一种氧空位三氧化钼纳米颗粒的制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种氧空位三氧化钼纳米颗粒的制备方法及应用 (Preparation method and application of oxygen vacancy molybdenum trioxide nanoparticles ) 是由 文玲 段广新 魏竹馨 曾剑峰 高明远 于 2021-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种氧空位三氧化钼纳米颗粒的制备方法及应用,包括S1)将包含功能团-COOH和/或-SH的聚合物溶于纯水中,制得溶液一；S2)将钼源溶于乙醇中,制得溶液二；S3)将溶液二加入溶液一种,在氮气保护下加热至沸腾,溶液颜色变为深蓝色；S4)将S3反应后产物冷却,去除未反应的原料,即制得纯化的氧化钼纳米颗粒分散液；S5)将氧化钼纳米颗粒分散液冷冻干燥,得到固体,即为氧空位三氧化钼纳米颗粒。本发明氧空位三氧化钼纳米颗粒一方面具有良好的自由基清除性能,另一方面具有强效的抗菌性能与生物安全性,通过使用氧化钼纳米材料,可以有效降低糖尿病创面的过氧化环境,减少创面区域细菌数量,进而促进血管生成,有效的加速糖尿病创面的愈合。(The invention discloses a preparation method and application of oxygen vacancy molybdenum trioxide nano particles, comprising S1) dissolving a polymer containing functional groups-COOH and/or-SH in pure water to prepare a solution I; s2) dissolving a molybdenum source in ethanol to prepare a solution II; s3) adding the solution II into the solution I, heating to boil under the protection of nitrogen, and changing the color of the solution into dark blue; s4) cooling the product obtained after the reaction of S3, and removing unreacted raw materials to obtain purified molybdenum oxide nanoparticle dispersion liquid; s5) carrying out freeze drying on the molybdenum oxide nano-particle dispersion liquid to obtain a solid, namely the oxygen vacancy molybdenum trioxide nano-particles. The oxygen vacancy molybdenum trioxide nano-particles have good free radical scavenging performance on one hand, and have strong antibacterial performance and biological safety on the other hand, and by using the molybdenum oxide nano-material, the peroxidation environment of a diabetic wound can be effectively reduced, the bacterial number in the wound area is reduced, so that angiogenesis is promoted, and the healing of the diabetic wound is effectively accelerated.)
