具体实施方式

实施例1:本发明GCS抑制剂治疗可卡因成痛

1实验试剂

本部分使用的试剂如下：

盐酸可卡因(中国食品药品检定研究院)

生理盐水(四川科伦药业股份有限公司)

RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司，P0013B)

BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，P0010)

5×SDS-PAGE电泳上样缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司，P0015)

7.5％SDS-PAGE试剂(广州佰合生物科技有限公司，PG111)

10％SDS-PAGE试剂(广州佰合生物科技有限公司，PG112)

12.5％SDS-PAGE试剂(广州佰合生物科技有限公司，PG113)

甲醇(上海化学试剂有限公司)

蛋白质预染marker(Thermo Scientfic，26616)

Tris-base(Solarbio，G8200)

甘氨酸(Solarbio，T8060)

抗GCS抗体(上海生工生物工程股份有限公司)

抗Tubulin抗体(Cell Signaling Technology，#15115)

辣根过氧化物酶标记的二抗(Cell Signaling Technology，#8887)

BeyoECL(上海碧云天生物技术有限公司，P0018)

Tween-20(Biorad，#1706531)

RNA提取试剂盒(Axygen，AP-MN-P-50)

异丙醇(上海化学试剂有限公司)

100％乙醇(上海化学试剂有限公司)

DEPC水(上海碧云天生物技术有限公司)

RNAStore样本保存液(天根生化科技有限公司，DP408)

BestarTM qPCR RT Kit(Bioscience，DBI-2220)

Stormstar SYBY Green qPCR Mastermix(Bioscience，DBI-2243)

HPLC甲醇(Sigma，34860)

HPLC乙酸乙酯(Sigma，650528)

HPLC异丙醇(Sigma，34863)

甲酸(Sigma，695076)

LC-MS甲酸铵(Sigma，516961)

LC-MS甲酸钠(Sigma，71539)

LC-MS亮氨酸脑啡肽(Waters)

PE(17:0/17:0)(Avanti，830756)

LPC(17:0)(Avanti，855676)

Glucosylceramide(C18:1/16:0)(Avanti，860539)

Glucosylceramide((C18:1/18:0)(Avanti，860548)

Glucosylceramide((C18:1/24:1)(Avanti，860549)

Eliglustat hemitartrate(MedChemExpress，HY-14885A)

DMEM高糖培养基(Hyclone，41966052)

胎牛血清(Hyclone，10100139)

磷酸盐缓冲液(Hyclone，10010049)

二甲基亚砜(Sigma，V900090)

Nerve Growth Factor(Thermo Scientfic，13257019)

2主要仪器

电子分析天平(Sartorius)

超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)

冰箱(伊莱克斯)

深低温冰箱(Thermo Scientific)

制冰机(Scotsman)

平板摇床(海门市麒麟医用仪器厂)

可调式漩涡混悬仪(SCILOGEX)

超声波破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)

恒温水浴锅(国华电器有限公司)

倒置式生物显微镜TS100(Nikon)

多管架自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)

LifeECO基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)

电泳仪(美国Bio-Rad公司)

电泳槽(美国Bio-Rad公司)

蛋白印迹凝胶成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)

恒温摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)

全波长酶标仪(Thermo Electron Corporation)

CFX96TM Real-Time System(美国Bio-Rad公司)

小鼠脑立体定位仪(深圳瑞沃德生物科技有限公司)

小鼠自发活动检测箱(深圳瑞沃德生物科技有限公司)

小鼠条件性位置偏爱检测箱(宁波安来软件科技有限公司)

小鼠自主给药检测箱(宁波安来软件科技有限公司)

深低温冰箱(Thermo Scientific)

5μl平头微量注射器(深圳瑞沃德生物科技有限公司)

二氧化碳培养箱IGO150(Jouan)

超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)

恒温水浴锅(国华电器有限公司)

倒置式生物显微镜TS100(Nikon)

UPLC-Qtof-MS/MS(G2-S)分离检测器(Waters)

C18色谱分离柱(Waters)

超声破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)

微量移液器(Eppendorf)

