多羟基二酮以及羟基呋喃酮类化合物的生物合成方法
阅读说明：本技术 多羟基二酮以及羟基呋喃酮类化合物的生物合成方法 (Biological synthesis method of polyhydroxy diketone and hydroxy furanone compound ) 是由 杨建刚 曾艳 孙媛霞 任晨曦 于 2020-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种进行羟醛缩合反应的方法,其包括使用果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶酶催化剂或者含有所述酶的全细胞催化剂催化底物α-羟基酮与丙酮醛进行羟醛缩合反应的步骤；其中所述底物α-羟基酮可以为羟基乙醛、二羟丙酮、羟基丙酮或1-羟基-2-丁酮。本发明还提供一种羟基呋喃酮类化合物的制备方法,使所述羟醛缩合反应的产物在碱性磷酸氢二钠环境中环化生成羟基呋喃酮类化合物。本发明的方法反应温和、环境友好,避免使用有机和金属催化剂；基于酶催化的羟醛缩合反应合成多羟基呋喃酮前体,转化率高；反应步骤少,避免多步分离纯化工艺。本发明还提供果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶用于催化羟醛缩合反应的用途。(The invention provides a method for carrying out aldol condensation reaction, which comprises the step of catalyzing substrate alpha-hydroxy ketone and methylglyoxal to carry out aldol condensation reaction by using a fructose-6-phosphate aldolase or transaldolase catalyst or a whole-cell catalyst containing the enzyme; wherein the substrate alpha-hydroxy ketone can be hydroxy acetaldehyde, dihydroxyacetone, hydroxy acetone or 1-hydroxy-2-butanone. The invention also provides a preparation method of the hydroxyfuranone compound, which is characterized in that the product of the aldol condensation reaction is cyclized in an alkaline disodium hydrogen phosphate environment to generate the hydroxyfuranone compound. The method disclosed by the invention is mild in reaction and environment-friendly, and avoids the use of organic and metal catalysts; synthesizing polyhydroxy furanone precursor based on the aldol condensation reaction catalyzed by enzyme, and the conversion rate is high; the reaction steps are few, and a multi-step separation and purification process is avoided. The invention also provides the use of a fructose-6-phosphate aldolase or transaldolase for catalyzing an aldol condensation reaction.)
