达格列净及其类似物在制备防治雄性生殖功能障碍的药物中的用途
阅读说明：本技术 达格列净及其类似物在制备防治雄性生殖功能障碍的药物中的用途 (Application of dapagliflozin and analogues thereof in preparation of medicines for preventing and treating male reproductive dysfunction ) 是由 魏蕊 金滋润 张哲� 杨进 魏天娇 洪天配 姜辉 杨宇卓 于 2021-12-13 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药技术领域。具体涉及SGLT2抑制剂在制备防治雄性生殖功能障碍的药物中的用途。本发明的研究结果表明,达格列净治疗能够增加db/db小鼠的睾丸重量及睾丸/体重比,以及能够显著改善db/db小鼠精子质量异常、精子数量异常和精子运动异常。本发明首次将SGLT2抑制剂用于预防或治疗雄性生殖功能障碍,并取得较为理想的治疗效果,为临床应用治疗雄性不育,特别是由糖尿病或高血糖导致的雄性不育,提供了一种新的预防和治疗选择,具有极高的应用价值和社会效益。(The invention belongs to the technical field of biological medicines. In particular to application of an SGLT2 inhibitor in preparing a medicament for preventing and treating male reproductive dysfunction. The research result of the invention shows that the treatment of dapagliflozin can increase the testis weight and the testis/body weight ratio of a db/db mouse and can obviously improve the abnormal sperm quality, the abnormal sperm quantity and the abnormal sperm movement of the db/db mouse. The SGLT2 inhibitor is used for preventing or treating male reproductive dysfunction for the first time, obtains a relatively ideal treatment effect, provides a new prevention and treatment selection for clinical application and treatment of male sterility, particularly male sterility caused by diabetes or hyperglycemia, and has extremely high application value and social benefit.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。具体涉及SGLT2抑制剂（特别是达格列净及其类似物）在制备防治雄性生殖功能障碍的药物中的用途。
背景技术
近年来随着环境污染加重、生育年龄的推迟，男性不育的发病率呈逐年上升趋势。不孕不育发生率升高最直接的后果就是生育率的降低，这将进一步加速我国进入老龄化社会的进程，特别是第七次全国人口普查发现国内人口生育力逐渐下降，这给国民经济的可持续发展带来严峻的挑战。不孕不育的发生与许多因素有关，个体差异较大，致病因素复杂，为疾病的研究和治疗带来了难题。男性不育的发病与环境、遗传、生活习惯、内分泌疾病等多种因素相关。病理变化主要包括精子发生和成熟障碍，在临床中一般表现为少精子症、弱精子症、畸形精子症和无精子症，精子发生、成熟异常导致的少弱精子症占男性不育的一半以上。少弱精子症的致病机理复杂，人群异质性强，缺乏有效针对性的治疗措施。因此，深入探索精子发生障碍的致病机制研究，开发有效预防或治疗与精子发生障碍相关的疾病的药物，对于提高我国人口素质和生命质量、支持“健康中国”建设具有重大战略研究意义。