3实验方法

3.1试验动物

本研究采用的野生型动物均为雄性SPF等级健康性成熟(8-12周龄) C57BL/6J小鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，体重20-22g，未交配过。饲养条件：国家(成都)新药临床前安全性评价中心普通动物房，温度为20-25℃，相对湿度为55-65％，整个实验过程中，动物自由摄食和饮水，饲养环境符合《实验动物环境及设施》中标准GB14925-2001。本课题涉及的所有动物实验操作均符合AAALAC要求，实验前需正常饲养实验动物 3-5天，以使小鼠熟悉并适应环境。

3.2多次可卡因注射

多次可卡因注射给药主要参照文献给药方案。具体为：每天腹腔注射 20mg/kg可卡因一次，连续给药7天。最后一次注射给予可卡因半小时后参照小鼠脑立体定位图谱取出前额叶皮质、纹状体、伏隔核和海马四个脑区样本，用于Western blot检测。

多次可卡因注射用于检测时间效应的具体操作为：每天腹腔注射 20mg/kg可卡因一次，分别连续给药1天，2天，3天，5天，7天。最后一次注射给予可卡因半小时后参照小鼠脑立体定位图谱取出伏隔核。

3.3可卡因诱导行为敏化模型建立

行为敏化实验箱由有机玻璃做成四个相同大小的正方形箱子，每个箱子周围是光滑的黑色有机玻璃板，底部是光滑的白色有机玻璃板，行为敏化箱装置如图1所示。小鼠在实验箱内自由活动，适应三天，每天10min。行为敏化实验分为2个阶段，在实验过程中，按照表3-1注射可卡因和生理盐水。第一阶段(day0)：不做任何处理条件下，使用Noldus公司的Ethovision XT 记录15min内所有小鼠运动距离，作为基础值。第二阶段(day1-day7)：每天同一时间可卡因组给予可卡因，生理盐水组给予同等剂量的生理盐水，连续7天，每天1次。给药方案如表1所示。给药后立即将小鼠放入行为敏化箱内，记录15min内小鼠的活动距离。采用SPSS统计软件分析实验结果，差值以均数±标准误表示，用双尾t检验分析法比较可卡因组和生理盐水组的差异，p<0.05表示有统计学差异。

表1 行为敏化给药方案表

3.4可卡因诱导小鼠条件性位置偏爱模型(Conditioned Place Preference,CPP)

CPP操作箱如图2所示。CPP实验箱由塑料隔板做成的黑、白两个大箱和中间灰色小箱构成，黑色大箱具有黑色四壁和圆孔粗糙地面，白色大箱是白色四壁和条纹型粗糙底面。小鼠在实验箱内自由活动，适应环境三天，每次15min。CPP实验分为3个阶段，第一阶段(day1)：测试小鼠的自然偏好。第二阶段(day2-day7)：训练阶段，在此期间，用塑料隔板封闭箱间的通道，第2，4，6天注射可卡因，立即将小鼠放入非偏爱箱，第3，5，7天注射生理盐水，立即将小鼠放入偏爱箱，每次小鼠在箱内停留的时间为15min；第三阶段(day8)：测试阶段，在此阶段，移去塑料隔板，让小鼠在箱内自由活动穿梭，并记录15min小鼠分别在黑、白箱内停留时间。给药方案如表2所示。小鼠在测试完毕30min内迅速解剖，取出伏隔核以供后续检测。

结果用条件性位置偏爱测试期间时间差值统计，偏爱箱停留时间减去非偏爱箱停留时间差值作为诱导后偏好值，结果与自然偏好状态时间差相比较来表达。采用SPSS统计软件分析实验结果，差值以均数±标准误表示，用双尾t检验分析法比较可卡因组和生理盐水组的差异，p<0.05表示有统计学差异。

表2 条件性位置偏爱给药方案表

3.5可卡因自主给药模型建立

3.5.1小鼠颈静脉插管滞留术

颈部静脉插管滞留术是自主给药模型建立的基础，也是决定建立该模型成功的关键步骤。手术前，实验动物适应3-5天实验环境，每天与实验人员接触，避免实验动物产生应激反应。颈静脉插管采用进口硅胶硬管(外径0.48mm，内径0.40mm，长度约5mm)以及配套的硅胶软管(长度约3mm) 制备，软管置于硬管前端，以免对小鼠造成刺激。