技术领域
本发明属于生物合成技术领域，具体涉及用果糖-6-磷酸醛缩酶催化合成羟基呋喃酮类化合物的方法。
背景技术
羟基呋喃酮类香料属于最有价值、用途最广泛、产量最大的高档香料，有香料之王的美誉。其中最有代表性的两个化合物分别是：(1)呋喃酮，2,5-二甲基-4-羟基-3-呋喃酮，自然界主要存在于菠萝的香味成份中，俗称菠萝酮；甜焦糖香，具有果味；和(2)酱油酮，2-甲基-5-乙基-4-羟基-3-呋喃酮，自然界主要存在于酱油中，具有高强度的甜焦糖香，能提高酱油的鲜味和焦糖型风味。上述两种羟基呋喃酮作为增香剂，广泛用于食品、烟草、饮料等领域。
羟基呋喃酮类香料在自然界中含量较低，天然产品价格昂贵，目前主要为化学合成法所生产。国内呋喃酮生产商大连金菊香料有限公司开发了以3,4-己二酮为原料，经溴水取代、水解和环化合成呋喃酮的方法，总收率为46％(CN200910188283.6)；国外呋喃酮生产商芬美意开发了以丙酮醛为原料，经缩合和环化制备呋喃酮的方法，该反应路线短，比较具有竞争力(US5009753)；此外，研究人员还开发了以乳酸、丙酮酸酯和3,4-二乙酰基-2,5-己二酮为原料制备呋喃酮的方法(CN201610964204.6，CN201910195433.X)。上述化学法制备呋喃酮，存在反应步骤长、收率低、环境污染严重、成本高等缺点。生物发酵技术合成香料化合物，产品香韵好，可节约资源，有助于可持续发展，是未来发展的趋势。研究人员筛选得到了鲁氏接合酵母、路德类酵母以及季也蒙毕赤氏酵母，可以采用发酵法制备呋喃酮和酱油酮，然而培养基中需要添加昂贵的果糖1,6-二磷酸和鼠李糖为原料，而且产量较低，不高于800mg/L，生产成本很高，不适合规模化生产。
因此，迫切需要开发生产效率高、环境优化、成本低廉的羟基呋喃酮类化合物的合成方法。
发明内容
果糖-6-磷酸醛缩酶(fructose-6phosphate aldolase,FSA)，通常是指可以可逆地催化二羟基丙酮(DHA)和甘油醛-3-磷酸(G3P)结合形成果糖-6-磷酸(Schurmann andSprenger,J.Biol.Chem.,2001,276(14),11055-11061)的酶；转醛醇酶(Transaldolase,)，通常是指可以可逆地催化景天庚酮糖-7-磷酸和甘油酸3-磷酸合成赤藓酮糖4-磷酸和果糖-6-磷酸的酶。本发明人发现果糖-6-磷酸醛缩酶和转醛醇酶还可以催化羟基酮和丙酮醛之间的羟醛缩合反应，产生羟基二酮类化合物，这些羟基二酮类化合物可以进一步用于生产呋喃酮类化合物。具体地，本发明人发现果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶可以催化羟基乙醛和丙酮醛之间的羟醛缩合反应，生成2,3-二羟基-4-酮基-戊醛；可催化二羟丙酮和丙酮醛之间的羟醛缩合反应，生成1,3,4-三羟基-2,5-己二酮；可催化羟基丙酮与丙酮醛之间的羟醛缩合反应，生成3,4-二羟基-2,5-己二酮；可催化1-羟基-2-丁酮和丙酮醛之间的羟醛缩合反应，生成3,4-二羟基-2,5-庚二酮。3,4-二羟基-2,5-己二酮在碱性磷酸氢二钠环境中可以环化生成呋喃酮，即2,5-二甲基-4-羟基-3-呋喃酮(俗称菠萝酮)；3,4-二羟基-2,5-庚二酮在碱性磷酸氢二钠环境中可以环化生成酱油酮，即2-甲基-5-乙基-4-羟基-3-呋喃酮。
本发明的目的之一是提供果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶酶催化剂或者含有果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶的细胞的全细胞催化剂用于催化羟醛缩合反应的用途。
在一些实施方案中，所述果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶可催化底物α-羟基酮与丙酮醛的羟醛缩合反应。
在一些优选的实施方案中，所述底物α-羟基酮可以为羟基乙醛、二羟丙酮、羟基丙酮或1-羟基-2-丁酮。
在一些优选的实施方案中，所述底物为羟基乙醛与丙酮醛，所得产物为2,3-二羟基-4-酮基-戊醛。
