一种壳聚糖酶的固定化方法
阅读说明：本技术 一种壳聚糖酶的固定化方法 (Immobilization method of chitosanase ) 是由 司更花 马韵升 杨传伦 孙建忠 王红霞 王秀芝 梁敬敬 于 2021-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明属于酶工程技术领域,具体涉及一种壳聚糖酶的固定化方法,该方法选用ESR-3作为载体树脂,利用交联剂戊二醛对载体树脂ESR-3进行活化,然后再加入壳聚糖酶液,两者发生共价结合反应,最后加入还原剂硼氢化钠/钾进行处理,得到固定化壳聚糖酶；所获得的固定化壳聚糖酶可用于水解壳聚糖溶液来生产低分子量的水溶性壳寡糖；采用上述方法使壳聚糖酶固定化以后具有较高的贮藏和操作稳定性,酶与底物和产物易分离,利于酶的回收和重复利用等优点,适宜工业化应用。(The invention belongs to the technical field of enzyme engineering, and particularly relates to a chitosan enzyme immobilization method, wherein ESR-3 is selected as carrier resin, the carrier resin ESR-3 is activated by using a cross-linking agent glutaraldehyde, then chitosan enzyme liquid is added, the two carry out covalent bonding reaction, and finally a reducing agent sodium borohydride/potassium borohydride is added for treatment to obtain immobilized chitosan enzyme; the obtained immobilized chitosanase can be used for hydrolyzing a chitosan solution to produce water-soluble chitosan oligosaccharide with low molecular weight; the method has the advantages of high storage and operation stability after the chitosan enzyme is immobilized, easy separation of the enzyme from a substrate and a product, contribution to recovery and reutilization of the enzyme and the like, and is suitable for industrial application.)
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，提供了一种壳聚糖酶的固定化方法。
背景技术
壳聚糖酶(EC.3.2.1.132)是降解壳聚糖的专一性的酶，作用于壳聚糖的β-1,4-糖苷键分解为低分子量的壳寡糖。壳寡糖由于具有其独特的生物学功能在医药、农业、食品等领域有着广泛的用途，是当今国内外研究和开发的热点。
与传统酸降解或氧化降解的方法生产壳寡糖相比，利用生物酶法生产壳寡糖具有工艺简单、环境污染小，且产品分子量小、水溶性好和生物活性高等优点，因此越来越受到重视并且近年来也得到了很大发展。许多生产商采用纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶等非专一性酶降解壳聚糖，但存在生产周期长、得率低等缺点；壳聚糖酶可专一性水解壳聚糖，能特异性作用于GlcN-GlcN、GlcNAc-GlcN、GlcNAc-GlcNAc糖苷键，将壳聚糖水解成低分子量的壳寡糖，具有反应条件温和、无副反应、壳寡糖得率高、不造成环境污染等优点。