糖尿病是临床上最常见的影响男性生育力的代谢性疾病之一，近年来糖尿病发病有低龄化趋势，流行病学调查显示截止2014年全球糖尿病患者约有4.2亿人，因此受糖尿病影响的育龄期男性人数众多，特别是儿童和青少年糖尿病患者人数逐年增加。男性生殖系统是糖尿病较为常见的严重并发症之一，糖尿病患者睾丸生理结构及功能均受到严重损伤，雄激素低下，精子数量、活力、畸形率和精子DNA完整性都会发生不同程度的损伤，然而糖尿病导致精子发生异常的致病机理尚无完全阐明。目前针对糖尿病导致的男性生育力下降主要为抗氧化对症治疗、传统中医药的经验治疗和辅助生殖技术，部分患者的治疗效果不佳，且尚缺乏针对性的预防和治疗方案。鉴于在世界范围内糖尿病患者人群的数量十分庞大，因而目前在临床上急需探索糖尿病性睾丸生精功能障碍和男性不育的分子机制，以及开发有效预防或治疗糖尿病导致的男性生殖功能障碍的药物。
钠葡萄糖共转运蛋白2（Sodium-glucose cotransporter 2, SGLT2）抑制剂是一类新型的降糖药物，可以通过抑制肾脏近端小管葡萄糖的重吸收进而发挥降糖作用。SGLT-2选择性抑制剂作为降糖药新靶点由于其特异性分布在肾脏，对其他组织、器官无显著影响；胰岛素抵抗的糖尿病患者仍可受益；且具有不易发生低血糖风险、不增加糖尿病患者体重等优势。目前全球共有6种SGLT2抑制剂上市，分别为：Canagliflozin(卡格列净)、Dapagliflozin(达格列净)、Empagliflozin(恩格列净)、Ipragliflozin(依格列净)、Luseogliflozin(鲁格列净)以及Tofogliflozin(托格列净)。近些年来，大规模的心血管结局研究显示，包括达格列净在内的多种SGLT2抑制剂能够显著改善2型糖尿病患者的心血管和肾脏结局[N Engl J Med, 2017, 377(7):644-657.] [N Engl J Med, 2019, 380(24):2295-2306.] [N Engl J Med 2019, 380(19): 1881-1882.]。因此，这类药物已成为2型糖尿病合并心血管疾病和糖尿病肾病患者的首选用药。但是，这类药物对生殖功能的作用目前尚无报道。
发明内容
为了解决临床上能够有效用于预防或治疗雄性生殖功能障碍的药物严重不足的问题，本发明人首次发现SGLT2抑制剂对于雄性不育动物模型具有治疗作用，为男性生殖功能障碍提供了一种新的预防和治疗选择。
具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
本发明提供了SGLT2抑制剂在制备防治雄性生殖功能障碍的药物中的用途。
优选地，所述SGLT2抑制剂选自以下的一种或多种：达格列净、恩格列净、依格列净、鲁格列净或托格列净。
更优选地，所述SGLT2抑制剂是达格列净。
在一个实施方式中，所述雄性生殖功能障碍是精子发生障碍。
在一个优选实施方式中，所述雄性生殖功能障碍是精子质量异常、精子数量异常和/或精子运动异常。
在另一个优选实施方式中，所述雄性生殖功能障碍是无精症、少精症、弱精症和/或精子畸形症。
在又一个优选实施方式中，所述雄性生殖功能障碍是由糖尿病或高血糖导致的。
进一步地，所述雄性指雄性哺乳动物。
优选地，所述哺乳动物选自以下：小鼠、大鼠、家兔、猫、犬或灵长类。
更优选地，所述哺乳动物选自人。
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
本发明首次将SGLT2抑制剂（特别是达格列净及其类似物）用于预防或治疗雄性生殖功能障碍，并取得较为理想的治疗效果，为临床应用治疗雄性不育（特别是由糖尿病或高血糖导致的雄性不育）提供了一种新的预防和治疗选择，具有极高的应用价值和社会效益。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1：小鼠体重及血糖水平变化结果。
图2：小鼠大体及睾丸重量比。
图3：小鼠睾丸组织HE染色结果。
图4：小鼠睾丸组织生殖细胞标志物鉴定结果。
图5：小鼠精子密度和存活率检测结果。
图6：小鼠精子运动指标检测结果。
图7：小鼠精子运动内在参数检测结果。
图8：小鼠睾丸组织TUNEL染色结果。
图9：小鼠睾丸组织中凋亡相关蛋白表达结果。
图10：小鼠睾丸组织中凋亡相关蛋白表达结果。
图11：小鼠睾丸组织中氧化应激水平结果。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例：
1.实验方法：
经典的2型糖尿病小鼠：瘦素受体双敲除小鼠(db/db小鼠，购自江苏集萃药康生物科技有限公司)，选取8周龄小鼠，适应性喂养1周后，检测小鼠随机血糖≥16.7mmol/L即纳入本实验。将小鼠随机分为两组：糖尿病组和干预组，分别给予达格列净（Dapa，1 mg/kg体重/天）和水（同等体积），灌胃，一天一次，干预5周。另选取同窝野生型小鼠做正常对照。每组9-10只。测定干预前后小鼠的空腹体重、随机体重、空腹血糖和随机血糖