在一些优选的实施方案中，所述底物为二羟丙酮与丙酮醛，所得产物为1,3,4-三羟基-2,5-己二酮。
在一些优选的实施方案中，所述底物为羟基丙酮与丙酮醛，所得产物为3,4-二羟基-2,5-己二酮。
在一些优选的实施方案中，所述底物为1-羟基-2-丁酮与丙酮醛，所述产物为3,4-二羟基-2,5-庚二酮。
在本发明的上下文中，所述的果糖-6-磷酸醛缩酶可以是来源于任何物种的果糖-6-磷酸醛缩酶，包括但不限于来源于埃希氏菌属或志贺氏菌属的果糖-6-磷酸醛缩酶，例如来源于大肠杆菌的果糖-6-磷酸醛缩酶。在一些优选的实施方案中，本发明所述的果糖-6-磷酸醛缩酶的氨基酸序列为如下的(a)、(b)或者(c)：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加1-10个氨基酸，例如，取代、缺失或添加1-9个氨基酸、1-8个氨基酸、1-7个氨基酸、1-6个氨基酸、1-5个氨基酸、1-4个氨基酸、1-3个氨基酸或1-2个氨基酸，且具有催化羟基酮和丙酮醛之间的羟醛缩合反应功能的多肽；(c)与(a)中的氨基酸序列有90％以上，例如95％以上，优选96％以上、97％以上、98％以上或99％以上同一性，且具有催化-羟基酮和丙酮醛之间羟醛缩合反应功能的多肽。
在本发明的上下文中，所述的转醛醇酶包括但不限于来源于无害李斯特菌、依氏利斯特菌和梭状芽孢杆菌属的转醛醇酶。在一些优选的实施方案中，本发明所述的转醛醇酶的氨基酸序列为如下的(a)、(b)或者(c)：(a)由SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或者SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加1-10个氨基酸，例如，取代、缺失或添加1-9个氨基酸、1-8个氨基酸、1-7个氨基酸、1-6个氨基酸、1-5个氨基酸、1-4个氨基酸、1-3个氨基酸或1-2个氨基酸，且具有催化羟基酮和丙酮醛之间的羟醛缩合反应功能的多肽；(c)与(a)中的氨基酸序列有90％以上，例如95％以上，优选96％以上、97％以上、98％以上或99％以上同一性，且具有催化α-羟基酮和丙酮醛之间羟醛缩合反应功能的多肽。
在本发明的上下文中，术语“同一性”也可以被称为序列一致性，是指两个氨基酸序列之间的相似程度，通常计算为将两个多肽或蛋白的氨基酸序列进行比对后在相应位置上具有相同氨基酸残基的百分比。可以通过本领域已知的序列分析软件或程序来确定两个氨基酸序列之间的同一性，例如BLAST、FASTA等。
在本发明的上下文中，所述果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶酶催化剂，可以是纯化之后的果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶，也可以是含有果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶的粗酶酶液，还可以是含有果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶的酶制剂。果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶可以是从天然产生该酶的微生物，例如大肠杆菌中提取纯化获得，也可以是从表达外源果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶基因的重组宿主细胞中提取纯化获得的。所述粗酶酶液可以是果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶提取纯化过程中的中间产物，例如含有果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶和其它细胞杂质但仍具有催化羟基酮和丙酮醛之间的羟醛缩合反应功能的粗酶酶液。所述酶制剂可以含有适当的辅料或载体。