实际应用中使用游离壳聚糖酶存在如下缺点：酶的稳定性差，很容易受到pH值和温度的影响而变性失活；酶是水溶性的，反应后无法分离和回收重新利用，因此在生产工艺上往往有升高温度使酶失活的步骤，这不仅造成了成本的增加及能源的浪费，而且也增加了污染产品的机会，因此限制了产品的应用。应用固定化壳聚糖酶可以很好的解决上述问题，不仅可以解决酶回收和再利用、酶污染等问题，而且提高了酶的稳定性，使酶对酸、碱、高温等条件耐受性得到极大的提高，同时采用固定化酶催化，还可简化反应操作，使酶促反应可以实现连续化、自动化，因此固定化酶的研究开发具有极其重要的意义。
目前壳聚糖酶的固定化应用较多的方法有包埋法、吸附法、交联法等，然而这些吸附、交联或者是包埋固定化酶的量都很小，酶的活性损失都比较严重，即使有的酶活回收率达到80％，但是消耗的成本太高，另外包埋之后影响底物与酶活性位点的接触，增大了位阻；酶的半衰期及存活时间都比较短，稳定性低，导致很难在工业化生产中应用。
因此能否提供一种更为合适的壳聚糖酶固定化方法成为研究的难点和重点。
发明内容
本发明针对上述技术存在的不足，提供一种壳聚糖酶的固定化方法，该方法选用ESR-3作为载体树脂，利用交联剂戊二醛对载体树脂ESR-3进行活化，然后再加入壳聚糖酶液，两者发生共价结合反应，最后加入还原剂硼氢化钠/钾进行处理，得到固定化壳聚糖酶；所获得的固定化壳聚糖酶可用于水解壳聚糖溶液来生产低分子量的水溶性壳寡糖；采用上述方法使壳聚糖酶固定化以后具有较高的贮藏和操作稳定性，酶与底物和产物易分离，利于酶的回收和重复利用等优点，适宜工业化应用。
本发明所选用的ESR-3载体树脂，是发明人优选出的最佳载体树脂，发明人同时对大孔树脂，环氧基树脂和ESR-2、ESR-3、ESR-5树脂进行固定化酶的试验后发现，ESR-3固定化后的壳聚糖酶酶活力回收率高，且酶活活性高，该树脂购自天津南开和成科技有限公司，该树脂上带有伯胺基功能基团，用其作为壳聚糖酶载体可以提高稳定性和酶活性，并以此为基础，提供了下述具体的固定化方法：
一种壳聚糖酶的固定化方法，步骤如下：
(1)载体活化
称取一定量的树脂ESR-3载体，加入缓冲液中，同时再加入一定浓度的交联剂，置于摇床上振荡，使之反应2-5h；取出载体，缓冲液清洗树脂，以洗脱液中不含交联剂为标准，滤干备用；
(2)壳聚糖酶的固定化
称取适量活化后的树脂载体，加入上述缓冲液，缓冲液用量以可以浸没过全部载体即可；再加入适量活力的壳聚糖酶酶液，混合均匀后，置于摇床上振荡至壳聚糖酶固载完成；滤出已经固载好壳聚糖酶的载体，分别用纯水和氯化钠溶液清洗，清洗完毕滤出载体，加入硼氢化钠/钾溶液，搅拌过滤，收集载体，检测酶活，即可获得固定化壳聚糖酶。
更进一步的，发明人提供的具体操作步骤如下：
(1)载体活化
称取一定量的树脂ESR-3载体，加入缓冲液中，同时再加入一定浓度的交联剂，置于摇床上振荡，使之反应2-5h；取出载体，缓冲液清洗树脂，以洗脱液中不含交联剂为标准，滤干备用；
所述缓冲液为pH值>7.0的碱性缓冲液，其用量以可以浸没过全部载体即可，更具体的，可以限定缓冲液的用量为树脂载体质量与缓冲液的质量体积比为1g:0.8mL-1g:10mL；
可选自磷酸缓冲液、Tris缓冲液、硼酸钠-氢氧化钠缓冲液；
所述交联剂为戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双重氮联苯胺-2,2’-二硫酸、六亚甲基异氰酸酯、1,5-二氟-2,4-硝基苯砜、己二酰亚胺酸二甲酯中的一种，其用量为缓冲液体积用量的0.2-5％；优选为戊二醛；
采用上述交联剂可以与ESR-3树脂上带有伯胺基形成共价键，进而再与壳聚糖酶以共价键的形式结合，从而实现对壳聚糖酶的固定化；
