB(对二甲氨基苯甲醛)，36℃保温20min，冷却，用紫外分光光度仪于波长544nm 处测定吸光度。通过标准曲线计算几丁质水解产物N-乙酰葡萄糖胺含量。

活性成分对Foc TR4病原菌细胞内N-乙酰葡萄糖胺含量变化影响如图7所示。随着活性化合物A7浓度升高，N-乙酰葡萄糖胺含量呈现逐渐上升趋势。化合物A7处理组在0～25μg/mL浓度区间，N-乙酰葡萄糖胺含量急剧上升，增长斜率较大。而在25～50μg/mL浓度区间，N-乙酰葡萄糖胺含量上升趋势变缓，增长斜率变小。因此，25μg/mL为化合物A7处理的浓度节点，此浓度N-乙酰葡萄糖胺含量为56.48μg/g。几丁质是病原菌细胞壁的主要组成成分，N-乙酰葡萄糖胺是几丁质水解的终产物，N-乙酰葡萄糖胺的变化能够反映病原菌细胞壁的变化。N-乙酰葡萄糖胺含量随处理浓度上升而增加，说明活性组分A7浓度升高，导致几丁质水解程度增大，细胞壁遭到了破坏，且破坏程度不断加重。链霉菌 2-6的活性化合物通过分解病原菌的细胞壁，进而降低病原菌的生存能力，达到抑制病原菌生长的目的。

(2)活性化合物A7对Foc TR4病原菌总糖、蛋白质和脂肪含量的影响

①总糖(DNS法)含量的测定：配置2mL终浓度为0，40，80，120，160， 200μg/mL葡萄糖溶液，加入1.5mL 3,5-二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylic acid， DNS)试剂。混匀后置100℃恒温水浴保温5min，冷却至室温，加蒸馏水稀释至 20mL，混合均匀，于540nm波长处测定吸光度。葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。在250mL三角瓶中加入100mL PDB培养基，接入Foc TR4病原菌，同时加入不同浓度梯度的活性成分A7(浓度为3.125μg/mL、 6.25μg/mL、12.5μg/mL、25.0μg/mL和50.0μg/mL)，于180r/min，28℃振荡培养5d，5000r/min离心15min收集菌丝，并用无菌水冲洗菌丝，并干燥。称取制备好的菌丝1.0g置于预冷的研钵中，加入6mLTris-HCl浸提液，冰浴中研磨至匀浆，4℃，10000r/min离心10min。取1mL上清夜加入2mL HCl(6mol/L)，沸水浴30min，流动冷却，用NaOH(6mol/L)溶液中和至中性加入1.5mL DNS，沸水浴5min，取2mL上清液加1.5mL DNS，沸水浴5min。取出后冷却至室温，加蒸馏水稀释至20mL，混匀。于波长540nm处测定吸光度，通过标准曲线计算总糖含量(Rivers et al.,1984)。

从图8可以看出，经活性化合物A7处理，Foc TR4病原菌菌体中可溶性总糖含量随着活性成分A7浓度的增大而逐渐降低，对照相比，低浓度处理无显著差异，高浓度处理差异显著。浓度为3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、 25.0μg/mL和50.0μg/mL的化合物A7处理后，Foc TR4病原菌总糖含量分别为 1.59±0.04mg/g、1.53±0.0mg/g、1.47±0.07mg/g、1.28±0.02mg/g、1.12±0.04 mg/g，而对照的为1.62±0.04mg/g，3.125μg/mL浓度处理与对照无显著性差异；相比于对照，处理组可溶性总糖含量分别降低了2.06％，5.56％，9.47％，20.78％， 30.66％。糖类是微生物代谢的主要碳源和能源储备物质，当活性成分A7浓度增大时，香蕉枯萎病菌生长代谢速率减慢，合成能源物质速率也同时减缓，能源消耗速率加快，使得总糖含量同比减少。结果显示，活性化合物A7处理后，Foc TR4 病原菌总糖含量在25μg/mL处出现急剧下降，此浓度为该化合物A7的EC₅₀值的区域范围。

②蛋白质含量的测定：在250mL三角瓶中加入100mL PDB培养基，接入 Foc TR4病原菌，同时加入不同浓度梯度的活性成分A7(浓度为3.125μg/mL、 6.25μg/mL、12.5μg/mL、25.0μg/mL和50.0μg/mL)，于180r/min，28℃振荡培养5d，5000r/min离心15min收集菌丝，并用无菌水冲洗菌丝，并干燥。称取制备好的菌丝1.0g置于预冷的研体中，加入6mLTris-HCl浸提液，冰浴中研磨至匀浆，4℃，10000r/min离心10min。取0.1mL上清夜，加入0.9mL蒸馏水，再加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，静置5min，于波长595nm测定吸光度，对照标准曲线，计算蛋白质含量(Bradford,1976)。