在本发明的上下文中，所述含有果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶的细胞，即表达果糖6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶的宿主细胞，该宿主细胞具有催化α-羟基酮与丙酮醛进行羟醛缩合反应的功能，其中宿主细胞包括但不限于微生物细胞，包括细菌、真菌等微生物，例如大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌，枯草芽孢杆菌，乳酸菌，酿酒酵母等；还包括高等真核细胞如哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞为大肠杆菌，例如大肠杆菌BL21(DE3)。
所述含有果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶的细胞可以通过将编码果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶的基因引入宿主细胞，并筛选出表达果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶的宿主细胞来获得。编码果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶的基因可以存在于宿主细胞中的表达载体上，例如可以将编码果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶的基因克隆至表达载体(如质粒)上，将表达载体通过钙诱导的感受态转化或电转化转入宿主细胞。编码果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶的基因还可以被整合至宿主细胞的基因组上，例如通过同源重组整合至宿主细胞的基因组上。将表达外源蛋白的基因转入宿主细胞使该外源蛋白在宿主细胞中表达的其它方法也是本领域技术人员熟知的。
本发明的目的之二是提供一种进行羟醛缩合反应的方法，其包括使用果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶酶催化剂催化底物α-羟基酮与丙酮醛进行羟醛缩合反应的步骤。
根据本发明，所述底物α-羟基酮可以为羟基乙醛、二羟丙酮、羟基丙酮或1-羟基-2-丁酮。
在一些优选的实施方案中，所述底物为羟基乙醛与丙酮醛，所得产物为2,3-二羟基-4-酮基-戊醛。
在一些优选的实施方案中，所述底物为二羟丙酮与丙酮醛，所得产物为1,3,4-三羟基-2,5-己二酮。
在一些优选的实施方案中，所述底物为羟基丙酮与丙酮醛，所得产物为3,4-二羟基-2,5-己二酮。
在优选的实施方式中，酶催化反应体系中包含有羟基丙酮，含量为10-100mM，更优选的羟基丙酮含量为50mM；丙酮醛含量为10-100mM，更优选的丙酮醛含量为50mM；果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶酶浓度为0.1-100U/mL，优选为1-50U/mL，更优选为1-20U/mL，例如为2-10U/mL；缓冲液pH为6-8，优选pH为7.5；催化反应温度为20℃-37℃，更优选的温度为30℃；反应时间为2-24小时，更优选反应时间为24小时。
在一些优选的实施方案中，所述底物为1-羟基-2-丁酮与丙酮醛，所得产物为3,4-二羟基-2,5-庚二酮。
在优选的实施方式中，酶催化反应体系中包含有1-羟基-2-丁酮，含量为10-100mM，更优选的1-羟基-2-丁酮含量为50mM；丙酮醛含量为10-100mM，更优选的丙酮醛含量为50mM；果糖-6-磷酸醛缩酶或转醛醇酶的酶浓度为0.1-100U/mL，优选为1-50U/mL，更优选为1-20U/mL，例如为2-10U/mL；缓冲液pH为6-8，优选pH为7.5；催化反应温度为20℃-37℃，更优选的温度为30℃；反应时间为2-24小时，更优选反应时间为24小时。
本发明的目的之三是提供一种进行羟醛缩合反应的方法，其包括使用全细胞催化剂催化底物α-羟基酮与丙酮醛进行羟醛缩合反应的步骤，其中所述全细胞催化剂是含有果糖-6磷酸醛缩酶或转醛醇酶的细胞。
根据本发明，所述底物α-羟基酮可以为羟基乙醛、二羟丙酮、羟基丙酮或1-羟基-2-丁酮。
