拉沙洛菌素和盐霉素单链抗体和双特异性单链抗体及其应用
阅读说明：本技术 拉沙洛菌素和盐霉素单链抗体和双特异性单链抗体及其应用 (Lasacosin and salinomycin single-chain antibody and bispecific single-chain antibody and application thereof ) 是由 李建成 马月姣 陈莹娴 黄婧洁 李苗 于 2021-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了拉沙洛菌素和盐霉素单链抗体和双特异性单链抗体及其应用。该双特异性单链抗体含有名称为LAS-VH的LAS重链可变区、名称为SAL-VH的SAL重链可变区、名称为LAS-VL的LAS轻链可变区和名称为SAL-VL的SAL轻链可变区,所述LAS-VH、SAL-VH、LAS-VL和SAL-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成。该双特异性单链抗体可用于检测盐霉素和拉沙洛菌素残留。(The invention discloses a single-chain antibody and a bispecific single-chain antibody of lasalomycin and salinomycin and application thereof. The bispecific single chain antibody comprises a LAS heavy chain variable region named as LAS-VH, an SAL heavy chain variable region named as SAL-VH, a LAS light chain variable region named as LAS-VL and an SAL light chain variable region named as SAL-VL, wherein the LAS-VH, the SAL-VH, the LAS-VL and the SAL-VL are all composed of determinant complementary regions and framework regions; the determinant complementarity region is composed of CDR1, CDR2 and CDR 3. The bispecific single chain antibody can be used for detecting salinomycin and lasalomycin residues.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及拉沙洛菌素和盐霉素单链抗体和双特异性单链抗体及其应用。
背景技术
拉沙洛菌素(Lasalocid，LAS)属双价聚醚离子载体抗生素，其化学结构式如图1所示，除用于防治鸡球虫病外，还可用于防治火鸡、羔羊和犊牛球虫病。其抗球虫机理为捕获或释放双价阳离子，影响虫体离子平衡，造成虫体破裂死亡，拉沙洛菌素对球虫子孢子以及第1代、第2代无性周期的子孢子、裂殖子均有明显抑杀作用。盐霉素(Salinomycin，SAL)为一元羧酸聚醚类动物专用抗生素，其化学结构式如图2所示，对大多数革兰氏阳性菌和各种球虫有较强的抑制和杀灭作用，用于猪可防治腹泻、促生长、提高成活率，主要用于家禽防球虫。由于两种药物具有用量小且广谱高效、耐药性低和促进生长等优点，被广泛用作饲料添加剂来预防和治疗家禽的球虫病，但二者也有潜在的毒性作用，安全范围较窄，且与泰妙菌素、四环素类和磺胺类的某些抗生素还存在配伍禁忌。因此LAS和SAL在使用时，既要注意其本身的毒性作用和配伍禁忌，还要极度关注二者的残留问题。我国已批准的动物性食品中拉沙洛菌素最高残留限量为：牛肝脏0.7μg/mL、鸡脂肪1.2μg/mL、鸡和火鸡肝脏0.4μg/mL、火鸡脂肪0.4μg/mL、羊肝脏1μg/mL、兔肝脏0.7μg/mL；盐霉素最高残留限量为：鸡肉0.6μg/mL、鸡脂肪1.2μg/mL、鸡肝脏1.8μg/mL。
目前拉沙洛菌素和盐霉素残留检测方法众多，使用最成熟最普遍的残留分析方法仍然是仪器方法，但是，兽药残留仪器分析这一检测方法本身存在一定的制约条件，比如成本昂贵的仪器、前处理方法要求较高且耗时费力、样品处理量较少等，因此新颖的兽药残留快速检测技术的开发也迫在眉睫，免疫试剂盒和试纸条等已成为快速检测的重点方向。
发明内容
本发明的目的之一在于提供拉沙洛菌素和盐霉素的双特异性单链抗体或其抗原结合部分。
本发明提供了拉沙洛菌素和盐霉素的双特异性单链抗体或其抗原结合部分，所述双特异性单链抗体或其抗原结合部分含有名称为LAS-VH的LAS重链可变区、名称为SAL-VH的SAL重链可变区、名称为LAS-VL的LAS轻链可变区和名称为SAL-VL的SAL轻链可变区，所述LAS-VH、SAL-VH、LAS-VL和SAL-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述LAS-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第25位-第34位所示；
所述LAS-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第50位-第58位所示；
所述LAS-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第95位-第108位所示；
所述SAL-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第274位-第282位所示；
所述SAL-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第299位-第308位所示；
所述SAL-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第345位-第358位所示；
所述LAS-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第401位-第413位所示；
所述LAS-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第429位-第433位所示；
所述LAS-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第468位-第478位所示；
所述SAL-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第151位-第158位所示；
所述SAL-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第174位-第178位所示；
所述SAL-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第213位-第223位所示。
可选地，根据上述的双特异性单链抗体或其抗原结合部分，所述LAS-VH的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第1位-第118位所示；所述LAS-VL的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第376位-第489位所示；所述SAL-VH的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第250位-第368位所示；所述SAL-VL的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第126位-第234位所示。
可选地，根据上述的双特异性单链抗体或其抗原结合部分，所述双特异性单链抗体或其抗原结合部分的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