技术领域
本发明涉及三氧化钼加工技术领域，尤其涉及一种氧空位三氧化钼纳米颗粒的制备方法及应用。
背景技术
糖尿病是当前最常见的代谢性疾病，糖尿病溃疡是糖尿病最常见的并发症之一，主要存在于患者足部或腿部，表现为不易愈合的慢性创面，具有发病率高，病程长等特点，给患者造成巨大的身心痛苦与经济负担。更可怕的是，糖尿病溃疡如不能得到有效的治疗，有导致截肢的风险，数据表明，糖尿病溃疡是非创伤性截肢最主要的诱因。
糖尿病溃疡区域恶劣的创面过氧化微环境是其难以愈合的主要原因。有研究报道，溃疡创面区域有大量以中性粒细胞为主的免疫细胞，这些细胞可产生过量的活性氧(ROS)。过量的ROS一方面会损伤上皮细胞，阻碍创面的愈合；另一方面会抑制血管新生，影响创面区域的氧气和营养，进而导致溃疡区域的进一步恶化。此外，过量的ROS还会诱发巨噬细胞剧烈的炎症反应，诱导大量的炎症因子释放，使愈合区域极易破溃，进一步影响糖尿病溃疡的恢复。同时，糖尿病溃疡创面区域长期开放，且具有较高的糖含量，为病原微生物的定植创造了良好的条件，因此，糖尿病溃疡区域容易出现细菌感染。感染发生不仅会增强溃疡区域的炎症反应，干扰血管新生与上皮细胞增殖，还会进一步增加创面区域ROS的产生，进而形成：过量ROS产生-血管新生与上皮细胞增殖被抑制-长期开放创面-细菌感染-更多ROS产生的恶性循环。
目前，临床上主要采用手术清创，联合抗生素抗感染以治疗糖尿病创面。该疗法虽然能在一定程度上延缓病情的恶化，但是并不能有效的促进糖尿病溃疡创面的恢复。此外，由于慢性创面长期使用抗生素治疗，可能导致病原菌耐药性的增加，从而进一步加大糖尿病溃疡治疗的难度。近年来有研究证实，针对糖尿病溃疡创面施以有效的ROS清除，联合强效的杀菌，可显著促进创面的愈合。然而，在这些探索性研究中，使用的都是将各种具有单一功能的原料简单的复合到一起，而形成的复杂的复合物。这些复合物除成分复杂外，制备过程也相对繁琐，成为大规模生产与临床推广的瓶颈问题。因此，具备良好抗氧化能力与杀菌活性的糖尿病创面治疗药物，同时兼具成分简单，制备方便的优势，可有效突破药物在量产与推广上的瓶颈，具有巨大的市场潜力。然而，目前具备以上性质的药物尚未有报道。
近年来随着纳米技术的快速发展，涌现出大量多种功能的纳米材料，为能源储备、疾病精准诊疗等重大科学问题的解决提供新的参考与思路。基于此，本发明旨在设计对糖尿病创面具有良好治疗效果、成分简单、制备方便的氧空位氧化钼纳米颗粒的合成方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氧空位三氧化钼纳米颗粒的制备方法及应用，以解决上述背景技术中所提出的问题。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种氧空位三氧化钼纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤，S1)将包含功能团-COOH和/或-SH的聚乙烯酸或季戊四醇-四(3-巯基丙酸酯)-聚甲基丙烯酸聚合物溶于纯水中，制得0.1-1%的水溶液一；S2)将钼源溶于乙醇中，制得Mo含量为0.1-0.5 M的溶液二，钼源可选用MoCl5；S3)将1-2 mL溶液二加入45-55mL溶液一中，在氮气保护下加热至沸腾，溶液颜色变为深蓝色；S4)将S3反应后产物冷却，去除未反应的原料，即制得纯化的氧化钼纳米颗粒分散液；S5)将氧化钼纳米颗粒分散液冷冻干燥，得到固体，即为氧空位三氧化钼纳米颗粒。
然后使用X射线电子能谱仪对该纳米颗粒固体样品进行分析，通过对得到的谱图进行分析，结果显示该氧化钼中同时存在五价与六价钼，是一种氧空位的MoO3-X的组成。
作为进一步的优化，S1中的溶解条件为溶液在氮气保护下加热至冷凝回流。
作为进一步的优化，S3中加热时间为1-3h。
作为进一步的优化，S4中反应后产物冷却至20-25℃，使用超滤管超滤去除未反应的原料。
作为进一步的优化，S4中氧化钼纳米颗粒分散液中氧化钼纳米颗粒的粒径为3.1±0.5 nm。
一种氧空位三氧化钼纳米颗粒，用于促进糖尿病细菌感染创面恢复，通过使用氧化钼纳米材料，可以有效降低糖尿病创面的过氧化环境，减少创面区域细菌数量，进而促进血管生成，有效的加速糖尿病创面的愈合。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：氧空位三氧化钼纳米颗粒一方面具有良好的自由基清除性能，另一方面具有强效的抗菌性能与生物安全性，同时其成分单一，制备简单。