在一些优选的实施方案中，所述底物为羟基乙醛与丙酮醛，所得产物为2,3-二羟基-4-酮基-戊醛。
在一些优选的实施方案中，所述底物为二羟丙酮与丙酮醛，所得产物为1,3,4-三羟基-2,5-己二酮。
在一些优选的实施方案中，所述底物为羟基丙酮与丙酮醛，所得产物为3,4-二羟基-2,5-己二酮。
在一些优选的实施方式中，全细胞催化反应体系中包含有羟基丙酮，含量为50-1000mM，更优选的羟基丙酮含量为500mM；丙酮醛含量为50-1000mM，更优选的丙酮醛含量为500mM；菌体浓度(OD600)为10-200，更优选的菌体浓度(OD600)为60；缓冲液pH为6-8，优选pH为7.5；催化反应温度为20℃-37℃，更优选的温度为30℃；反应时间为2-24小时，更优选反应时间为4小时。
在一些优选的实施方案中，所述底物为1-羟基-2-丁酮与丙酮醛，所得产物为3,4-二羟基-2,5-庚二酮。
在优选的实施方式中，全细胞催化反应体系中包含有1-羟基-2-丁酮，含量为50-1000mM，更优选的1-羟基-2-丁酮含量为500mM；丙酮醛含量为50-1000mM，更优选的丙酮醛含量为300mM；菌体浓度(OD600)为10-200，更优选的菌体浓度(OD600)为60；缓冲液pH为6-8，优选pH为7.5；催化反应温度为20℃-37℃，更优选的温度为30℃；反应时间为2-24小时，更优选反应时间为24小时。
本发明目的之四是提供一种羟基呋喃酮类化合物的制备方法，其包括以下步骤：
步骤(1)羟醛缩合反应：进行上述目的之二或目的之三所述的羟醛缩合反应；以及
步骤(2)环化反应：步骤(1)得到的含有羟醛缩合反应产物的反应液，在碱性磷酸氢二钠环境中环化生成羟基呋喃酮类化合物。
在一些优选的实施方案中，所述步骤(1)的底物为羟基丙酮与丙酮醛，所得羟醛缩合反应的产物为3,4-二羟基己二酮，步骤(2)所得的羟基呋喃酮类化合物为2,5-二甲基-4-羟基-3-呋喃酮(即呋喃酮)。
在优选的实施方式中，步骤(2)中，在含有3,4-二羟基己二酮的反应液中，加入Na2HPO4，终浓度为20-300g/L，反应温度为30-90℃，反应2-24小时，更优选的Na2HPO4浓度为300g/L，反应温度为70℃，反应时间为24小时。
在一些优选的实施方案中，所述步骤(1)的底物为1-羟基-2-丁酮与丙酮醛，所得羟醛缩合反应的产物为3,4-二羟基-2,5-庚二酮，步骤(2)所得的羟基呋喃酮类化合物为2-甲基-5-乙基-4-羟基-3-呋喃酮(即酱油酮)。
在优选的实施方式中，步骤(2)中，在含有3,4-二羟基-2,5-庚二酮的反应液中，加入Na2HPO4，终浓度为20-300g/L，反应温度为30-90℃，反应2-24小时，更优选的Na2HPO4浓度为300g/L，反应温度为70℃，反应时间为24小时。
有益效果
本发明与现有羟基呋喃酮类化合物生产方法相比，具有以下优点：
(1)反应温和，环境友好，避免使用有机和金属催化剂；
(2)转化率高，基于酶催化的羟醛缩合反应合成多羟基呋喃酮前体，转化率均高于80％；
(3)反应步骤少，避免多步分离纯化工艺。
附图说明
图1示出了实施例5的全细胞催化羟丙酮和丙酮醛合成3,4-二羟基-2,5-己二酮的高效液相色谱分析结果。
图2示出了实施例6的制备呋喃酮的高效液相色谱分析结果。
图3示出了实施例8的全细胞催化1-羟基-2-丁酮和丙酮醛合成3,4-二羟基-2,5-庚二酮的高效液相色谱分析结果。
具体实施方式
以下结合实施例进一步详述本发明。
本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明中所用引物和基因由江苏金唯智生物技术有限公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1果糖-6-磷酸醛缩酶的表达和纯化
1.含有果糖-6-磷酸醛缩酶重组菌株的构建
根据Genbank中来源于大肠埃希氏菌MG1655的果糖-6-磷酸醛缩酶基因(SEQ IDNO:5)设计引物，以大肠埃希氏菌MG1655基因组为模板，扩增来源于果糖-6-磷酸醛缩酶基因(FSA)片段，采用酶切连接方法，将FSA片段连接至表达载体pET21中，得到含有果糖-6-磷酸醛缩酶基因FSA的载体质粒，命名为pET21-FSA。