瘦素受体缺失模型小鼠(db/db)的典型特征包括高瘦素血症、肥胖、高血糖、高胰岛素、血清中泌乳素的降低和垂体中泌乳素的升高等代谢紊乱以及典型的不育[Science.1966 Sep 2;153(3740):1127-1128]。瘦素或其受体发生突变的人类也表现为肥胖和不育[Endocrine reviews. 2006; 27: 710–718]。2型糖尿病经典动物模型db/db小鼠在雄性生殖系统损伤表现出与糖尿病男性患者极为相似的病理表型，包括生精功能异常和性功能障碍，是研究男性不育和性功能障碍最常用的模型之一[Biochemical and BiophysicalResearch Communications, 2017; 485: 686-692；Diabetologia 2020 09;63(9)]。因此我们选择这种典型的2型糖尿病小鼠作为雄性睾丸组织损伤的模型进行研究。
动物实验严格遵循北京大学动物实验管理规定，经北京大学动物实验伦理委员会审核。
在给药完成后的第二天进行取材和后续实验。
（1）组织留取：小鼠称重、睾丸组织称重。留取新鲜附睾。一侧睾丸组织行多聚甲醛固定、常规酒精脱水和石蜡包埋切片；另一侧睾丸组织直接提取蛋白或行液氮冻存。
（2）检测对睾丸组织生精小管形态学的影响：睾丸组织的石蜡切片，进行常规组织形态学染色（苏木精-伊红染色法）观察各组小鼠睾丸组织生精小管形态学变化，如生精小管排列、管腔形状、各级生精细胞的排列及多少等。采用免疫荧光方法，检测DAZL(精原细胞)、SYCP3(精母细胞)、TNP1(精子细胞)、PGK2(精子)、SOX9(支持细胞)等生殖细胞标志蛋白表达。
（3）测定对精液质量的影响：新鲜附睾，采用扩散法收集附睾精子并利用计算机辅助精液分析系统（北京伟力新世纪科技发展有限公司，型号：WLJY-9000）检测小鼠的精子数目、精子存活率；快速前向运动及前向运动；直线速度、曲线速度、平均路径速度、线性、头部侧摆位移、及直线性。
（4）明确对氧化应激和凋亡的影响：睾丸组织的石蜡切片，行一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光）检测各组小鼠睾丸组织石蜡切片中，细胞凋亡的情况。新鲜或液氮冻存的睾丸组织，提取蛋白后，采用Western blot检测凋亡标志物（包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白）的表达，总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS快速法）、总SOD活性检测试剂盒（NBT法）、谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒（NADPH法）、过氧化氢及脂质氧化（MDA）检测试剂盒等分别检测总抗氧化能力；SOD及谷胱甘肽过氧化物酶活性、过氧化氢和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量，Western blot的方法检测4-HNE(4-Hydroxynonenal, 4-羟基壬烯醛)的蛋白表达。
（5）所有实验数据均采用GraphPad Prism 7.0统计软件进行数据分析和作图。实验数据以均数±标准误(mean±SEM)表示。多组间数据的差异比较应用方差分析并进行Holm-Sidak后检验，以P <0.05表示差异有统计学意义。* 代表P <0.05；**代表P <0.01；***代表P <0.001。
2.实验结果：
2.1 小鼠体重及血糖水平变化
首先，检测了同窝野生型小鼠(wild type/WT小鼠)、瘦素受体双敲除小鼠(db/db小鼠)以及db/db给予达格列净治疗（Dapa）小鼠在治疗前以及治疗结束时的空腹体重和随机体重，结果发现（见图1）：与WT小鼠相比较，db/db小鼠以及Dapa小鼠的体重都明显增加；接下来检测了各组小鼠的血糖，结果发现（见图1）：在治疗开始时，与WT小鼠相比较，db/db小鼠以及Dapa小鼠的空腹血糖和随机血糖都明显升高；而在治疗结束时，与WT小鼠相比较，db/db小鼠的空腹血糖和随机血糖明显升高，Dapa治疗则可以明显降低db/db小鼠的空腹血糖和随机血糖。
2.2 小鼠大体及睾丸重量比