手术时，根据小鼠体重腹腔注射水合氯醛(10％，10ml/kg)麻醉小鼠，剔除颈部左侧锁骨部位鼠毛，小鼠头部朝向实验人员进行仰卧式固定，在锁骨上端开一个纵向约1cm切口，钝性分离皮下组织，拨离颈部外静脉，整个过程可滴少量生理盐水，防止皮肤、血管干燥。用眼科剪在静脉上剪出斜开口，将之前制备的插管软管端插入静脉，并用手术线打结固定插管。插入的预制导管预先使整个管路充满肝素钠，防止凝血。然后盖好导管帽，缝合颈部和背部伤口。手术结束后，将小鼠在电热毯上保温至苏醒，然后将小鼠放在干净笼里，五只合笼饲养。从手术第二天开始，每天经插管注射少量含有抗生素的肝素钠，确保导管畅通，防止伤口感染。小鼠的术后恢复期通常为 7天。完成此手术的小鼠可以用来建立可卡因自主给药模型。

3.5.2小鼠自主给药(Self-administration)

小鼠自主给药系统采用安莱软件科技有限公司(中国宁波)生产制造的小鼠自主给药系统(图3)。每个操作箱均放置于有通风扇的隔音柜中，操作箱内设备主要包括两个鼻触器，一个笼灯，输液连接系统，一个箱体灯以及食物槽。另外，给药系统还包括注射泵，实验动物行为记录系统等。

在小鼠可卡因自主给药训练期间，FR1(fixed ratio-1)是最简单、最基础的训练模式，即小鼠每触碰一次有效鼻触器，系统自动泵出预设体积的可卡因。本研究中采用FR1程序进行训练，实验训练时间为120min/天，每轮训练的最大注射次数为100次，每次设备不应期为20s，注射可卡因0.75mg/kg，左侧鼻触孔为有效鼻触，右侧鼻触孔为无效鼻触。每次有效鼻触后，笼灯关闭，信号灯亮，无效鼻触后，无任何反应。确定模型建立成功后，最后一次给药2h内解剖小鼠，取出伏隔核脑区用于后续检测。

自主给药模型成功的判定标准：形成条件式反射；自主获取可卡因频率稳定；动物连续三天打药次数在其平均值的10％范围以内。

3.6食物诱导的条件性位置偏爱模型

小鼠食物CPP模型建立与可卡因诱导的CPP操作类似。在建立模型之前，首先进行7天的饥饿适应期，每次适应15min。在适应期内，小鼠每天仅可进食1h，其余时间只可自由饮水，但不提供饲料。在第七天结束后，检测小鼠的体重变化情况。在第七天末选取体重不低于起始体重70％的小鼠进入食物CPP训练。在第八天开始进行检测原始偏好，然后随机分组，进行条件化训练和测试交替地建立食物CPP模型。训练期间，食物条件化训练的小鼠先在喂食笼里进食1h，然后立即放入偏爱箱，训练15min；非食物条件化训练时先进行1h假饲(放入喂食笼，但不给予饲料)，随后立即放入非偏爱箱，训练15min。对照组动物训练前不喂食，训练完成后再统一进食1h。

结果用条件性位置偏爱测试期间差值比较，偏爱箱停留时间减去非偏爱箱停留时间差值作为诱导后偏好，与自然偏好时间差值相比较来表达。采用 SPSS统计软件分析实验结果，差值以均数±标准误表示，用双尾t检验分析法比较食物诱导组和对照组的差异，p<0.05表示有统计学差异。