2.将上述重组质粒pET21-FSA采用化学转化进入大肠埃希氏菌BL21(DE3)中，得到大肠埃希氏菌重组菌株21FSA。
3.分别培养及诱导大肠埃希氏菌重组菌株21FSA，选用LB培养基对大肠埃希氏菌重组菌株进行培养，添加IPTG，诱导约20h。
4.收集和浓缩大肠埃希氏菌重组菌株21FSA，将诱导得到的重组菌株菌液，离心收集菌体，采用超声破碎方法，镍柱亲和纯化方法纯化目的蛋白。
实施例2转醛醇酶的表达和纯化
1.基于数据库搜索获得来源于无害李斯特菌转醛醇酶的基因序列(SEQ IDNO.6)、来源于依氏利斯特菌转醛醇酶的基因序列(SEQ ID NO.7)以及来源于梭状芽孢杆菌属转醛醇酶的基因序列(SEQ ID NO.8)，委托江苏金唯智生物技术有限公司完成基因合成。
2.设计引物以上述基因为模板，扩增获得PCR片段，采用酶切连接，将其构建至表达在pET21中，获得重组表达载体，并将重组质粒转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达，表达纯化方法如实施例1。
实施例3果糖-6-磷酸醛缩酶和转醛醇酶的功能表征
果糖-6-磷酸醛缩酶和转醛醇酶酶活性测定方法，建立200μL反应体系，加入羟丙酮20mM，丙酮醛10mM，乙醇胺缓冲液浓度为50mM，37℃，pH 7.5，反应30min，采用高效液相色谱检测羟丙酮消耗量，定义酶活性为每毫克蛋白每分钟消耗羟的丙酮量μmol。经测定发现果糖-6-磷酸醛缩酶酶活性为1.2U/mg,来源于无害李斯特菌的转醛醇酶活性为2.1U/mg,来源于依氏利斯特菌的转醛醇酶活性为1.8U/mg，来源于梭状芽孢杆菌属的转醛醇酶活性为0.8U/mg。
建立1mL反应体系，其中由实施例1获得的果糖-6-磷酸醛缩酶或实施例2获得的三种转醛醇酶的添加量为0.5U/mL，α-羟基酮(羟基乙醛或二羟丙酮或羟丙酮或1-羟基-2-丁酮)浓度为20mM；丙酮醛浓度为10mM；乙醇胺缓冲液浓度为50mM，37℃，pH 7.5，反应24小时。反应结束后，样品煮沸5min，14000rmp离心20min，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Sugar-Pak，流动相：超纯水，流速：0.4mL/min，柱温：80℃，检测器：示差折光检测器，上样量为10μL。
结果显示，果糖-6-磷酸醛缩酶和转醛醇酶均可以催化α-羟基酮与丙酮醛的羟醛缩合反应，即，催化羟基乙醛和丙酮醛之间的羟醛缩合反应，生成产物2,3-二羟基-4-酮基-戊醛，催化二羟丙酮和丙酮醛之间的羟醛缩合反应，生成产物1,3,4-三羟基-2,5-己二酮；催化羟基丙酮与丙酮醛之间的羟醛缩合反应，生成产物3,4-二羟基-2,5-己二酮；催化1-羟基-2-丁酮和丙酮醛之间的羟醛缩合反应，生成产物3,4-二羟基-2,5-庚二酮。
实施例4酶催化制备3,4-二羟基-2,5-己二酮
建立反应体系，其中底物羟丙酮为50mM，丙酮醛50mM，实施例1中获得的果糖-6-磷酸醛缩酶或实施例2中获得的来源于无害李斯特菌或依氏利斯特菌或梭状芽孢杆菌属的转醛醇酶为2U/mL，乙醇胺缓冲液浓度为50mM，pH7.5，控制反应条件为30℃，反应24小时后，样品进行高效液相色谱(HPLC)分析(HPLC条件同实施例1)。经过24小时反应，果糖-6-磷酸醛缩酶催化羟丙酮和丙酮醛获得3,4-二羟基-2,5-己二酮45mM，转化率为90％；来源于无害李斯特菌的转醛醇酶催化羟丙酮和丙酮醛获得3,4-二羟基-2,5-己二酮43mM，转化率为86％，来源于依氏利斯特菌的转醛醇酶催化羟丙酮和丙酮醛获得3,4-二羟基-2,5-己二酮41mM，转化率为82％，来源于梭状芽孢杆菌属的转醛醇酶催化羟丙酮和丙酮醛获得3,4-二羟基-2,5-己二酮40mM，转化率为80％。
实施例5全细胞催化制备3,4-二羟基-2,5-己二酮
(1)全细胞催化剂的制备
首先，如实施例1或2所述，培养及诱导含有果糖-6-磷酸醛缩酶或来源于无害李斯特菌或依氏利斯特菌或梭状芽孢杆菌属的转醛醇酶基因的大肠埃希氏菌重组菌株，其次，收集和浓缩大肠埃希氏菌重组菌株，将诱导得到的重组菌株菌液，收集菌体，用三乙醇胺缓冲液浓缩菌液，作为全细胞催化剂。
