一种重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞的制备与应用
阅读说明：本技术 一种重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞的制备与应用 (Preparation and application of recombinant beta-1, 4-endoglucanase immobilized cell ) 是由 侯进慧 戴鹏飞 于 2021-10-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞的制备与应用,属于酶工程技术领域。该重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞是通过重组β-1,4-内切葡聚糖酶菌株固定于海藻酸钠和钙盐形成的凝胶中制备得到的,该固定化细胞具有较好的稳定性,制备工艺合理,内切酶活性高、温度耐受性和pH稳定性好,实现了β-1,4-内切葡聚糖酶的重复、高效利用。(The invention discloses preparation and application of a recombinant beta-1, 4-endoglucanase immobilized cell, belonging to the technical field of enzyme engineering. The recombinant beta-1, 4-endoglucanase immobilized cell is prepared by immobilizing a recombinant beta-1, 4-endoglucanase strain in a gel formed by sodium alginate and calcium salt, has good stability, reasonable preparation process, high endoglucanase activity, good temperature tolerance and good pH stability, and realizes the repeated and efficient utilization of the beta-1, 4-endoglucanase.)
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，特别是涉及一种重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞的制备与应用。
背景技术
在自然生态系统中，纤维素是含量最丰富的有机化合物，也是植物组织细胞中的主要成分，一般占植物干重的30％-50％。大量的秸秆、稻梗等含纤维素丰富的物质的利用率也很低，大多采用燃烧的方法来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。充分利用纤维素资源，将其有效转化成可利用的资源，对于解决当前的能源危机、粮食短缺、环境污染等世界性难题都有着重大的意义。如果将纤维素以工业规模转化成葡萄糖的技术开发成功，那么纤维素资源便可成为人类食物、动物饲料、发酵工业原料以及能源的新来源。但目前有效利用纤维素生物质资源的主要障碍是纤维素酶的酶解效率十分低下，与淀粉酶相比相差2个数量级以上，进而导致纤维素酶解过程中纤维素酶的成本过高，约占纤维素糖化工艺的40％以上，从而严重阻碍了纤维素酶在纤维素糖化中的广泛应用。
纤维素酶是一类酶的总称，可以分为内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，即C1酶)、外切葡聚糖酶(1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91)和β-葡聚糖苷酶(β-1,4-glucosidase，BG，EC.3.2.1.21)。其中，内切葡聚糖酶是纤维素酶系中最重要的酶类，可以作用于纤维素分子内的无定形区，将长链纤维素分子水解成短链状，产生小分子纤维素，可以为外切酶提供大量的反应末端，同时还能水解小分子的纤维素寡糖。近年来，人们对纤维素酶的分子结构、功能性氨基酸和酶基因的克隆研究开展的比较多。相关研究显示，纤维素酶分子具有类似的结构，一般由球状的纤维素催化结构域(Catalyticdomains,CD)，纤维素结合结构域(Cellulose-BindingDomsins,CBD)和连接桥(Linker)三部分组成。