3.7伏隔核脑内定点注射GCS抑制剂

3.7.1伏隔核脑区埋管

脑区定位埋管是脑区定点给药的直接手段和常用技术。本研究中使用10％水合氯醛(0.4g/kg体重)麻醉小鼠，头顶部剃毛，将麻醉后的小鼠固定在脑立体定位仪上，固定后调节头部至水平状态，医用酒精消毒皮肤，使颅骨暴露，用棉球和眼科剪除去颅骨表面的脑膜，找到前囟部位，记号笔标记；调节立体定位仪，安置注射导管并固定(深圳瑞沃德生物科技有限公司，#62003， OD 0.48mm X ID 0.34mm)，以前囟部位为原点，参考定位坐标(伏隔核：AP +1.5；ML±1.2；DV-4.5)把导管移动到注射部位的正上方，当导管底部与颅骨刚接触，调零Y坐标，向下缓慢移动注射针至4.5mm深，松开坐标臂并移开，将牙科粉与稀释液调至浆糊状固定套管。待牙科水泥干燥后，插入导管帽(深圳瑞沃德生物科技有限公司，#62102，OD 0.30mm)，防止导管堵塞，并缝合头顶部伤口。手术结束后，将小鼠放置在电热毯上保温至苏醒，然后放入干净饲养笼中，五只合笼饲养。小鼠的术后恢复期为7天，在正式实验前一天检查导管是否堵塞。经过此手术的动物用于研究伏隔核注射GCS抑制剂Eliglustat调控可卡因诱导的行为学效应改变。

3.7.2伏隔核脑区定点注射抑制剂

经过双侧伏隔核埋管的小鼠，采用微量注射针和微量注射导管，按照表 3给药剂量给予GCS抑制剂——Eliglustat。Eliglustat用DMSO配制为100X 的储备液，使用前用生理盐水稀释至可用浓度。

表3 GCS抑制剂注射剂量

3.8组织分离取材

各组实验检测结束后，在预定解剖时间内快速脱颈处死小鼠，然后迅速分离大脑，用4℃生理盐水冲洗3遍后，按照脑解剖图谱分离取出伏隔核。直接将伏隔核放入准备好的1.5ml EP管中，然后迅速冻存于液氮，最后待组织收集完全保存于-80℃以备后续检测。

3.9实时荧光定量PCR

3.9.1RNA提取

按照RNA提取试剂盒(Axygen)说明书提取RNA。主要步骤包括：将取材得到的伏隔核脑区加入Buffer R-I200μl中，用1ml注射器反复抽吸10-15 次，再加入Buffer R-II75μl，漩涡振荡15-30s，4℃，12000g离心5min。取上清，加入125μl异丙醇，混合均匀。将试剂盒中的制备管置于2ml离心管中，把混合液加入制备管中，4℃，6000g离心1min。弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入500μl Buffer W1A，4℃，12000g离心1min。弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入700μl Buffer W2，4℃， 12000g离心1min；以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次。弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，4℃，12000g离心1min。将制备管放入干净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加20μl RNase-free水。室温静置1min， 4℃，12000g离心1min，洗脱得RNA。

3.9.2RNA逆转录与Realtime PCR反应

使用Bioscience的反转录试剂盒将纯化提取出的RNA逆转录成 cDNA，反应体系如下表4所示：

表4 反转录反应液体系配置

配制好的体系在37℃条件下，进行15分钟的逆转录反应。然后在98℃条件下，进行5分钟的逆转录酶失活反应。反应结束后，保存于-20℃备用。

将制备好的cDNA进行实时荧光定量PCR反应，根据Bioscience 说明书建立反应体系与反应条件(表5)。本研究所用引物均购自上海生工生物工程股份有限公司，详细序列见表6。

表5 逆转录反应体系配置

表6 mRNA检测PCR引物序列列表

F,前引物；R,后引物.

配制好后反应体系后，小心盖上PCR八连管盖，将准备好的PCR板涡旋离心后，将PCR板置于Realtime PCR仪中进行PCR反应，反应按照以下程序进行：95℃反应3min，40个PCR循环(单次循环参数：95℃，15秒； 60℃，40秒)。为建立PCR产物的溶解曲线，扩增反应结束后，梯度加热将温度从65℃缓慢加热到95℃。

3.9.3结果与计算

各样本的目的基因和内参基因在同一块PCR板上分别进行qRT-PCR反应，数据采用2^-ΔΔCt法进行差异分析。

3.10蛋白提取与蛋白免疫印迹(Western blot)

