一种钛酸盐纳米管复合材料固定化漆酶的方法
阅读说明：本技术 一种钛酸盐纳米管复合材料固定化漆酶的方法 (Method for immobilizing laccase by titanate nanotube composite material ) 是由 张慧君 王俊峰 潘建泽 张鹏鹏 于 2021-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种钛酸盐纳米管复合材料固定化漆酶的方法,首先制备得到钛酸盐纳米管,然后利用混合熔盐对钛酸盐纳米管进行改性,最后改性的钛酸盐纳米管上接枝壳聚糖,所得材料用于固定化漆酶后能够实现对2,4-二氯苯酚的高效降解,降解率最高接近99%,且酸碱性稳定性好,热稳定性好,具有良好的应用前景。(The invention discloses a method for immobilizing laccase by using a titanate nanotube composite material, which comprises the steps of firstly preparing titanate nanotubes, then modifying the titanate nanotubes by using mixed molten salt, and finally grafting chitosan on the modified titanate nanotubes, wherein the obtained material can realize the high-efficiency degradation of 2, 4-dichlorophenol after being used for immobilizing the laccase, the degradation rate is close to 99 percent at most, and the material has good acid-base stability, good thermal stability and good application prospect.)
技术领域
本发明属于漆酶固定化技术领域，具体涉及一种钛酸盐纳米管复合材料固定化漆酶的方法。
背景技术
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于各类生物体中。由于漆酶较好的稳定性和专一性，其在废水处理、生物传感器构建、食品工业等领域具有广泛的应用。但是，由于漆酶蛋白质的构成，使得游离漆酶对于外部环境十分敏感，极易失活。相应地，漆酶固定化技术随之得以发展。在漆酶固定化技术中，固定化载体起着关键性的作用，常用的漆酶固定载体有无机材料、天然高分子材料、合成高分子材料等。
无机材料中，石墨烯、碳纳米管得到了广泛的使用，如专利文献CN105647902A、CN107988196A、CN108018281A、CN109912048A等均报道了相关的技术方案。但是，因为碳纳米管疏水性及易聚集的不足，使得其通常需要在强酸等特殊条件下进行处理，而潜在的化学残留会对漆酶的活性产生影响。相较之下，碳酸盐纳米管具备的亲水性、易修饰等优点使得其具备成为漆酶优良载体的潜力。基于此，本发明希望提供一种钛酸盐纳米管复合材料固定化漆酶的方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种钛酸盐纳米管复合材料固定化漆酶的方法，所用漆酶固定化载体以钛酸盐纳米管为原始载体，通过熔盐法改性后自组装壳聚糖，实现了漆酶的高效固定，稳定性好，能够重复利用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种钛酸盐纳米管复合材料固定化漆酶的方法，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备；
（2）漆酶的固定化；
其中，所述漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、钛酸盐纳米管的制备；
S2、钛酸盐纳米管的改性：将步骤S1中得到的钛酸盐纳米管与混合盐混合，随后在管式炉中进行高温反应，反应完成后进行搅拌洗涤直至pH值为中性，即得改性钛酸盐纳米管；