本发明将氧空位三氧化钼纳米颗粒通过喷涂的方式对细菌感染的糖尿病创面进行治疗，该材料通过杀菌+抗氧化，改善创面微环境，有效加速糖尿病创面的恢复。
说明书附图
图1a为本发明氧空位三氧化钼纳米颗粒的透射电镜图片。
图1b为本发明氧空位三氧化钼纳米颗粒粒径分布图片。
图2为发明氧空位三氧化钼纳米颗粒的X射线电子能谱图。
图3a为本发明氧空位三氧化钼纳米颗粒清除羟自由基(·OH)测试图。
图3b为本发氧空位三氧化钼纳米颗粒清除超氧阴离子(·O2 －)测试图。
图3c为本发明氧空位三氧化钼纳米颗粒清除过氧化氢(H2O2)测试图。
图4a为使用超敏DCFH-DA探针检测不同浓度三氧化钼清除H2O2在HUVEC细胞中诱导的ROS测试图。
图4b为CCK-8检测不同浓度三氧化钼对H2O2诱导HUVEC细胞氧化损伤的保护作用数据对比图。
图5a为通过集落形成(CFU)实验测试不同浓度三氧化钼纳米颗粒对大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S. aureus)和甲氧西林耐药的金黄葡萄球菌(MRSA)的抗菌性能测试图。
图5b为CFU实验的统计图。
图6a为经不同治疗后MRSA感染的糖尿病创面愈合过程图片。
图6b为MRSA感染的糖尿病创面愈合统计图。
图6c为MRSA感染的糖尿病创面组织切片苏木精-伊红染色图。
图6d为MRSA感染的糖尿病创面组织切片Masson染色图。
图6e为MRSA感染的糖尿病创面组织切片吉姆萨染色图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
一种氧空位三氧化钼纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤，S1)将包含功能团-COOH聚乙烯酸聚合物溶于纯水中制备0.3%的水溶液，制得溶液一；S2)将MoCl5钼源溶于乙醇中浓度为0.34 M，制得溶液二；S3)将1 mL溶液二加入45 mL溶液一种，在氮气保护下加热至沸腾，溶液颜色变为深蓝色；S4)将S3反应后产物冷却，去除未反应的原料，即制得纯化的氧化钼纳米颗粒分散液；S5)将氧化钼纳米颗粒分散液冷冻干燥，得到固体，即为氧空位三氧化钼纳米颗粒。本发明制备的氧空位三氧化钼纳米颗粒的数据如图1a、图1b和图2所示。
如图3a至图3c所示，对氧空位三氧化钼纳米颗粒清除自由基的性能测试：(1)氧空位三氧化钼纳米颗粒对·OH的清除性能检测：使用芬顿反应诱导·OH的产生，使用DMPO为·OH捕获剂，通过电子自旋共振仪(ESR)，检测·OH信号。向1.5 mL离心管中依次加入水、Fe2+ (终浓度50 μM)、DMPO (终浓度25 μM)、三氧化钼纳米颗粒和H2O2 (终浓度50 μM)制备反应液，总体积为50 μL。在反应开始后5分钟(从H2O2的加入开始计时)，将反应液吸至内径为0.9 mm的毛细管中，使用20 mW微波功率和1G场调制的参数，检测ESR光谱。
(2)氧空位三氧化钼纳米颗粒对·O2 －的清除性能检测：使用黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应生成·O2 －，在DMPO捕获剂的帮助下，通过ESR检测·O2 －信号。向1.5 mL的离心管中分别加入水、黄嘌呤(终浓度1 μM)、PBS、三氧化钼纳米颗粒、DMPO(终浓度25 μM)和黄嘌呤氧化酶(终浓度1 U)，总体积为50 μL，反应3min后，将反应液体吸至毛细管中，然后检测ESR谱。
(3)氧空位三氧化钼纳米颗粒对H2O2的清除能力检测：使用H2O2检测试剂盒评价氧化钼纳米客气清除H2O2的能力。将不同浓度的氧化钼纳米颗粒与H2O2 (100 μM)孵育3 h，取50 μL混合液，加入100 μL配制好的工作液，37℃孵育30 min后，用酶标仪收集样品560 nm处的吸光度，分析氧化钼纳米颗粒清除H2O2的活性。