3.10.1脑组织总蛋白提取与定量

取-80℃冻存的伏隔核，加入适量100μl RIPA裂解液，裂解液体系中加入蛋白酶抑制剂Cocktail和PMSF，置于冰上裂解15min。冰浴超声10次，5 秒/次，每次间隙3秒，超声目的是破碎组织细胞，充分释放溶解蛋白。接着 4℃，13000g离心15min，吸取上清液。使用BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)定量蛋白浓度，主要步骤为：首先，稀释BSA至 0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0.05，0.025，0mg/ml浓度梯度；然后将提取的蛋白上清液稀释30倍，稀释好的BSA和蛋白样品分别加20μl至96孔板相应孔内。再在各孔中加入200μl工作液，37℃避光孵育20-25min。随后用全波长酶标仪测定波长562nm时的吸光度值，当BSA标准曲线线性相关性 R²>0.99为合格定量，然后计算出对应的各样本蛋白浓度。根据需要将样本进行相应稀释，再在每个样本中加入5×的蛋白上样缓冲液，使最终浓度为 1X。沸水浴5min，分装，储存于-20℃备用。

3.10.2蛋白免疫印迹与曝光

按照配胶试剂盒制备10％和7.5％的聚丙烯酰胺分离胶和5％的聚丙烯酰胺上层浓缩胶。将制备好的凝胶放入电泳槽中加入电泳缓冲液后点样。根据各蛋白在伏隔核中的丰度，调整上样体积使样品浓度适中，每个样本槽加入蛋白样本体积约为10μl。然后使用60V电压压缩蛋白样本至分离胶界限处，待条带跑过分离界限后增加电压至80V，直至目的蛋白完全分离。随后进行转膜，将载有目的蛋白的凝胶从玻璃板上转移至带有滤纸“三明治”结构的转膜夹中，并将经过甲醇活化的PVDF膜盖在胶上，转膜电压设定为100V，转膜时间则根据蛋白分子量大小设定。转膜完成后，用TBST缓冲液配制5％的脱脂牛奶封闭液，将条带浸泡在封闭液中摇床室温封闭1小时。随后用上述封闭液将蛋白一抗按需要的比例稀释，杂交带封闭条带于一抗中，4℃过夜，第二天在37℃摇床上摇1h，再用TBST洗膜三次，每次10min。根据一抗种属来源选择相应二抗，按照1:5000稀释二抗，37℃孵育1h，结束后TBST缓冲液洗膜五次，每次10min，然后TBS缓冲液洗膜一次，10min。曝光时，按照1:1的比例配制发光A液和发光B液，避光条件下将载有目的蛋白的 PVDF膜置于发光混合液中反应1min，取出PVDF膜，用滤纸吸干多余发光液。将PVDF膜放入凝胶成像系统中曝光。数据处理：将曝光得到的图片用 Clinx Image Analysis系统读取各条带的灰度值，用Tubulin条带灰度值作为内参进行标准化比较。

3.11靶向检测葡萄糖神经酰胺(Glucosylceramide，GlcCer)类鞘脂

GCS是GlcCer类鞘脂的合成酶，抑制GCS的活性，则会导致其下游合成产物GlcCer类鞘脂含量降低。通过检测GlcCer类鞘脂含量可反映GCS的活性。

3.11.1标准曲线样品制备

将5mg Glucosylceramide(C18:1/16:0)，5mg Glucosylceramide(C18:1/18:0)，5mg Glucosylceramide(C18:1/24:1)分别加入氯仿：甲醇＝1:4(v/v)5ml,配制成1mg/ml的储备液。再将三个标准品分别配制为表8浓度体系，制备标准曲线。

表8 标准样本的制备

3.11.2鞘脂提取

组织或细胞样本在4℃解冻，2.5mg组织中加入萃取液(异丙醇：水：乙酸乙酯＝3:1:6(v/v/v)，同时加入适当浓度的内标，超声直至无可见颗粒，涡旋10min，离心，4℃，6000g，10min；取上清转移至新的EP管中，为SolventI；剩余下层重新提取，加入2ml异丙醇：水：乙酸乙酯＝3:1:6(v/v/v)，涡旋 10min，6000g离心10min；取上清转移至新的EP管中，为SolventII。将两次萃取得到的SolventI和SolventII混合均匀转移至同一EP管中，用温和的氮气流吹干。吹干的脂质用200μl流动相B(含1mM甲酸铵和0.2％甲酸甲醇溶液)复溶，若复溶不完全，可使用超声涡旋混匀直至完全溶解。离心，4℃， 13000g，10min。进样1μl，进行UPLC-MS/MS分离检测，用于靶向检测GlcCer 类鞘脂。