酶的固定化，是指利用一些载体材料将酶束缚或者限制于一定的区域内，酶仍然能进行其特有的催化反应，并且能被回收和重复使用的一类技术。而所谓的固定化酶，是指在一定的空间内，呈闭锁状态，并仍然能保留其催化活力，可以连续或重复利用的酶。固定化细胞技术与固定化酶类似，细胞被固定化以后，可以继续存活，保持全细胞催化特性，而且固定化细胞对环境具有较高的耐受性，催化活性重复使用效率也较高。另外，固定化细胞比固定化酶成本低，可以反复生长使用，容易与反应体系分离。
但目前为止，尚未有利用固定化细胞技术对重组β-1,4-内切葡聚糖酶菌株进行固定化的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞的制备与应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明所制备的重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞具有较好的稳定性，制备工艺合理，内切酶活性高、温度耐受性和pH稳定性好，实现了β-1,4-内切葡聚糖酶的重复、高效利用。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞，重组β-1,4-内切葡聚糖酶菌株固定于海藻酸钠和钙盐形成的凝胶中。
进一步地，所述重组β-1,4-内切葡聚糖酶菌株为EG/BL21菌株；所述钙盐为CaCl2。
本发明还提供一种所述的重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)将EG/BL21菌株进行活化、培养，收集菌液；
(2)取菌液离心，用磷酸缓冲液将离心的菌体转移到质量百分比浓度为2-6％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，取海藻酸钠菌体混合溶液，逐滴滴入质量百分比浓度为1-3％的CaCl2溶液中，形成凝胶珠，静置后滤出，用去离子水冲洗凝胶珠2-3次，得到所述重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞。
进一步地，所述活化具体为EG/BL21菌株接种到液体培养基，过夜培养；所述培养具体为活化后的EG/BL21菌株培养至OD600为1.0。
进一步地，所述海藻酸钠溶液的质量百分比浓度为3％。
进一步地，所述CaCl2溶液的质量百分比浓度为2％。
进一步地，步骤(2)中所述离心的菌体与海藻酸钠溶液的体积比为1∶40。
本发明还提供一种所述的重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞或所述的重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞的制备方法在纤维素糖化工艺中的应用。
进一步地，所述的重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞的培养pH为7.0。
进一步地，所述的重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞的培养温度为45℃。
本发明公开了以下技术效果：
本发明利用海藻酸钠为主要基质，把重组β-1,4-内切葡聚糖酶菌株进行固定化，所制备的重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞具有较好的稳定性，制备工艺合理，内切酶活性高、温度耐受性和pH稳定性好，实现了β-1,4-内切葡聚糖酶的重复、高效利用，并且为重组β-1,4-内切葡聚糖酶菌株在纤维素水解中的应用奠定重要基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为重组质粒pETEG的组成示意图；
图2为实施例1制备固定化细胞形成的凝胶珠；
图3为温度对固定化细胞酶活力的影响；
图4为pH对固定化细胞酶活力的影响；
图5为CaCl2浓度对固定化细胞酶活力的影响；
图6为海藻酸钠浓度对固定化细胞酶活力的影响。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1重组β-1,4-内切葡聚糖酶细胞的固定
1.1实验材料
本发明所用表达β-1,4-内切葡聚糖酶的重组菌EG/BL21是本课题组构建,菌株和质粒为徐州工程学院江苏省食品资源开发与质量安全重点实验室保存。羧甲基纤维素钠、3,5-二硝基水杨酸购自天津市福晨化学试剂厂。酵母提取物、蛋白胨等微生物培养用试剂和海藻酸钠、CaCl2等固定化试剂购自国药集团化学试剂有限公司。分子生物学试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2实验仪器与设备