检测了治疗结束时各组小鼠的体重、睾丸重量及睾丸/体重比。结果发现（见图2）：与WT小鼠相比较，db/db小鼠以及Dapa小鼠的体重都明显增加；db/db小鼠的睾丸重量及睾丸/体重比明显降低，Dapa治疗则可以明显增加db/db小鼠的睾丸重量及睾丸/体重比。
2.3 小鼠睾丸组织HE染色结果
对各组小鼠的睾丸组织进行苏木精-伊红(HE)染色，结果发现（见图3）：WT小鼠的生精小管中各级生精细胞排列整齐，管腔中可见大量成熟精子；而db/db小鼠的生精小管中只有少量各级生精细胞，且排列紊乱，管腔中几乎不可见成熟精子；Dapa治疗后的db/db小鼠的生精小管中各级生精细胞重新出现，且排列也较为规则，同时管腔中也可见少量精子的存在。
2.4 小鼠睾丸组织生殖细胞标志物鉴定结果
通过免疫荧光的方法检测各组小鼠睾丸组织中各级生精细胞标志蛋白的表达。结果发现（见图4）：与HE结果类似，与WT小鼠相比较，db/db小鼠生精小管中生精细胞标志物（DAZL/SYCP3）、精子细胞标志物(TNP1)、精子标志物（PGK2）以及支持细胞标志物（sox9）都明显减少；而Dapa治疗后，这些标志物都明显增加。
2.5 小鼠精子质量结果
通过计算机辅助精液分析的方法检测各组小鼠的精液质量，结果发现（见图5）：与WT小鼠相比较，db/db小鼠的精子密度明显降低，而Dapa治疗的db/db小鼠精子密度则显著增加；类似的，发现db/db小鼠的精子存活率明显降低，而Dapa治疗小鼠精子密度则有增加的趋势。
同时，如图6所示，db/db小鼠精子的快速前向运动及前向运动明显降低，而Dapa治疗小鼠精子的快速前向运动及前向运动明显增加。
如图7所示，db/db小鼠精子的内在运动指标包括直线运动速度（VSL）、曲线运动速度（VCL）、平均路径速度（VAP）、线性（LIN）及直精子头部侧摆位移（ALH）都明显降低，而Dapa治疗可以改善除了线性（LIN）以外的精子内在运动指标，无论单纯db/db还是Dapa治疗对小鼠精子的直线性都没有影响。
2.6 小鼠睾丸组织检测结果
通过TUNEL染色检测各组小鼠睾丸组织中细胞凋亡的情况，结果发现（见图8）：db/db小鼠睾丸组织中细胞凋亡明显增加，而Dapa治疗的db/db小鼠睾丸组织中细胞凋亡则显著下降。
通过Western blot的方法检测小鼠睾丸组织中影响细胞凋亡的两条典型通路中相关蛋白表达的变化。结果发现（见图9）：db/db小鼠睾丸组织中抗凋亡蛋白Bcl2表达显著减少，而凋亡蛋白BAX蛋白表达则有增加趋势；同时，Dapa治疗的db/db小鼠睾丸组织中抗凋亡蛋白Bcl2表达有增加的趋势。Bcl2/BAX的蛋白表达在db/db小鼠睾丸组织中显著降低，而在Dapa治疗的db/db小鼠睾丸组织中则明显上调。
在另外一条细胞凋亡通路中，结果发现（见图10）：db/db小鼠睾丸组织中抗凋亡蛋白XIAP表达显著减少，而凋亡蛋白caspase8蛋白表达有增加趋势，caspase9蛋白表达明显增加，同时，Dapa治疗的db/db小鼠睾丸组织中抗凋亡蛋白XIAP表达明显上调。XIAP/caspase3的蛋白表达在db/db小鼠睾丸组织中有降低的趋势，而在Dapa治疗的db/db小鼠睾丸组织中则明显上调；XIAP/caspase8的蛋白表达在db/db小鼠睾丸组织中显著降低，而在Dapa治疗的db/db小鼠睾丸组织中则明显上调；XIAP/caspase9的蛋白表达在db/db小鼠睾丸组织中显著降低，而在Dapa治疗的db/db小鼠睾丸组织中则明显上调。
最后，通过试剂盒的方法检测了各组小鼠睾丸组织中氧化应激水平的变化，结果发现（见图11）：db/db小鼠睾丸组织中总抗氧化能力显著降低，抗氧化应激酶超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力明显降低，而氧化应激产物十二羟基壬戊醛（4-HNE）的蛋白表达则显著增加；同时，Dapa治疗的db/db小鼠睾丸组织中总抗氧化能力有增加的趋势，抗氧化应激酶SOD活力明显上调，GSH-Px活力有增加的趋势，而氧化应激产物4-HNE的蛋白表达则显著减少。
3.实验结论
达格列净治疗能够增加db/db小鼠的睾丸重量及睾丸/体重比，以及能够显著改善db/db小鼠精子质量异常、精子数量异常和精子运动异常。
综上所述，本发明首次将SGLT2抑制剂用于预防或治疗雄性生殖功能障碍，并取得较为理想的治疗效果，为临床应用治疗雄性不育，特别是由糖尿病或高血糖导致的雄性不育，提供了一种新的预防和治疗选择，具有极高的应用价值和社会效益。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
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