3.11.3色谱条件和质谱条件

根据文献，采用ACQUITY UPLC I-Class(Waters)高效液相色谱仪，流动相A相：0.2％甲酸，2.0mM甲酸铵水溶液；流动相B相：0.2％甲酸，1.0mM 甲酸铵甲醇溶液；流速：0.5ml/min；色谱柱：Spectra C18 Column(Waters)；柱温：55℃；进样体积：1μl。梯度条件如表9。

表9 流动相条件

质谱条件如下：扫描模式为正离子。Capillary:3kV；Sample Cone：30； SourceTemperature：140℃；Desolvation Temperature：350℃；Cone Gas Flow：50L/Hr；Desolvation Gas Flow：800L/Hr；扫描范围：50kDa-1200kDa。具体 UPLC-MRM扫描模式见表10。

表10 正离子MRM扫描条件

3.11.4数据分析

使用MassLynx软件插件Quanlynx分析计算浓度。根据链长相似和丰度相似的GlcCer类鞘脂用同一个标准品的标准曲线拟合，即C16:0，C18:1， C20:0，C20:1用C16:0标准曲线拟合，C18:0，C22:0，C26:0，C26:1用C18:0 标准曲线拟合；C22:1，C24:0和C24:1用C24:1标准曲线拟合。拟合得到的结果以均数±标准差表示，两组之间的比较用t检验分析法，四组之间的比较用单因素ANOVA分析，p<0.05表示有统计学差异。

4实验结果

4.1可卡因诱导的行为敏化和条件性位置偏爱模型建立

本实验通过连续七天腹腔注射20mg/kg可卡因(图4A、B)，检测小鼠的运动距离。结果显示，从给药第一天开始，可卡因组小鼠运动距离显著高于生理盐水组，并在第三天运动距离趋于稳定，说明行为敏化模型建立成功 (图4C、D)。

4.2GCS在行为敏化和条件性位置偏爱行为中的表达

为了进一步确认GCS在可卡因诱导的成瘾行为作用，本试验使用 Western Blot技术检测GCS翻译后蛋白水平的变化。结果显示，与生理盐水组相比，在行为敏化和条件性位置偏爱奖赏效应中，GCS蛋白水平显著升高，约升高1.2倍左右(图5)。

4.3多次注射可卡因增加伏隔核脑区GCS表达

多次可卡因给药诱导的神经突触可塑性脑区包括前额叶皮质(Prefrontalcortex)、伏隔核(Nuclear accumbens)、纹状体(Striatum)和海马(Hippocampus)。为了研究多次给予可卡因对各脑区GCS表达的影响，连续7天同一时间点腹腔注射20mg/kg浓度可卡因，在最后一次给药半小时后，脱颈处死小鼠，取出前额叶皮质、伏隔核、纹状体和海马四个脑区，利用Western blot检测GCS 在以上四个脑区的表达。其中，伏隔核(nucleusaccumbens，NAcc)也被称为依伏神经核，是一组波纹体中的神经元，被认为是大脑的快乐中枢，对诸如食物、性、毒品等刺激有反应。

结果显示，小鼠腹腔给予可卡因后，与生理盐水组相比，伏隔核脑区GCS 表达显著上升(p<0.05)，但是前额叶皮质、纹状体以及海马脑区GCS蛋白水平并未显著变化(图6)。因此，结果表明多次可卡因注射可以特异性增加伏隔核GCS蛋白表达。

4.4可卡因诱导的伏隔核GCS表达增加随时间延长增强

为探究GCS蛋白表达随可卡因给药时间延长产生的变化，本实验设置5 个时间点，分别连续给予可卡因1天、2天、3天、5天、7天，在最后一次注射可卡因半小时后，取材得到伏隔核脑区，通过Western blot对伏隔核GCS 进行检测。