S3、钛酸盐纳米管复合材料的制备：将步骤S2中得到的改性钛酸盐纳米管分散于醋酸溶液中，超声分散均匀；随后加入含壳聚糖的混合液a，接着开始搅拌混合，搅拌混合完成后经离心、洗涤、干燥处理，即得钛酸盐纳米管复合材料。
优选地，步骤S1中钛酸盐纳米管的制备方法如下：将二氧化钛纳米粉末加入氢氧化钠溶液中，超声分散均匀，随后于120~150℃下水热反应1~5d，反应完成后用去离子水洗涤，随后将产物浸入盐酸中浸泡，浸泡完成后再次用去离子水清洗，即得钛酸盐纳米管。
优选地，步骤S2中混合盐为硝酸钠和碳酸钠的混合物或硝酸钾和氢氧化钾的混合物。
优选地，硝酸钠和碳酸钠的质量比为1:1，硝酸钾和氢氧化钾的质量比为1:1。
优选地，步骤S2中混合盐、钛酸盐纳米管的质量比为10~50:1。
优选地，步骤S2中高温反应温度为340~350℃，高温反应时间为1~4h，反应升温速率为12℃/min。
优选地，步骤S3中含壳聚糖的混合液a由100mg壳聚糖、100mL 0.1mol/L的醋酸溶液混合而成。
优选地，改性钛酸盐纳米管的用量为0.4~0.8 g，醋酸溶液与混合液a的体积用量比为1：1。
优选地，步骤S3中搅拌混合温度为室温，时间为12~36h，搅拌速度为350r/min。
优选地，步骤（2）中漆酶的固定化包括如下步骤：室温下，取2mL 1%wt的戊二醛溶液，加入0.4g钛酸盐纳米管复合材料，180r/min转速下振荡，随后离心分离得到载体；将所得载体加入到1mL pH为5.5的含漆酶的醋酸-醋酸钠缓冲液中，室温下振荡4h，抽滤、洗涤后即得固定化漆酶；
其中，漆酶的浓度为0.8 g/L。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明首先制备得到钛酸盐纳米管，然后利用混合熔盐对钛酸盐纳米管进行改性，最后改性的钛酸盐纳米管上接枝壳聚糖，所得材料用于固定化漆酶后能够实现对2,4-二氯苯酚的高效降解，最高可达99%左右，且所得固定化漆酶酸碱性稳定性好，热稳定性好。
（2）本发明创造性地将常用于碳纳米管修饰的熔盐法用于对钛酸盐纳米管的修饰，能够对钛酸盐纳米管进行选择性腐蚀，在高温下，金属熔盐发生电离，与钛酸盐表面剧烈碰撞，增加钛酸盐表面的粗糙度，形成不规则的表面缺陷；从而，为后续壳聚糖的自组装提供更多的活性吸附位点，进而提高漆酶的固定量。
（3）本发明在改性钛酸盐纳米管的表面接枝壳聚糖，利用壳聚糖丰富的电荷自组装结合在改性钛酸盐纳米管的表面，经过改性后的钛酸盐纳米管具有丰富的结合点位，避免了壳聚糖直接自组装易脱离造成固定化漆酶的稳定性不佳的情况。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和发明优势更加清楚阐述，以下将结合说明书实施例对本发明做进一步详细讲解。
特别需要强调的是，漆酶购买自Aldrich公司；钛酸盐为金红石型二氧化钛，购自aladdin公司。如无特殊说明，本发明中的其他原料或试剂也通过商业渠道购买。
实施例1
一种钛酸盐纳米管复合材料固定化漆酶的方法，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备：
（2）漆酶的固定化室温下，取2mL 1%wt的戊二醛溶液，加入0.4g漆酶固定化载体，180r/min转速下振荡，随后离心分离得到交联载体；将所得交联载体加入到1mL pH为5.5的含漆酶的醋酸-醋酸钠缓冲液中，室温下振荡4h，抽滤、洗涤后即得固定化漆酶；
其中，漆酶的浓度为0.8 g/L；
其中，所述漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、钛酸盐纳米管的制备：将3g二氧化钛纳米粉末加入到100mL、10mol/L氢氧化钠溶液中，超声分散均匀，随后于125℃下水热反应2.5d，反应完成后用去离子水洗涤，随后将产物浸入盐酸中浸泡12h，浸泡完成后再次用去离子水清洗，即得钛酸盐纳米管；
S2、钛酸盐纳米管的改性：将步骤S1中得到的2g钛酸盐纳米管与30g混合盐（质量比为1:1的硝酸钠和碳酸钠混合而成）混合，随后在管式炉中于340℃下反应2h，反应升温速率为12℃/min，反应完成后进行搅拌洗涤直至pH值为中性，即得改性钛酸盐纳米管；