(2)壳聚糖酶的固定化
称取适量活化后的树脂载体，加入上述缓冲液，缓冲液用量以可以浸没过全部载体即可；
再加入适量活力的壳聚糖酶酶液(所述壳聚糖酶酶液活力为10-300U/mL)，混合均匀后，置于摇床上振荡20h以上，其中树脂载体质量与壳聚糖酶酶液的质量体积比为1g:5mL-1g:30mL；
滤出已经固载好壳聚糖酶的载体，纯水洗涤至茚三酮检测流出液呈阴性；最后用1mol/L氯化钠溶液洗至茚三酮检验呈阴性，滤出载体，加入硼氢化钠/钾溶液，搅拌15min后过滤，收集载体，检测酶活，即可获得固定化壳聚糖酶。
该步骤中缓冲液的用量为树脂载体质量与缓冲液的质量体积比为1g:0.8mL-1g:10mL；
步骤(2)中所采用的硼氢化钠/钾溶液浓度为0.2mM-0.5mM，用量为树脂载体质量与硼氢化钠/钾溶液的质量体积比为1g:2mL-1g:10mL；
现有技术中，酶的固定化操作中一般是采用蒸馏水进行清洗，本申请采用硼氢化钠/钾溶液进行清洗，主要就是由于硼氢化钠/钾溶液具有较强的还原作用，可以使固定化的壳聚糖酶更加稳定，不会轻易脱落。
本发明还提供了利用上述方案制备获得的固定化壳聚糖酶。
在获得上述固定化壳聚糖酶后，发明人进行了下述性能检测：
(1)酶活力检测
游离壳聚糖酶活力测定：取10mL 2％壳聚糖-醋酸溶液，加入1mL壳聚糖酶酶液，在55℃恒温水浴锅内反应10min。降解反应结束后，80℃灭活10min，取出2mL加入2mL2％NaOH溶液中，混匀后离心，去除未反应的壳寡糖。取1mL上清液按照3,5-二硝基水杨酸法(DNS)比色法测定还原糖量，计算游离酶的活力。
固定化壳聚糖酶活力测定：取10mL 2％壳聚糖-醋酸溶液，加入0.1g固定化壳聚糖酶，置于55℃恒温水浴锅内反应10min。反应结束后，立即取出2mL加入2mL2％NaOH溶液中，混匀后离心，去除未反应的壳聚糖。取1mL上清液按照3,5-二硝基水杨酸法(DNS)比色法测定还原糖量，计算固定化酶的活力。
酶活单位定义：在一定条件下，每分钟水解壳聚糖所释放出相当于1μmol还原糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)。
固定化壳聚糖酶活力回收率(％)＝树脂所固定的酶活力(U)/固定前最初加入的酶活力(U)×100％；
壳聚糖水解率(％)＝还原糖含量/起始壳聚糖含量×100％；
经过上述方法检测，本发明中检测的游离壳聚糖酶活为30.62U/mL，经过采用ESR-3树脂与壳聚糖酶酶液比例为1g:15ml进行固定化后进行上述检测，得到固定化酶的活力为455.9U/g，固定化酶活力回收率为99.26％。
(2)固定化壳聚糖酶的稳定性
a.固定化壳聚糖酶的储存稳定性
固定化壳聚糖酶置于在4℃下储存，30d后在最适水解条件下测定储存后酶的残余活力。结果表明，储存30d后固定化壳聚糖酶保持90％以上的酶活力。
b.固定化壳聚糖酶的操作稳定性
稳定性是衡量固定化酶实用价值的主要指标，以固定化酶的重复水解底物实验表征其操作稳定性：
将固定化酶加入2％壳聚糖-醋酸溶液，最适水解条件下以每30min为一次固定化酶水解过程。一次水解反应完成后，用去离子水洗涤固定化酶，除去固定化酶上残余的降解底物及降解产物，然后重新进行水解反应，依次类推；对酶解产物参照DNS比色定糖法测定还原糖浓度，计算固定化酶的剩余活力，结果表明，本发明获得的固定化酶重复水解壳聚糖10次后，酶活仍保持80％以上。
发明人还利用上述获得的固定化壳聚糖酶进行了水解壳聚糖的相关实验如下：
壳聚糖底物浓度按1-6wt％配制，之后加入1-3vt％醋酸溶液充分溶胀，调节pH值4.0-6.0，按一定质量的固定化酶于温度50-60℃下进行酶解反应20-130min，取样检测：反应液滴入2％NaOH溶液中无白色絮状沉淀产生时停止反应；
其中固定化酶用量为：1g壳聚糖需要加入的固定化壳聚糖酶的总酶活为8-50U。