AL204型电子分析天平：METSILER TOEDO；723C型可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；HYG型震荡培养柜：上海欣蕊自动化设备有限公司；Sigma3-16pk型高速冷冻离心机：德国SIGMA公司；MDF-382E型超低温冰箱：日本SANYO电子有限公司；水浴锅HH—4：国华电器有限公司；超净工作台：上海博迅实业有限公司。
1.3重组菌细胞构建
首先构建重组质粒pETEG，其中EG是构建在pET载体上的β-1,4-内切葡聚糖酶基因(见图1)，其重组质粒pETEG可表达出β-1,4-内切葡聚糖酶，再将该重组质粒转化至BL21菌株中，携带该阳性质粒的工程菌为重组菌EG/BL21。
1.4固定化细胞的制备方法
(1)将保存于冻存管中的EG/BL21菌株，接种到50mL LB液体培养基(含30μg/mL卡那霉素)中，37℃震荡培养过夜，进行活化；
(2)按1％接种量转接到50mL LB(含30μg/mL卡那霉素)液体培养基中于37℃震荡培养，待OD600为1.0时，收集菌液，进行细胞固定化；
(3)取100mL培养好的菌液离心，用pH7.0的磷酸缓冲液将离心的菌体转移到10mL浓度为3％的海藻酸钠溶液中，工程菌与海藻酸钠的体积比1：40，混合均匀，用20mL注射器吸取海藻酸钠菌体混合溶液，逐滴滴入质量百分比浓度为2％的CaCl2溶液中，形成凝胶珠，静置0.5h后滤出小球，用去离子水冲洗凝胶珠2-3次，然后放入4℃冰箱中备用。
1.5葡萄糖标准曲线的制作
配制1.0mg/mL葡萄糖标准溶液：称取无水葡萄糖0.1g，用蒸馏水定容至100mL。
葡萄糖标准曲线是以葡萄糖为标准物，以DNS为显色剂，测定540nm处的吸光度并绘制曲线图。取6支带刻度的试管，洗净烘干备用，编号1到6。分别按照0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的标准在编号1-6的试管内加入相应体积的标准葡萄糖溶液，加入蒸馏水定容至1mL，充分混匀，配制成不同浓度的葡萄糖溶液。在各试管中分别加入2mL的DNS溶液，充分混匀，沸水浴5min，取出后放置室温冷却，最后加蒸馏水定容至25mL，混合均匀。在540nm的波长下，以1号试管为空白对照，分别测定各试管溶液的吸光度。最后根据所测结果，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，溶液OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。
1.6固定化细胞的酶活测定方法
将5g的固定化细胞凝胶珠(如图2所示)放于装有195mL LB(含30μg/mL卡那霉素)液体培养基的三角瓶中，于转速为120rpm、温度为37℃进行摇床培养,培养时间为5h，再向菌液内加入5μL的IPTG诱导3h，测定其在540nm波长下的吸光度。
酶活计算：将在50℃条件下，在单位时间内水解底物生成1μmol还原糖所需的粗酶液的量确定为一个酶活单位(U/mL)。计算酶活的公式见下式：
酶活力(U/mL)＝(OD×k×n×1000)/(180×t×V)式中：
k——葡萄糖标准曲线的斜率
n——酶的稀释倍数
1000——表示mg转换成μg
180——葡萄糖标准分子量
t——反应时间(min)
V——参加反应所需的粗酶液体积(mL)
1.7固定化细胞的单因素实验
1.7.1温度对固定化细胞酶活力的影响
固定化细胞的酶活力测定方法：取10只锥形瓶，编号为a0-a9。在每个250ml的锥形瓶中加入100ml LB液体培养基，再加入100ul的卡纳霉素和100ul的IPTG，在a1-a9号锥形瓶中加入上述1.4制得的凝胶珠，分别至于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃培养箱中培养20小时。另取10只试管，编号分别记0-9,10只试管分别加入2ml浓度为2％的羧甲基纤维素钠溶液，1-9号试管分别再加入2ml a1-a9号锥形瓶中培养的固定化细胞培养液，0号试管放2ml LB液体培养基，将10只试管放置于50℃的水浴中15分钟，取出后，分别在0-9号试管中加入2ml的DNS试剂，立即放入沸水浴中，沸水浴10分钟，取出后用去离子水定容至25ml，将各试管摇匀，以0号试管为参照，测吸光度。每组实验做3次平行实验。
以相对酶活为指标，评价不同温度对固定化细胞酶活力的影响。结果见图3。
1.7.2 pH对固定化细胞酶活性的影响