(2)全细胞催化羟丙酮和丙酮醛合成3,4-二羟基-2,5-己二酮
建立反应体系，其中底物羟丙酮浓度为600mM，丙酮醛浓度500mM，全细胞催化剂浓度(OD600)为60，乙醇胺缓冲液浓度为100mM，pH 7.5，控制反应条件为30℃，反应4小时后，样品进行HPLC分析(HPLC条件同实施例1)。结果，采用含有果糖-6-磷酸醛缩酶的全细胞催化剂获得的3,4-二羟基-2,5-己二酮的产量为440mM，转化率为88％(图1)；采用含有来源于无害李斯特菌的转醛醇酶的全细胞催化剂获得的3,4-二羟基-2,5-己二酮的产量为460mM，转化率为92％，采用含有来源于依氏利斯特菌的转醛醇酶的全细胞催化剂获得的3,4-二羟基-2,5-己二酮的产量为450mM，转化率为90％，采用含有来源于梭状芽孢杆菌属的转醛醇酶的全细胞催化剂获得的3,4-二羟基-2,5-己二酮的产量为420mM，转化率为81％。
实施例6呋喃酮(2,5-二甲基-4-羟基-3-呋喃酮)的制备
向实施例5采用含有果糖-6-磷酸醛缩酶的全细胞催化剂催化得到的含有3,4-二羟基-2,5-己二酮的反应液中，加入Na2HPO4，终浓度为300g/L，反应温度70℃，反应24小时，反应结束后，样品进行高效液相色谱分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Sugar-Pak，流动相：超纯水，流速：0.4mL/min，柱温：80℃，检测器：示差折光检测器，上样量为10μL。结果显示，转化率为50％(图2)。
实施例7酶催化制备3,4-二羟基-2,5-庚二酮
建立反应体系，其中底物1-羟基-2-丁酮为50mM，丙酮醛50mM，实施例1中获得的果糖-6-磷酸醛缩酶或实施例2获得的来源于无害李斯特菌或依氏利斯特菌或梭状芽孢杆菌属的转醛醇酶为2U/mL，乙醇胺缓冲液浓度为50mM，pH 7.5，控制反应条件为30℃，反应24小时后，样品进行高效液相色谱分析。经过24小时反应，获得3,4-二羟基-2,5-庚二酮均超过40mM，转化率大于80％，其中采用果糖-6-磷酸醛缩酶的转化率为84％，来源于无害李斯特菌转醛醇酶的转化率为81％，来源于依氏利斯特菌的转醛醇酶的转化率为80％，以及来源于梭状芽孢杆菌属的转醛醇酶的转化率为80％。
实施例8全细胞催化制备3,4-二羟基-2,5-庚二酮
(1)全细胞催化剂的制备方法如实施例5所示。
(2)全细胞催化1-羟基-2-丁酮和丙酮醛合成3,4-二羟基-2,5-庚二酮。
建立反应体系，其中底物1-羟基-2-丁酮浓度为300mM，丙酮醛浓度200mM，全细胞催化剂浓度(OD600)为80，乙醇胺缓冲液浓度为100mM，pH 7.5，控制反应条件为30℃，反应24小时后，样品进行HPLC分析(HPLC条件同实施例5)。结果，采用含有果糖-6-磷酸醛缩酶的全细胞催化剂获得的3,4-二羟基-2,5-庚二酮的产量为160mM，转化率为80％(图3)；采用含有来源于无害李斯特菌的转醛醇酶的全细胞催化剂获得的3,4-二羟基-2,5-庚二酮产量为140mM，转化率为70％，采用含有来源于依氏利斯特菌的转醛醇酶的全细胞催化剂获得的3,4-二羟基-2,5-庚二酮产量为142mM，转化率为71％，采用含有来源于梭状芽孢杆菌属的转醛醇酶的全细胞催化剂获得的3,4-二羟基-2,5-庚二酮产量为146mM，转化率为73％。
实施例9酱油酮(2-甲基-5-乙基-4-羟基-3-呋喃酮)的制备
向实施例8采用含有果糖-6-磷酸醛缩酶的全细胞催化剂催化得到的含有3,4-二羟基-2,5-庚二酮的反应液中，加入Na2HPO4，终浓度为300g/L，反应温度70℃，反应24小时，反应结束后，样品进行高效液相色谱分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Sugar-Pak，流动相：超纯水，流速：0.4mL/min，柱温：80℃，检测器：示差折光检测器，上样量为10μL。结果显示，转化率为50％。
以上对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。