一种载酶干凝胶整体柱催化填料的制备方法
阅读说明：本技术 一种载酶干凝胶整体柱催化填料的制备方法 (Preparation method of enzyme-loaded xerogel monolithic column catalytic filler ) 是由 王洪海 岳文达 张淑玲 魏斯文 董凯 王中彪 于 2021-01-15 设计创作，主要内容包括：本发明为一种载酶干凝胶整体柱催化填料的制备方法。该方法通过溶胶-凝胶法包埋南极假丝酵母脂肪酶B,以有机硅为前驱体,经过水解、缩聚反应,利用圆柱型模具,常压干燥将其制备成圆柱型载酶干凝胶整体柱催化填料。本发明得到的载酶干凝胶整体柱催化填料中,干凝胶具有硅网络结构,酶包埋在其中,具有催化完整,表面无裂痕,机械强度高等优点。(The invention relates to a preparation method of an enzyme-loaded xerogel monolithic column catalytic filler. According to the method, candida antarctica lipase B is embedded by a sol-gel method, organic silicon is used as a precursor, and the cylindrical enzyme-loaded xerogel monolithic column catalytic filler is prepared by hydrolysis and polycondensation reactions and normal-pressure drying by using a cylindrical mold. In the monolithic column catalytic filler of the enzyme-loaded xerogel obtained by the invention, the xerogel has a silicon network structure, and the enzyme is embedded in the silicon network structure, so that the monolithic column catalytic filler has the advantages of complete catalysis, no crack on the surface, high mechanical strength and the like.)
技术领域
本发明涉及一种具有硅网络结构的负载脂肪酶CALB干凝胶整体柱催化填料生物催化剂及其制备和应用方法，具体地说，涉及一种用于乙酸乙酯和正丁醇酯交换反应合成乙酸正丁酯的载酶干凝胶整体柱催化填料生物催化剂及其制备方法。
背景技术
乙酸正丁酯简称乙酸丁酯，是一种最常用的溶剂，可作为优良的有机溶剂，广泛用于硝化纤维清漆中，在人造革、织物及塑料加工过程中用作溶剂，也用于香料工业分析试剂和萃取剂，色谱分析标准物质及溶剂，用于生产油漆和涂料，也可应用于香料工业。因而对其原料乙酸丁酯的需求大增，使得乙酸丁酯合成方法的研究成为人们研究的热点。
乙酸正丁酯的生产工艺有间歇法和连续法两种。工业上普遍采用浓硫酸作为合成过程的催化剂，反应方法有两种，分别是酯化法和酯交换法。间歇法是将反应物醋酸和丁醇加入塔釜，按比例加入催化剂浓硫酸，加热进行酯化反应。经中和反应除去多余的硫酸，脱水后再进行洗涤，经精制后分离出产品乙酸正丁酯。这种方法的优点是操作简单，缺点是所用的催化剂会对环境造成破坏，对设备严重腐蚀，且反应过程中有副产物生成，产量较低等，因此逐渐被市场所淘汰；目前，利用连续法制备乙酸正丁酯的研究较多，但是连续法中的催化剂仍然是强酸，且对设备要求较高，增加了设备的成本费用，因此乙酸正丁酯的生产一直没有得到飞跃，目前急需一种新的工艺方法来改变这种情况。
生物催化反应在有机合成中的应用越来越广泛，这是由于酶具有高的区域选择性、立体选择性或对映选择性，已经成为获得高附加值化学品的有效途径之一。但对于实际工业生产，酶存在成本高、热稳定性低、回收困难等缺陷。通过固定化酶的方式可以提高酶的稳定性，并且增加催化剂酶的重复性。