S3、钛酸盐纳米管复合材料的制备：将步骤S2中得到的0.5g改性钛酸盐纳米管分散于100mL、0.1mol/L的醋酸溶液中，超声分散均匀；随后加入100mL含壳聚糖的混合液a（由100mg壳聚糖、100mL 0.1mol/L的醋酸溶液混合而成），于室温下搅拌混合12h，搅拌速度为350r/min，搅拌混合完成后经离心、洗涤、干燥处理，即得钛酸盐纳米管复合材料。
实施例2
一种钛酸盐纳米管复合材料固定化漆酶的方法，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备：
（2）漆酶的固定化室温下，取2mL 1%wt的戊二醛溶液，加入0.4g漆酶固定化载体，180r/min转速下振荡，随后离心分离得到交联载体；将所得交联载体加入到1mL pH为5.5的含漆酶的醋酸-醋酸钠缓冲液中，室温下振荡4h，抽滤、洗涤后即得固定化漆酶；
其中，漆酶的浓度为0.8 g/L；
其中，所述漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、钛酸盐纳米管的制备：将2.5g二氧化钛纳米粉末加入到100mL、10mol/L氢氧化钠溶液中，超声分散均匀，随后于130℃下水热反应3d，反应完成后用去离子水洗涤，随后将产物浸入盐酸中浸泡16h，浸泡完成后再次用去离子水清洗，即得钛酸盐纳米管；
S2、钛酸盐纳米管的改性：将步骤S1中得到的2.5g钛酸盐纳米管与30g混合盐（质量比为1:1的硝酸钠和碳酸钠混合而成）混合，随后在管式炉中于342℃下反应2.5h，反应升温速率为12℃/min，反应完成后进行搅拌洗涤直至pH值为中性，即得改性钛酸盐纳米管；
S3、钛酸盐纳米管复合材料的制备：将步骤S2中得到的0.5g改性钛酸盐纳米管分散于100mL、0.1mol/L的醋酸溶液中，超声分散均匀；随后加入100mL含壳聚糖的混合液a（由100mg壳聚糖、100mL 0.1mol/L的醋酸溶液混合而成），于室温下搅拌混合16h，搅拌速度为350r/min，搅拌混合完成后经离心、洗涤、干燥处理，即得钛酸盐纳米管复合材料。
实施例3
一种钛酸盐纳米管复合材料固定化漆酶的方法，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备：
（2）漆酶的固定化室温下，取2mL 1%wt的戊二醛溶液，加入0.4g漆酶固定化载体，180r/min转速下振荡，随后离心分离得到交联载体；将所得交联载体加入到1mL pH为5.5的含漆酶的醋酸-醋酸钠缓冲液中，室温下振荡4h，抽滤、洗涤后即得固定化漆酶；
其中，漆酶的浓度为0.8 g/L；
其中，所述漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、钛酸盐纳米管的制备：将2g二氧化钛纳米粉末加入到100mL、10mol/L氢氧化钠溶液中，超声分散均匀，随后于130℃下水热反应3d，反应完成后用去离子水洗涤，随后将产物浸入盐酸中浸泡16h，浸泡完成后再次用去离子水清洗，即得钛酸盐纳米管；
S2、钛酸盐纳米管的改性：将步骤S1中得到的3g钛酸盐纳米管与30g混合盐（质量比为1:1的硝酸钠和碳酸钠混合而成）混合，随后在管式炉中于345℃下反应3h，反应升温速率为12℃/min，反应完成后进行搅拌洗涤直至pH值为中性，即得改性钛酸盐纳米管；
S3、钛酸盐纳米管复合材料的制备：将步骤S2中得到的0.5g改性钛酸盐纳米管分散于100mL、0.1mol/L的醋酸溶液中，超声分散均匀；随后加入100mL含壳聚糖的混合液a（由100mg壳聚糖、100mL 0.1mol/L的醋酸溶液混合而成），于室温下搅拌混合24h，搅拌速度为350r/min，搅拌混合完成后经离心、洗涤、干燥处理，即得钛酸盐纳米管复合材料。
对比例1
一种钛酸盐纳米管复合材料固定化漆酶的方法，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备：
（2）漆酶的固定化室温下，取2mL 1%wt的戊二醛溶液，加入0.4g漆酶固定化载体，180r/min转速下振荡，随后离心分离得到交联载体；将所得交联载体加入到1mL pH为5.5的含漆酶的醋酸-醋酸钠缓冲液中，室温下振荡4h，抽滤、洗涤后即得固定化漆酶；
其中，漆酶的浓度为0.8 g/L；