由图9可知，经活性化合物A7处理，Foc TR4病原菌菌体中可溶性蛋白质含量均随活性成分A7浓度的增大而逐渐减小。浓度为3.125μg/mL、6.25μg/mL、 12.5μg/mL、25.0μg/mL和50.0μg/mL的化合物A7处理后，Foc TR4病原菌可溶性蛋白含量分别为2.70±0.06mg/g、2.37±0.11mg/g、2.20±0.12mg/g、2.06 ±0.12mg/g、1.74±0.06mg/g，而对照组为2.81±0.10mg/g，所有浓度处理与对照均差异显著；相比于对照，处理组可溶性总蛋白含量分别降低了3.78％， 15.54％，21.86％，26.67％，37.91％。

③脂肪含量的测定：脂肪含量的测定参文献(陈毓荃，2002)的方法进行：在250mL三角瓶中加入100mL PDB培养基，接入Foc TR4病原菌，同时加入不同浓度梯度的活性成分A7(浓度为3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、 25.0μg/mL和50.0μg/mL)，于180r/min，28℃振荡培养5d，5000r/min离心15 min收集菌丝，并用无菌水冲洗菌丝。精确称取菌丝0.5g于滤纸筒中，封好纸筒两端，置于索氏脂肪抽提器中。连接已恒重的抽脂瓶，从冷凝器上端加入无水乙醚(沸程30～60℃)。在50～60℃水浴上加热提取12～16h。提取完毕后，在水浴锅上蒸去残留乙醚，再于100～105℃烘箱中干燥8h至恒重。计算公式如下：

活性化合物A7对Foc TR4病原菌菌体中脂肪含量的影响结果如图10所示。浓度为3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25.0μg/mL和50.0μg/mL的化合物A7处理后，Foc TR4病原菌脂肪含量分别为5.37％，5.24％，5.14％，4.79％和3.25％，而对照组为5.43％，在化合物A7低浓度(3.125μg/mL和6.25μg/mL) 处理下，脂肪含量与对照差异不显著；而在25μg/mL和50μg/mL较高浓度处理，病原菌体内脂肪含量显著降低，分别降低了11.72％和40.09％。因此，25μg/mL 浓度的活性化合物A7对靶标病原菌生物合成可以造成显著的影响。

(3)活性成分对线粒体呼吸链(ETC)复合体酶I～IV活性的影响

①线粒体提取和预处理

离心收集经不同浓度活性成分处理后的菌丝。采用蔗糖差速离心法提取菌丝线粒体(Mizutani et al.，1995)，取5g用预冷的HEPES-Trisbuffer(20mM，pH 7.2)冲洗三次后，将菌丝重悬于3倍体积预冷的线粒体提取缓冲液(250mM蔗糖，10mM KCl，5mM EDTA，20mMHEPES-Tris，pH 7.2，1.5mg/mL BSA) 中，将菌丝放入50mL离心管中，加入玻璃珠涡旋振荡器下匀浆破碎(Fishbein et al.,1993)。匀浆4℃下4000r/min离心15min，收集上清液，弃去沉淀。取上清液，继续离心，12000r/min，4℃下离心，弃去上清液，以不含BSA的线粒体提取缓冲液冲洗沉淀后，4℃下10000r/min离心20min。沉淀即为线粒体颗粒粗提物(Barrientos,2002)。

重悬线粒体颗粒于400μL预冷的线粒体保存缓冲液(2mM HEPES，0.1mM EGTA，250mM蔗糖，pH 7.4)中，留60～70μL和复合体酶III活性测定。取10 μL线粒体溶液，以BSA为标准蛋白，利用Bradford法(Bradford M，1976)测定蛋白浓度后，用线粒体保存缓冲液调节蛋白浓度至1mg/mL，置于冰上备用，或分装后以液氮速冻，-20℃保存。测定酶活性前，将线粒体溶液置于液氮/室温反复冻融3次。

剩余330～340μL溶液4℃下10000r/min离心20min，将沉淀重悬于1mL 低渗缓冲液，再于4℃下10000r/min离心20min后，将沉淀重悬于300μL低渗缓冲液中。用于复合体酶I、复合体酶II、复合体酶IV。取10μL线粒体溶液，以BSA为标准蛋白，利用Bradford法测定蛋白浓度后，用低渗缓冲液调节蛋白浓度至1mg/mL，置于冰上备用，或分装后以液氮速冻，-20℃保存。线粒体复合体酶检测之前，溶液置于液氮/室温反复冻融3次再进行后续检测。复合体酶 I～IV测定在37℃进行，反应体系总体积1mL，线粒体蛋白加入量为20～40μg。线粒体复合体酶Ⅰ～Ⅳ活性检测方法参照已知文献方法(Spinazzi,et al.,2012) 进行。