酶的固定化方法主要有吸附法、共价结合法、包埋法和交联法等。其中，包埋法由于操作工艺简单、操作条件温和且不易破坏酶分子高级结构以及活性中心构象而成为目前酶催化反应技术开发过程中采用的首选固定化方法。固定化酶与催化反应集成的过程有几个例子，例如，谭天伟等(Biotechnology Advances,2010,28(5),628-34.)利用大孔非极性树脂NKA吸附法固定化假丝酵母脂肪酶，在正庚烷介质中树脂NKA的固定化效率能够达到98.98％，催化大豆油和甲醇酯转反应合成生物柴油，转化率达到97.3％。Paiva等人(Biotechnology progress,2003,19(3):750-754.)展示了实验室规模蒸馏塔中脂肪酶催化酯交换反应的第一个完全集成设置，以保持热不稳定酶的低温，施加千帕的真空。将反应物丁酸乙酯和丁醇在塔底加热，用固定化脂肪酶在倒置的梨鳞茎中进行反应。低沸醇的脱除提高了丁酸丁酯的最终收率。然而，与间歇反应相比，集成过程的产率增加的程度没有显示出来。此外，在更大范围内，酶在倒梨鳞茎中的引入将导致底物在填充床中对催化剂的可及性较低。Heils等(Industrial&engineering chemistry research 2015,54(38),9458-9467.)报道了制备负载型酶催化填料的方法：浸渍溶胶-凝胶法和喷涂溶胶-凝胶法。浸渍溶胶-凝胶法是指将脂肪酶包埋在二氧化硅溶胶中，利用简单的浸渍溶胶-凝胶法，在室温下使填料表面的凝胶干燥形成催化涂层，将包埋在溶胶中的脂肪酶催化剂涂覆到填料表面制成负载型酶催化填料，然而，经过重复性试验测试，每次都会有一定量催化剂损失。Wierschem等(Chemical engineering journal,2017,312,106-117.)建立二元精馏模型，验证了酶反应蒸馏法合成丁酸丁酯的中试实验验证，将酶珠和涂层填料进行催化对比，结果表明酶珠的活性高于涂层填料活性，说明大尺寸的载体对酶包覆效果较好，保护了酶分子，增强了酶的热稳定性。CN107115889A公开了一种反应精馏用酶催化填料及其涂布方法和应用。所述的酶催化填料由以下方法制得，包括以下步骤：将填料浸没在含有生物酶的溶胶中20～30秒，取出后干燥10～20秒；然后再次浸没入溶胶中20～30秒，再次取出后干燥10～20秒；重复浸没，干燥步骤8～15次；最后将填料干燥至重量不变，即得到附着有生物酶涂层的酶催化填料；此方案得到的载酶填料的酶与填料的结合力不足，反应过程或室温下储藏时，载酶填料的质量损失较大。
如上所述，在催化反应中使用固定化酶非均相催化剂可提高酶的热稳定性和重复使用率。但是涂层固定化酶催化剂容易暴露酶的活性中心，使酶更容易失活，此外，涂层容易脱落，对反应体系造成污染，对反应过程带来了反应体系复杂、后处理难度大、浪费成本等缺点。因此，开发高稳定性的生物催化剂，具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的为针对当前技术中存在的不足，提供一种载酶干凝胶整体柱催化填料的制备方法。该方法通过溶胶-凝胶法包埋南极假丝酵母脂肪酶B，以有机硅为前驱体，经过水解、缩聚反应，利用圆柱型模具，常压干燥将其制备成圆柱型载酶干凝胶整体柱催化填料。本发明得到的载酶干凝胶整体柱催化填料中，干凝胶具有硅网络结构，酶包埋在其中，具有催化完整，表面无裂痕，机械强度高等优点。
本发明的技术解决方案如下：
一种载酶干凝胶整体柱催化填料的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将正硅酸甲酯、甲基三甲氧基硅烷加入到溶剂，得到A溶液，放入冰水浴中，静止备用；
其中，质量比为，正硅酸甲酯：甲基三甲氧基硅烷：溶剂＝1:3.5～4:5.6～6；
(2)将聚乙二醇、氟化钠、酶液、去离子水混合，得到B溶液；其中，质量比为，聚乙二醇：氟化钠：酶液：去离子水＝1:3.2～3.6:8.5～9.5:14.5～15；