结果显示，与生理盐水组相比，可卡因连续腹腔给药的第1、2天没有明显变化，从第三天开始，可卡因诱导的小鼠伏隔核脑区GCS表达显著增加，且连续给药5天、7天均稳定表达(图7)。以上结果表明可卡因诱导的伏隔核GCS表达增加随可卡因给药时间延长而增加，且在给药三天后表达趋于稳定，呈现出明显的时间依赖性。

4.5伏隔核中食物诱导的条件性位置偏爱模型中GCS无显著变化

为了研究GCS是否由可卡因药物诱导引起的变化，本实验使用食物诱导小鼠的条件性位置偏爱建立模型，每次训练前给食物组小鼠进食1h，对照组则不进食，待训练结束后，所有小鼠均给予饲料1h。

结果发现，与对照组相比，食物组小鼠的行为偏爱发生明显的逆转。但是，通过Western Blot检测GCS蛋白的表达，结果发现与对照组相比，食物组并未发生显著改变(图8)。

由4.2～4.6的结果可知，可卡因可特异性地刺激GCS在伏隔核的表达，而与可卡因同样能刺激伏隔核而带来快乐的食物，却无法刺激GCS在伏隔核内的表达。表明GCS与可卡因刺激相关，抑制GCS的活性有望减弱可卡因成瘾。

4.6抑制GCS酶活性显著减弱可卡因诱导的行为敏化效应

为了深入探究GCS在可卡因诱导的行为敏化效应中的作用，本实验使用 GCS酶特异性小分子抑制剂——Eliglustat，它可以有效的抑制GCS酶活性，降低GlcCer水平。为了检测Eliglustat是否能改变可卡因诱导的行为学效应，在可卡因给药(20mg/kg，腹腔内注射)前15min伏隔核脑区定点给予葡萄糖神经酰胺合成酶抑制剂Eliglustat(1μl，Intra-NAc)，连续给药七天，每天检测小鼠运动距离(图9A)。通过查阅文献，我们将Eliglustat分别配成5μM， 20μM，100μM，设置为低、中、高剂量组。结果表明，高剂量组100μM Eliglustat能够减弱小鼠的行为敏化效应，低、中剂量对小鼠行为敏化效应无显著改变 (图9B)。因此，本试验使用浓度为100μM Eliglustat来抑制小鼠诱导的行为敏化效应。

结果显示，与溶剂－生理盐水组相比，溶剂－可卡因组行为敏化效应显著增强；而每天在可卡因注射给药前15min伏隔核定点给予Eliglustat后，小鼠的行为敏化效应显著减弱(图9C)。

为了研究在伏隔核定点给予Eliglustat后，GlcCer类鞘脂含量是否发生改变，本实验使用UPLC-MS/MS靶向检测GlcCer类鞘脂水平。

结果显示，与溶剂－生理盐水组相比，链长为C22:1，C24:1在溶剂－可卡因组水平显著升高，每天提前15min伏隔核定点给予Eliglustat可以降低 GlcCer含量(图10)。

以上两个实验结果表明：GCS和GlcCer类鞘脂参与可卡因诱导的小鼠行为敏化，通过降低GCS酶活性，降低GlcCer含量，从而降低可卡因诱导的行为敏化效应。

4.7抑制GCS酶活性显著减弱可卡因诱导的条件性位置偏爱行为效应

为了研究GCS在可卡因诱导的条件性位置偏爱行为效应中的作用，本实验使用GCS酶特异性小分子抑制剂——Eliglustat，来检测Eliglustat能否影响可卡因诱导的奖赏效应。每天小鼠CPP训练前15min，在伏隔核脑区定点给予葡萄糖神经酰胺合成酶抑制剂Eliglustat(1μl，Intra-NAc)，连续给药六天，经过六天的CPP训练后，在第七天检测小鼠的行为偏爱是否发生改变(图 11A)。根据文献，我们将Eliglustat分别配成1μM，10μM，50μM，设置为低、中、高剂量组。结果表明，高剂量组50μM Eliglustat能够减弱可卡因引起的奖赏效应，低、中剂量对小鼠条件性位置偏爱模型可卡因诱导的奖赏效应无明显作用(图11B)。因此，本实验采用浓度为50μM Eliglustat来抑制小鼠诱导的条件性位置偏爱行为效应。