对水解产物壳寡糖分析表明，粘均分子量1-3KDa之间，水溶性良好。
本发明的技术方案有下列优点：
固定化壳聚糖酶使用的伯胺基树脂载体材料和交联剂易于从市场上获得，成本较低；以戊二醛为交联剂，与树脂载体和壳聚糖酶上的氨基残基发生反应形成共价键，并经过还原剂硼氢化钠/钾的作用，由双键还原成单键，增加了固定化酶的稳定性，固定化反应条件温和，工艺流程简单、易于操作。
采用游离壳聚糖酶时，酶解结束后需要对体系进行灭活，这样会使得产品壳寡糖的颜色变深，产品的色度增加，不利用产品品质的提高，与游离酶相比，壳聚糖酶固定化后，极易与底物、产物分开，产物壳寡糖溶液中没有酶的残留，提高了壳寡糖的质量，可用于生产医药级、食品级水溶性壳寡糖产品；固定化壳聚糖酶有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存期，酶可重复使用，成本显著降低，适宜于规模化生产应用。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，下述实施例中，除特殊说明外所述百分比均为重量百分比。
实施例1
一种壳聚糖酶的固定化方法，具体步骤如下：
壳聚糖酶载体的活化
称取5g载体树脂ESR-3于锥形瓶中，加入NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(50mM，pH8.0)100mL，再加入25％戊二醛溶液2mL，置于25℃摇床上150rpm下振荡2h。滤出载体，相同缓冲液清洗5次，每次30mL，以洗净残留的戊二醛为准，滤干备用。
壳聚糖酶的固定化
取上述活化后的载体1g，加入NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(50mM，pH8.0)5mL，再加入含有300U壳聚糖酶酶液(酶液的酶活为60U/mL)5ml，混合均匀后，密封瓶口，置于25℃摇床上150rpm下振荡20h；
滤出树脂载体，纯水洗至茚三酮检测流出液呈阴性，再用1mol/L NaCl溶液洗至茚三酮检验呈阴性，收集载体。
向交联壳聚糖酶的树脂载体中加入100mM最终体积百分比为3％的硼氢化钠溶液，持续搅拌，置于2-8℃下静置3小时，进一步还原共价键；收集载体，检测酶活；固定化酶的酶活为297.23U，固定化酶活力回收率为99.08％，获得固定化壳聚糖酶于4℃下保存备用。
实施例2
一种壳聚糖酶的固定化方法，具体步骤如下：
称取5g载体树脂ESR-3于锥形瓶中，加入NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(50mM，pH8.0)100mL，再加入25％戊二醛溶液2mL，置于25℃摇床上150rpm下振荡3h。滤出载体，相同缓冲液清洗5次，每次30mL，以洗净残留的戊二醛为准，滤干备用。
壳聚糖酶的固定化
取上述活化后的载体1g，加入NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(50mM，pH8.0)5mL，再加入含有486U壳聚糖酶酶液(酶液的酶活为48.6U/mL)10mL，混合均匀后，密封瓶口，置于25℃摇床上150rpm下振荡21h；
滤出树脂载体，纯水洗至茚三酮检测流出液呈阴性，再用1mol/L NaCl溶液洗至茚三酮检验呈阴性，收集载体。
向交联壳聚糖酶的树脂载体中加入100mM最终体积百分比为3％的硼氢化钠溶液，持续搅拌，置于2-8℃下静置3小时，进一步还原共价键；收集载体，检测酶活，固定化酶的酶活为482.03U，固定化酶活力回收率为99.24％，获得固定化壳聚糖酶于4℃下保存备用。
实施例3
利用固定化壳聚糖酶的水解壳聚糖
配制2％浓度的壳聚糖底物，加入1.5％醋酸溶液于55℃水浴中充分溶胀，调节pH值5.5，加入实施例1固定化壳聚糖酶0.2g于温度55℃下进行酶解20min，取反应液滴入2％NaOH溶液至无白色絮状沉淀产生时停止反应，滤出固定化壳聚糖酶以备下次使用；利用乙酰丙酮法对反应液检测，水解产生的壳寡糖粘均分子量大小为473.23Da，色度为429.65曾，水溶性良好。