(3)将A溶液和B溶液在冰水浴中混合搅拌，得到载酶湿凝胶；体积比为，A溶液和B溶液1.5～2.0:1；
(4)将步骤(3)得到的载酶湿凝胶注入模具中，盖上保鲜膜，室温静置12～48小时；
(5)将步骤(4)室温静置后的模具的一端上的保鲜膜开孔；开孔率为5％～10％。
(6)将步骤(5)含有载酶湿凝胶的模具放入25～40℃烘箱，干燥24～48小时。
(7)将步骤(6)干燥后的得到的载酶干凝胶整体柱从模具中取出，室温放置24～48小时，得到用于乙酸乙酯与正丁醇酯交换反应的载酶干凝胶整体柱催化填料生物催化剂。
步骤(1)所述的溶剂为甲醇、乙醇或丙醇，优选为甲醇。
步骤(2)所述的聚乙二醇的分子量为400～600；
步骤(2)所述的酶液为南极假丝酵母脂肪酶B液；浓度为3～10wt％；
所述的模具为塑料或者玻璃圆管，内径为1～1.5cm，厚度为1～4mm，长度为1.5～2cm。
所述方法制备的载酶干凝胶整体柱催化填料的应用，用于催化乙酸乙酯与正丁醇酯交换反应。
所述的催化乙酸乙酯与正丁醇酯交换反应，包括如下步骤:
将乙酸乙酯与正丁醇放入釜式反应器中，将反应溶液加热到65～75℃时，将载酶干凝胶整体柱催化填料放入负载型搅拌桨，在200～300转/分的搅拌速度下，反应2～6小时，得到乙酸正丁酯和乙醇；
其中，质量比为，乙酸乙酯：正丁醇＝2～5:1；质量比为，正丁醇：载酶干凝胶整体柱催化填料＝2～10:1；
还包括如下步骤：反应结束后，取出、分离出反应后载酶干凝胶整体柱催化填料，用磷酸盐缓冲液洗涤，然后在25～40℃干燥2～4小时，再生得到干凝胶整体柱催化填料。
本发明的实质性特点为：
当前技术中，溶胶-凝胶法通常制备薄膜，但是溶胶-凝胶特点是收缩严重，表面张力大，干燥后的干凝胶容易开裂。如发明人先前的研究中，CN 107115889A公开了一种反应精馏用酶催化填料及其涂布方法和应用。即采用溶胶-凝胶法在填料表面涂上载酶溶胶-凝胶，干燥后形成载酶催化涂层；CN 109837271A公开了一种在CN 107115889A基础上，将载酶溶胶-凝胶喷涂在填料表面，使涂层均匀稳定。由于这2种方法都是涂层式生物催化剂，但是涂层不稳定，与填料表面结合力弱，容易脱落，且酶容易暴露在表面，暴露活性中心，造成失活。本利用圆柱型模具，通过铸造法制备了载酶干凝胶整体柱催化填料，其本身就是一个催化填料，解决了涂层不稳定，酶失活的问题。
而本发明利用圆柱型模具，铸造期间，对其进行特殊的密封处理(先密封，后暴露一定空气，再完全接触空气)，可以控制溶剂和水分挥发；主要分为2个阶段：凝胶化、老化；先封闭是让溶胶反应凝胶化，后暴露一定空气是控制溶剂和水分缓慢挥发，有利于形成机械强度高的硅骨架结构，最后完全暴露空气是去除残余溶剂和水分，从而制备出高机械强度的载酶干凝胶整体柱催化填料。
本发明的有益效果是：
相对于原有的浓硫酸作为催化剂合成乙酸正丁酯的方法，本发明制得的载酶干凝胶整体柱催化填料生物催化剂活性高，选择性好；并且酶活稳定性高，回收容易，可重复使用。降低了成产成本，减少了对环境的危害。
1.相对于原有的浓硫酸作为催化剂合成乙酸正丁酯的方法，本发明制得的载酶干凝胶整体柱催化填料生物催化剂活性高，反应速率快(见实施例10，反应2.5小时，正丁醇转化率可到65.6％)。
2.本发明所用载酶干凝胶整体柱催化填料可以回收，活性稳定，可重复使用，降低了生产成本(见实施例4～9，室温储存3个月以上，还保持69.8％的活性)。
附图说明
图1为实施例1得到的载酶干凝胶整体柱催化填料的截面扫描电镜图片
图2为实施例1制备得到的载酶干凝胶整体柱催化填料
具体实施方式
实施例1
(1)称取0.58g正硅酸甲酯、2.08g甲基三甲氧基硅烷，并将二者混合溶解在3.39g甲醇中。
(2)将步骤(1)配置的溶液放入冰水浴中备用。
(3)称取0.14g聚乙二醇、0.49g NaF、1.26g酶液(南极假丝酵母脂肪酶B液；浓度：6wt％)、2.06g去离子水，混合搅拌均匀。
(4)将步骤(3)得到的含酶混合溶液缓慢倒入步骤(1)的混合溶液中，在冰水浴中搅拌3min，得到载酶湿凝胶。