其中，所述漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、钛酸盐纳米管的制备：将2.5g二氧化钛纳米粉末加入到100mL、10mol/L氢氧化钠溶液中，超声分散均匀，随后于130℃下水热反应3d，反应完成后用去离子水洗涤，随后将产物浸入盐酸中浸泡16h，浸泡完成后再次用去离子水清洗，即得钛酸盐纳米管；
S2、钛酸盐纳米管复合材料的制备：将步骤S1中得到的0.5g钛酸盐纳米管分散于100mL、0.1mol/L的醋酸溶液中，超声分散均匀；随后加入100mL含壳聚糖的混合液a（由100mg壳聚糖、100mL 0.1mol/L的醋酸溶液混合而成），于室温下搅拌混合16h，搅拌速度为350r/min，搅拌混合完成后经离心、洗涤、干燥处理，即得钛酸盐纳米管复合材料。
对实施例1~3及对比例1制备得到的固定化漆酶进行酶活力测试、固定化漆酶量测试、降解吸附性能测试、热稳定性测试。具体测试方法如下：
（1）酶活性测试
将2mL 1mg/mL的游离漆酶或者2 mg 得到的固定化漆酶加入到1mmol/L的ABTS溶液中，于25℃下振荡反应15min后，置于冰浴中终止反应，离心分离，使用紫外-可见分光光度计测定上清液在420nm处的吸光度变化，即可计算出相应的酶活力。
本实施例中，紫外-可见分光光度计型号为新世纪T6。
（2）固定化漆酶量测试
a）蛋白质标准曲线的绘制：按照不同量分别加入1000 µg/mL 标准蛋白质溶液和蒸馏水，随后再分别依次加入5mL考马斯亮蓝 G-250 试剂，染色 5 min 后测其吸光度，以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制蛋白质标准曲线。
b）固定化漆酶量的测定：采用考马斯亮蓝法进行漆酶量的测试；其中，酶量计算公式如下：
Q（%）=（Co-C）V/W*100；
上式中，Q为酶吸附量，Co为固定化前溶液中的漆酶的浓度；C为固定化后溶液中漆酶的浓度，V为固定化溶液的总体积，W为载体的质量。具体到本案，Co=0.8 g/L，V=1mL=1*10-3L，W=0.4g。具体的测试、计算结果见表1。
表1固定化漆酶量测试结果
固定化漆酶量/（mg/g）
实施例1
184.1
实施例2
185.6
实施例3
184.9
对比例1
152.4
从表1中可以看到，本发明中各实施例对漆酶的固定化量超过180 mg/g，固定化效率高。
（3）2,4-二氯苯酚的降解吸附
取0.15g固定化漆酶与15mL、10mg/L的2,4-二氯苯酚进行混合，室温条件下反应5h，离心分离，取10mL上清液稀释，随后依次加入1.25mL、0.5mol/L 的 NH3·H2O，0.5ml、2%的 4-氨基安替比林，0.5mL、80g/L 的铁氰化钾溶液，搅拌反应 15min，通过紫外分光光度计测量在波长 510nm 处的吸光度变化，即可计算得到固定化漆酶对 2,4-二氯苯酚的吸附降解率。
本实施例中，HPLC为日本岛津LC-20A。
表2 2,4-二氯苯酚降解吸附测试结果
降解吸附率/%
实施例1
97.8
实施例2
98.9
实施例3
98.2
对比例1
84.27
从上表中，可以看到，本申请各实施例中制备得到的固定化漆酶对2,4-二氯苯酚均具有较好的吸附降解率。
（4）稳定性测试
热稳定性测试：将实施例1~3和对比例1中制备得到的固定化漆酶（100mg）与游离酶（100mg）在不同温度下保存1.5h，按前述酶活测试方法，计算得到酶的剩余活性。
测试结果表明，实施例1~实施例3得到的固定化酶在60℃下保存2 h后酶的剩余活性仍保持有77%以上；对比例1中酶的剩余活性为68%；而游离漆酶的剩余活性仅为58.6%。
酸碱稳定性测试：将实施例1~3和对比例1中制备得到的固定化漆酶（100mg）与游离酶（100mg）在20mL pH值3~8的PBS缓冲液中室温下保存12h，随后加入2mL 1.00mmol/L的ABTS溶液混合，室温下搅拌1h，冰浴终止反应，取上清液，按前述酶活测试方法，计算得到酶的剩余活性。实施例1~3所得固定化漆酶在pH值3~8的范围内酶剩余活性相较于对比例1均更高，且实施例1~3所得固定化漆酶在pH值3~6的范围内的酶剩余活性均在80%以上。
以上说明描述本发明中的一个较佳的实施方式，不应将其看作为是对本发明权利要求保护范围的限制。在不脱离本发明原理和精神的情况下，任何修改、等效替换及改进，都应视为在本发明权利要求保护范围之内。