通过以上实例发现，随着三氧化钼纳米颗粒浓度增加，检测到的·OH和·O2 －信号逐渐减小，且随着三氧化钼纳米颗粒加入量的增加，H2O2浓度逐渐降低，说明本发明制备的三氧化钼纳米颗粒对·OH、·O2 －和H2O2几种常见的ROS都具有浓度依赖的清除效果。
如图4a和4b所示，氧空位三氧化钼清除细胞中自由基保护细胞性能检测：将人源脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)以5×104细胞/孔的浓度接种于24孔板中，并在培养箱中培养24 h；将ROS检测的超敏DCFH-DA探针稀释至工作浓度，加至24孔板中，孵育细胞30 min；随后，弃去DCFH-DA探针，并用PBS溶液清洗染色细胞两次；使用含有H2O2的培养基处理细胞1h；然后弃去含有H2O2的培养基，并加入含有0，50，100，200 μg/mL三氧化钼纳米颗粒的培养基，处理细胞1 h；弃去含有三氧化钼材料的培养基，PBS清洗细胞两次后，向24孔板中分别加入新鲜培养基，最后使用荧光显微镜(485 nm激发，525 nm发射)观察细胞ROS产生。将HUVEC细胞以5×103个细胞/孔的浓度接种于96孔板中，在培养箱中培养过夜；待细胞贴壁后，分别对细胞进行H2O2、H2O2+50 μg/mL三氧化钼纳米颗粒、H2O2+100 μg/mL三氧化钼纳米颗粒和H2O2+200 μg/mL三氧化钼纳米颗粒处理24 h；随后，弃去培养基，PBS清洗细胞两次后，每孔细胞分别加入含有10% CCK-8的新鲜培养基；细胞置于培养箱中继续培养2 h，最后使用酶标仪检测细胞每孔细胞450 nm吸光度，通过计算细胞存活率，分析三氧化钼清除细胞中自由基，保护细胞的性能。
该实例发现，三氧化钼纳米颗粒可以显著的减少H2O2诱导的细胞中的ROS产生，并有效的降低H2O2诱导HUVEC的氧化损伤，加入200 μg/mL三氧化钼纳米颗粒，细胞存活率提高至79.6%，显著高于不加三氧化钼组的47.6%。
如图5a和5b所示，氧空位三氧化钼纳米颗粒体外抗菌性能测试：选择大E. coli(ATCC 2922)、S. aureus (ATCC 25923)和MRSA作为革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和耐药细菌模型的代表，以评估三氧化钼纳米颗粒的抗菌活性。将冻存的菌液加到液体LB培养基中，37℃，250 rpm震荡培养过夜；吸取1 mL过夜培养的菌液，加至9 mL新鲜液体LB培养基中，37℃，震荡培养3 h，细菌处于指数生长期；离心收集指数生长期菌液，使用0.9%的生理盐水清洗，分散菌体；将三氧化钼纳米颗粒至0、25、50、100、200μg/mL，然后与稀释后的菌液混合，37℃，250 rpm震荡培养2 h；随后，将混合液稀释至合适的浓度，取100 μL，均匀涂布与固体LB培养板中，将培养板置于生化培养箱中，37℃，培养过夜，通过计数细菌集落数，分析三氧化钼纳米颗粒抗菌活性。
该实例发现，三氧化钼纳米颗粒对E. coli、S. aureus和MRSA均具有良好的抗菌效果。当三氧化钼浓度达到100 μg/mL时，抗菌效果可达100%。
如图6a至图6e所示，氧空位三氧化钼纳米颗粒对耐药菌感染的糖尿病创面愈合的疗效测试：(1)选取8周龄雄性BALB/c小鼠，按照50 mg/kg的剂量，通过腹腔给小鼠注射链脲菌素，每天一次，连续给药五天；(2)停药五天后使用通过血糖试纸检测小鼠血糖，血糖值大于等于13.6 mmol/L的小鼠为高血糖小鼠；(3)将高血糖小鼠背部被毛处理后，腹腔注射麻醉药物麻醉处理；(4)使用灭菌剪刀在糖尿病小鼠被毛区域制备直径为5 mm的原型创面，将MRSA菌液滴至创面区域，制备MRSA感染的糖尿病创面。(5)将MRSA感染创面的小鼠随机分为四组：PBS组(对照组)、普通抗生素组(头孢硫脒，10 μg/只/次)、万古霉素(10 μg/只/次)组和三氧化钼(100 μg/只/次)组。各组药物每天给药两次，连续给药3天进行治疗，通过观察创面尺寸与病理切片分析创面恢复情况。该实例说明三氧化钼促进MRSA感染糖尿病创面的恢复，效果优于头孢硫脒和万古霉素。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
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