固定化细胞的酶活力测定方法：取5只锥形瓶，编号为b1-b5号。在每个250ml的锥形瓶中加入100ml LB液体培养基，用磷酸缓冲溶液将b1-b5号锥形瓶的液体培养基pH调节为5、6、7、8、9，再加入100ul的卡纳霉素和100ul的IPTG，最后加入上述1.4制得的凝胶珠，放置于37℃培养箱中培养20小时。另取6只试管，编号分别记0-5号,6只试管分别加入2ml浓度为2％的羧甲基纤维素钠溶液，1-5号试管分别再加入2ml b1-b5号锥形瓶中的固定化细胞培养液，0号试管放2ml LB液体培养基，将6只试管放置于50℃的水浴中15分钟，取出后，分别在0-5号试管中加入2ml的DNS试剂，立即放入沸水浴中，沸水浴10分钟，取出后用去离子水定容至25ml，将各试管摇匀，以0号试管为参照，测吸光度。每组实验做3次平行实验。
以相对酶活为指标，评价不同pH对固定化细胞酶活力的影响。结果见图4。
1.7.3 CaCl2浓度对固定化细胞酶活力的影响
固定化细胞的制备方法：取100mL培养好的菌液离心，用pH 7.0的磷酸缓冲液将离心的菌体转移到10mL浓度为3％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，用容量为20mL的注射器吸取海藻酸钠菌体混合溶液，分别逐滴滴入浓度为1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％的CaCl2溶液中，形成凝胶珠，静置0.5h后滤出小球，用去离子水冲洗凝胶珠2-3次，然后放入4℃冰箱中备用。
固定化细胞的酶活力测定方法：取5只锥形瓶，编号为c1-c5号。在每个250ml的锥形瓶中加入100mL LB液体培养基，再加入100uL的卡纳霉素和100uL的IPTG。在c1-c5号锥形瓶中分别加入上述不同浓度CaCl2制备的凝胶珠，放置于37℃培养箱中培养20小时。另取6只试管，编号分别记0-5号,6只试管分别加入2mL浓度为2％的羧甲基纤维素钠溶液，1-5号试管分别再加入2mL c1-c5号锥形瓶中制备的固定化细胞培养液，0号试管放2ml LB液体培养基，将6只试管放置于50℃的水浴中15分钟，取出后，分别在0—5号试管中加入2mL的DNS试剂，立即放入沸水浴中，沸水浴10min，取出后用去离子水定容至25mL，将各试管摇匀，以0号试管为参照，测吸光度。每组实验做3次平行实验。
以相对酶活为指标，评价不同浓度的CaCl2溶液对固定化细胞酶活力的影响。结果见图5。
1.7.4海藻酸钠溶液浓度对固定化细胞活力的影响
固定化酶的制备方法：固定化酶的制备方法：取100ml培养好的菌液离心，用pH7.0的磷酸缓冲液将离心的菌体转移到10mL浓度分别为2.0％、3.0％、40％、5.0％、6.0％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，用容量为20mL的注射器吸取海藻酸钠菌体混合溶液，逐滴滴入浓度为2.0％的CaCl2溶液中，形成凝胶珠，静置0.5h后滤出小球，用去离子水冲洗凝胶珠2-3次，然后放入4℃冰箱中备用。
固定化细胞的酶活力测定方法：取5只锥形瓶，编号为d1-d5号。在每个250mL的锥形瓶中加入100mL LB液体培养基，再加入100uL的卡纳霉素和100uL的IPTG。在d1-d5号锥形瓶中分别加入上述用不同海藻酸钠溶液制备好的凝胶珠，放置于37℃培养箱中培养20h。另取6只试管，编号分别记0-5号,6只试管分别加入2mL浓度为2.0％的羧甲基纤维素钠溶液，1-5号试管分别再加入2mL d1-d5号锥形瓶中制备的固定化细胞培养液，0号试管放2mL LB液体培养基，将6只试管放置于50℃的水浴中15分钟，取出后，分别在0-5号试管中加入2mL的DNS试剂，立即放入沸水浴中，沸水浴10min，取出后用去离子水定容至25mL，将各试管摇匀，以0号试管为参照，测吸光度。每组实验做3次平行实验。
以相对酶活为指标，评价不同浓度的海藻酸钠溶液对固定化细胞酶活力的影响。结果见图6。
1.7.5固定重组细胞的正交实验
在确定最佳的固定化方法后，由单因素实验的实验结果选择不同的因素和水平进行正交实验，以期得到最佳的固定效果。本实验选取的因素为温度、pH、海藻酸钠浓度、CaCl2浓度进行分析。结果见表1-2。
表1固定化重组β-1,4-内切葡聚糖酶菌株的正交实验因素表
表2固定化重组β-1,4-内切葡聚糖酶菌株的正交实验结果
由正交实验的实验结果可以看出，影响固定化细胞的酶活性的因素按其影响大小排列的顺序依次为：温度>CaCl2浓度>海藻酸钠浓度>pH。温度对固定化细胞酶活性的影响最大。由正交实验得出的固定化细胞酶活性的最佳条件为：温度为45℃，CaCl2的浓度为2％，海藻酸钠的浓度为3％，pH为7。以此为固定化条件，测得固定化细胞的酶活达到32.88U/ml。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
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