②对线粒体呼吸链复合体酶I活性的影响

复合体酶I(鱼藤酮敏感的NADH-癸基泛醌氧化还原酶)：以癸基泛醌为电子受体，NADH为电子供体，通过测定NADH被氧化而引起的340nm吸收值降低来进行。取700μL纯水加入1mL比色杯中，加入8μL经预处理的线粒体溶液(1mg/mL)，37℃孵育2min。分别加入100μL磷酸钾缓冲液(0.5M，pH 7.5)、 60μL无脂肪酸BSA(50mg/mL)、30μL KCN(10mM)和10μLNADH(10mM)。平行试验的另一比色杯多加入10μL鱼藤酮(1mM)，测定鱼藤酮不敏感的复合酶活性，扣除后定量鱼藤酮敏感的复合体酶I活性。用纯水调节反应混合物体积至994μL。将以Parafilm膜封口的比色杯翻转混匀反应混合物后在340nm监测基线2min。加入6μL癸基泛醌(10mM)启动反应，测定2min内340nm吸光度值的降低(NADH摩尔消光系数ε＝6.2mM^-1·cm^-1)。计算公式：

L：光程(cm)；v＝样品体积(mL)；[prot]＝样品蛋白浓度(mg/mL)

③对线粒体呼吸链复合体酶II活性的影响

复合体酶II(琥珀酸癸基泛醌DCPIP还原酶、琥珀酸-泛醌氧化还原酶)：以 DCPIP为电子受体，琥珀酸为电子供体，通过测定DCPIP被还原引起的其600nm 吸收值降低来进行。取600μL纯水加入1mL比色杯中，分别加入50μL磷酸钾缓冲液(0.5M，pH 7.5)、20μL无脂肪酸BSA(50mg/mL)、30μL KCN(10mM)、 50μL琥珀酸(400mM)、8μL线粒体蛋白(1mg/mL)和145μL DCPIP(0.15 mg/mL)，并用纯水调节反应混合物体积至995μL。将以Parafilm膜封口的比色杯翻转混匀反应混合物后在37℃孵育10min，最后2min在600nm监测基线。加入5μL癸基泛醌(10mM)启动反应，测定3min内600nm吸光度值的降低 (DCPIP消光系数ε＝19.1mM-1·cm-1)。计算公式：

④对线粒体呼吸链复合体酶III活性的影响

复合体酶III(泛醇Cyt c还原酶、癸基泛醇Cyt c氧化还原酶)：以氧化型 Cyt c为电子受体，癸基泛醇为电子供体，通过测定氧化型Cyt c被还原引起的 550nm吸收值升高来进行。取730μL纯水加入1mL比色杯中，分别加入50μL 磷酸钾缓冲液(0.5M，pH 7.5)、75μL氧化型Cyt c(1mM)、50μL KCN(10mM)、 20μLEDTA(5mM，pH 7.5)、10μL吐温20(2.5％)和8μL线粒体蛋白(1mg/mL)。平行试验比色杯除上述试剂外，加入10μL抗霉素A(1mg/mL)，测定抗霉素A 不敏感的复合酶III活性，扣除后定量抗霉素A敏感的复合酶III活性。用纯水调节反应混合物体积至990μL。将以Parafilm膜封口的比色杯翻转混匀反应混合物后在550nm监测基线2min。加入10μL癸基泛醇(10mM)启动反应，迅速混匀反应混合物后立即测定2min内550nm吸光度值的升高(还原型Cyt c消光系数ε＝18.5mM-1·cm-1)。计算公式：

⑤对线粒体呼吸链复合体酶I～IV活性的影响

复合体酶IV(Cyt c氧化酶)：以还原型Cyt c为电子供体，通过测定还原型 Cyt c被氧化而引起的550nm吸收值降低来进行。取400μL纯水加入1mL比色杯中，分别加入250μL磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)和50μL还原型Cyt c (1mM)。将以Parafilm膜封口的比色杯翻转混匀反应混合物后在550nm监测基线2min。用纯水调节反应混合物体积至992μL。加入8μL线粒体蛋白(1 mg/mL)启动反应，测定3min内550nm吸光度值的降低(还原型Cyt c消光系数ε＝18.5mM-1·cm-1)。计算公式：

为了研究活性化合物对线粒体电子传递链复合体酶活性的影响，分别用 3.125，6.25，12.5，25和50μg/mL浓度的化合物A7处理Foc TR4，并检测ETC 复合体酶I～IV的活性(图11)。与对照组相比，ETC复合体酶I～IV的活性均在低浓度处理下增加；然而，随着处理浓度的增加，其活性或含量无一例外地逐渐降低。化合物A7处理下，复合体酶III～III的活性在6.25μg/mL浓度时增加到最大值，并开始下降，而复合体酶IV的活性在3.125μg/mL浓度时增加到最大值，并开始下降。与对照相比，复合体酶I～IV的活性在50μg/mL浓度时，分别降低了31.10％，47.87％，51.27％和59.34％。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。