(5)将内径为1cm，厚度为2mm塑料圆管，剪裁成1.7cm长度小段，共10个，将裁减后的小段一侧用胶水粘连在5×6cm塑料板上，将其放入60℃摄氏度烘箱干燥12小时后，得到圆柱型模具。
(6)将步骤(4)得到的载酶湿凝胶转移到步骤(5)得到的圆柱型模具中，将模具盖上保鲜膜进行密封，室温静置24小时。
(7)静置过程结束后，在保鲜膜上方扎若干个小孔，开孔率为10％，使其接触空气，将模具放入40℃烘箱中干燥24小时，干燥过程结束后，从模具取出载酶干凝胶整体柱，室温放置24小时，得到载酶干凝胶整体柱催化填料。
对所制得载酶干凝胶整体柱进行扫描电镜表征，结果如图1所示，从图1可以看出，微球为S iO2颗粒，将酶分子包埋其中，相互连结成硅网络结构，中间有空隙可供反应通道。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，将保鲜膜上扎孔的开孔率替换为8％，模具放入烘箱的温度替换为35℃，其他条件与实施例1相比完全相同。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，将保鲜膜上扎孔的开孔率替换为6％，模具放入烘箱的温度替换为25℃，其他条件与实施例1相比完全相同。
实施例4
将实施例1中的制得的载酶干凝胶整体柱催化填料进行酶活性和长期稳定性测试，测试方法如下：将20mg载酶干凝胶粉末于3mL的磷酸盐缓冲溶液(50mM，pH＝7.5)中，在37℃，220rpm下孵育3min然后加入200μL对硝基苯棕榈酸酯(5mg/mL)。在恒温水浴磁力搅拌槽中反应3min后，移出并快速加入1.5mL丙酮以终止反应。最后，用分光光度计在410nm处检测反应溶液。所有数据实验均平行测试了3次。比酶活力(U·g-1)：比酶活是指每分钟内催化底物生1μmol脂肪酸所需要的酶量。
式中，C为对硝基苯酚的浓度(根据吸光度代入标曲计算得出)(mmol/ml)；v为反应体系的体积(ml)；m为固定化酶的用量(g)；t为作用时间(min)。
实施例5～9
与实施例4的测试方法相同。在室温储存的条件下，只是改变时间检测，每2周测一次酶活性。酶活性结果见表1。
表1储存时间对载酶干凝胶整体柱催化填料酶活性的影响
酶活性(U/g)
实施例4
476
实施例5
462
实施例6
440
实施例7
378
实施例8
356
实施例9
332
由表1可以看出，经过5个周期的测试，在室温储存3个月以上，载酶干凝胶整体柱催化填料与实施例4初始酶活相比，还保留69.8％的活性，完全适用于实际操作。
实施例10
将所制得的载酶干凝胶整体柱催化填料用于乙酸乙酯与正丁醇酯交换反应。
将50g正丁醇、119g乙酸乙酯加入到玻璃反应器中，将反应器加热到70℃，再将5g载酶干凝胶整体柱催化填料装入负载型搅拌桨，放入反应器中进行搅拌反应，起始15分钟后进行第一次取样，后面每隔半小时取样，直至达到平衡，用气相色谱分析，计算可得不用时段转化率。
表2不用时间对载酶干凝胶整体柱催化乙酸乙酯与正丁醇酯交换反应转化率的影响
实施例11
用磷酸盐缓冲液(pH＝7.5)洗涤载酶干凝胶整体柱催化填料，然后在30℃烘箱中干燥4小时，所得载酶干凝胶整体柱催化填料再次用于乙酸乙酯与正丁醇酯交换反应。
将再生催化剂填料重复进行实施例11，所得实验数据如表3：
表3载酶干凝胶整体柱催化填料使用次数对正丁醇转化率的影响
通过以上实施例，我们可以得到，本发明制备方法简单，重复性高；该载酶干凝胶整体柱催化填料是一种热稳定高、活性好、选择性高的非均相生物催化剂，该方法制备的载酶干凝胶整体柱催化填料在室温储存3个月以上，还保持69.8％的活性。此外，将其应用于乙酸乙酯与正丁醇酯交换反应，在间歇反应釜中，转化率达到了65.6％；同时，由于SiO2的保护作用，载酶干凝胶结构在反应结束后保持稳定，并且抑制了活性组分酶的流失，使得生物催化剂保持了较长的寿命，可以重复使用。此外，在乙酸乙酯与正丁醇酯交换反应中使用载酶干凝胶整体柱催化填料作为催化剂，克服了现有的乙酸正丁酯生产工艺所用催化剂污染性、后处理难度大、成本高等缺点。
本发明未尽事宜为公知技术。
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