结果显示，与溶剂－生理盐水组相比，溶剂－可卡因组条件性位置偏爱效应显著增强；而每天小鼠CPP训练前15min伏隔核定点给予Eliglustat后，小鼠的条件性位置偏爱效应显著减弱(图11C)。同时，本实验使用 UPLC-MS/MS靶向检测GlcCer类鞘脂水平。

结果显示，与溶剂－生理盐水组相比，链长为22:0，22:1，24:0，24:1 的中长链GlcCer类鞘脂水平显著升高，每天提前15min伏隔核定点给予 Eliglustat能降低可卡因诱导的GlcCer类鞘脂含量增加(图12)。

以上两个实验结果表明：GCS和GlcCer类鞘脂参与可卡因诱导的小鼠行为敏化，通过降低GCS酶活性，降低GlcCer类鞘脂含量，从而降低可卡因诱导的条件性位置偏爱效应。

4.8抑制GCS酶活性显著减弱可卡因诱导的自主给药行为效应

为了研究GCS在可卡因诱导的自主给药行为效应中的作用，本实验使用 GCS酶特异性小分子抑制剂——Eliglustat，来检测Eliglustat能否影响可卡因诱导的小鼠自主给药行为。每天小鼠训练自主给药前15min，在伏隔核脑区定点给予葡萄糖神经酰胺合成酶抑制剂Eliglustat(1μl，Intra-NAc)，连续给药7天，每天记录小鼠的有效鼻触和给药次数。本实验使用浓度为100μM Eliglustat来抑制小鼠诱导的自主给药行为效应。

结果显示，与溶剂生理盐水组相比，溶剂可卡因组有效鼻触显著增强；而每天在可卡因注射给药前15min伏隔核定点给予Eliglustat后，小鼠的有效鼻触显著减少(图13A)。同时，通过有效鼻触引起的给药次数结果显示，与溶剂生理盐水组相比，溶剂可卡因组从第三天开始给药次数显著增强，并呈现逐渐减弱的趋势；而每天在可卡因注射给药前15min伏隔核定点给予 Eliglustat后，小鼠的给药次数显著减少(图13B)。

结果表明：GCS抑制剂Eliglustat可抑制小鼠诱导的自主给药行为效应。

4.9抑制GCS酶活性显著减少树突分支数和树突棘密度

研究表明，服用可卡因有能在数小时内改变大脑构造，表现为树突分支数与树突棘密度增加，是吸毒成瘾的第一步。

为了研究GCS是否可以调控可卡因诱导的突触可塑性变化，本实验使用高尔基染色技术，在伏隔核脑内定点给予抑制剂Eliglustat后观察小鼠突触形态。

结果发现，与生理盐水溶剂组相比，可卡因溶剂组的树突分支数和树突棘密度显著增多；在伏隔核定点给予GCS特异性抑制剂后，树突分支数和树突棘密度显著减少(图14)。

结果表明：GCS抑制剂Eliglustat能显著减少树突分支数和树突棘密度，降低可卡因成瘾。

5结论

本发明通过建立小鼠行为学模型(行为敏化、条件性位置偏好、自主给药)来检测可卡因诱导的小鼠行为学效应，发现可卡因可以明显诱导小鼠伏隔核脑区GCS表达上调。通过伏隔核定点注射GCS抑制剂，可以抑制可卡因诱导的行为敏化、条件性位置偏爱以及自主给药行为学效应。

综上，GCS抑制剂能够有效弱化可卡因诱导的行为学效应，将其用于制备治疗可卡因成瘾的药物，临床应用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

<120> GCS抑制剂在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途

<130> GY159-2020P0110143CC

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagagacacc agggagcttg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtggctgatg catttcatgt 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctattggcaa cgagcggttc cgatg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atctgctgga aggtggacag tgagg 25