实施例4
利用固定化壳聚糖酶的水解壳聚糖
配制6％浓度的壳聚糖底物，加入2.5％醋酸溶液于55℃水浴中充分溶胀，调节pH值5.5，加入实施例1固定化壳聚糖酶0.2g于温度55℃下进行酶解20min，取反应液滴入2％NaOH溶液至无白色絮状沉淀产生时停止反应，滤出固定化壳聚糖酶以备下次使用；利用乙酰丙酮法对反应液检测，水解产生的壳寡糖粘均分子量大小为569.62Da，色度为1835.69曾，水溶性良好。
实验例5
实施例1制备的固定化壳聚糖酶的稳定性
1)固定化壳聚糖酶的储存稳定性
称取10.0g固定化壳聚糖酶置于在4℃下储存，30d后在酶的最适水解条件下测定0.5g储存后酶的残余活力。结果表明，储存30d后固定化壳聚糖酶保持90％以上的酶活力。
2)固定化壳聚糖酶的操作稳定性
将0.2g固定化壳聚糖酶加入2％壳聚糖溶液，在最适水解条件下以每20min为一个酶水解过程。一次水解反应完成后，用去离子水洗涤固定化酶，然后重新加入壳聚糖底物进行水解反应。参照DNS比色法测定还原糖浓度，计算固定化壳聚糖酶的剩余活力。结果表明，固定化酶重复水解壳聚糖10次后，酶活仍可保持80％。
对照例1
配制2％浓度的壳聚糖底物，加入1.5％醋酸溶液于55℃水浴中充分溶胀，调节pH值5.5，加入游离壳聚糖酶100U，于温度55℃下进行酶解20min，取反应液滴入2％NaOH溶液至无白色絮状沉淀产生时停止反应，并放入沸水浴中进行灭活15min得到水解产物壳寡糖；利用乙酰丙酮法对反应液检测，水解产生的壳寡糖粘均分子量大小为3000Da，水溶性良好，但其色度较高，为1969.89曾，其原因为游离酶水解完成之后因为酶活性还在所以需要高温灭活，一般是沸水浴10-20min的条件，在这种高温环境下会导致水解产物壳寡糖色度变高，进而会影响产品外观，可见与实施例3相比，实施例3获得的壳寡糖粘均分子量和色度均远低于该对照例。
对照例2
配制6％浓度的壳聚糖底物，加入2.5％醋酸溶液于55℃水浴中充分溶胀，调节pH值5.5，加入游离壳聚糖酶300U，于温度55℃下进行酶解20min，取反应液滴入2％NaOH溶液至无白色絮状沉淀产生时停止反应，并放入沸水浴中进行灭活15min得到水解产物壳寡糖；利用乙酰丙酮法对反应液检测，水解产生的壳寡糖粘均分子量大小为3069Da，水溶性良好，但其色度较高，为6983.59曾，通过比对，可以看到与实施例4相比，实施例4获得的壳寡糖粘均分子量和色度均远低于该对照例。
对照例3
称取5g载体环氧基树脂于锥形瓶中，加入NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(50mM，pH8.0)100mL，再加入25％戊二醛溶液2mL，置于25℃摇床上150rpm下振荡3h。滤出载体，相同缓冲液清洗5次，每次30mL，以洗净残留的戊二醛为准，滤干备用。
壳聚糖酶的固定化
取上述活化后的载体1g，加入NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(50mM，pH8.0)5mL，再加入共含326U壳聚糖酶酶液(酶液的酶活为32.6U/mL)10mL，混合均匀后，密封瓶口，置于25℃摇床上150rpm下振荡20h；
滤出树脂载体，纯水洗至茚三酮检测流出液呈阴性，再用1mol/L NaCl溶液洗至茚三酮检验呈阴性，收集载体。
向交联壳聚糖酶的树脂载体中加入100mM最终体积百分比为3％的硼氢化钠溶液，持续搅拌，置于2-8℃下静置3小时，进一步还原共价键；收集载体，检测酶活，固定化酶的酶活为99.78U，固定化酶活力回收率为30.61％；
获得固定化壳聚糖酶在重复使用时，在第一次使用后酶活降为40.21U，损失60％，第二次使用后固定化酶的酶活为7.93U，酶活损失达92％以上。