上述双特异性单链抗体基因可采用重叠链式反应(SOE-PCR)进行合成。从能够分泌SAL抗体和LAS抗体的杂交瘤细胞中提取RNA，通过反转录和扩增得到抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因，采用三次SOE-PCR即可得到能够同时识别SAL和LAS的双特异性单链抗体基因。第一次是将SAL的重链可变区基因和LAS的轻链可变区基因进行杂交，得到VH(SAL)-Linker A-VL(LAS)杂交链，第二次是将SAL的轻链可变区基因和LAS的重链可变区基因杂交，得到VH(LAS)-LinkerA-VL(SAL)杂交链，第三次是将两条杂交链进行连接，得到VH(LAS)-Linker A-VL(SAL)-Linker B-VH(SAL)-Linker A-VL(LAS)的双特异性单链抗体基因(ScDb基因)。将ScDb基因插入到质粒当中，再导入到感受态细胞中进行表达，不需要采用动物实验即可得到大量的ScDb。
本发明还提供了与上述的双特异性单链抗体或其抗原结合部分相关的生物材料，所述生物材料为如下任一种：
B1)编码上述的双特异性单链抗体或其抗原结合部分的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。
可选地，根据上述的生物材料，B1)所述核酸分子为编码上述的双特异性单链抗体或其抗原结合部分的基因，所述基因为如下A)或B)所述的DNA分子：
A)所述LAS-VH的CDR1的编码基因序列如SEQ ID No.3中第73位-第102位所示；所述LAS-VH的CDR2的编码基因序列如SEQ ID No.3中第148位-第174位所示；所述LAS-VH的CDR3的编码基因序列如SEQ ID No.3中第283位-第324位所示；所述SAL-VH的CDR1的编码基因序列如SEQ ID No.3中第820位-第846位所示；所述SAL-VH的CDR2的编码基因序列如SEQID No.3中第895位-第924位所示；所述SAL-VH的CDR3的编码基因序列如SEQ ID No.3中第1033位-第1074位所示；所述LAS-VL的CDR1的编码基因序列如SEQ ID No.3中第451位-第474位所示；所述LAS-VL的CDR2的编码基因序列如SEQ ID No.3中第520位-第534位所示；所述LAS-VL的CDR3的编码基因序列如SEQ ID No.3中第637位-第669位所示；所述SAL-VL的CDR1的编码基因序列如SEQ ID No.3中第1201位-第1239位所示；所述SAL-VL的CDR2的编码基因序列如SEQ ID No.3中第1285位-第1299位所示；所述SAL-VL的CDR3的编码基因序列如SEQ ID No.3中第1402位-第1434位所示；
B)与A)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述双特异性单链抗体或其抗原结合部分的DNA。
上文中，同一性是指序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。
所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
B1)所述核酸分子的核苷酸序列具体可为SEQ ID No.3所示。
上述重组载体可为实施例制备的重组质粒ScDb-pJB33重组质粒。上述重组微生物可为实施例制备的菌株RV308-ScDb。
本发明还提供了拉沙洛菌素单链抗体或其抗原结合部分或其生物材料，拉沙洛菌素单链抗体或其抗原结合部分含有名称为LAS-VH的LAS重链可变区、和名称为LAS-VL的LAS轻链可变区，所述LAS-VH和LAS-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述LAS-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.5中第154位-第163位所示；所述LAS-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.5中第179位-第187位所示；所述LAS-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.5中第224位-第237位所示，所述LAS-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.5中第26位-第38位所示；所述LAS-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQID No.5中第54位-第58位所示；所述LAS-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.5中第93位-第103位所示。拉沙洛菌素单链抗体的氨基酸序列例如可为SEQ ID No.5所示。
所述生物材料为如下任一种：
C1)编码所述拉沙洛菌素单链抗体或其抗原结合部分的核酸分子，例如其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；
C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；
C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；
C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物。
上述重组载体例如为实施例所制备的LAS-ScFv-pJB33重组质粒。上述重组微生物例如为实施例所制备的菌株RV308-LAS-ScFv。
本发明还提供了盐霉素单链抗体或其抗原结合部分或其生物材料，盐霉素单链抗体或其抗原结合部分含有名称为SAL-VH的SAL重链可变区、和名称为SAL-VL的SAL轻链可变区，所述SAL-VH和SAL-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述SAL-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.6中第149位-第157位所示；所述SAL-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.6中第174位-第183位所示；所述SAL-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.6中第220位-第233位所示，所述SAL-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.6中第26位-第33位所示；所述SAL-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNo.6中第49位-第53位所示；所述SAL-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.6中第88位-第98位所示。盐霉素单链抗体的氨基酸序列例如为SEQ ID No.6所示。
所述生物材料为如下任一种：
D1)编码所述拉盐霉素单链抗体或其抗原结合部分的核酸分子，其核苷酸序列例如为SEQ ID No.2所示；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体；
D4)含有D2)所述表达盒的重组载体；
D5)含有D1)所述核酸分子的重组微生物；
D6)含有D2)所述表达盒的重组微生物；
D7)含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D8)含有D4)所述重组载体的重组微生物。
上述重组载体例如为实施例所制备的SAL-ScFv-pJB33重组质粒。上述重组微生物例如为实施例所制备的菌株RV308-SAL-ScFv。
本发明还提供了用于检测拉沙洛菌素和/或盐霉素的产品，包括上述的拉沙洛菌素和盐霉素的双特异性单链抗体或其抗原结合部分、上述的拉沙洛菌素单链抗体或其抗原结合部分或上述的盐霉素单链抗体或其抗原结合部分。
上述的拉沙洛菌素和盐霉素的双特异性单链抗体或其抗原结合部分、上述的生物材料、上述的拉沙洛菌素单链抗体或其抗原结合部分或其生物材料、或上述的盐霉素单链抗体或其抗原结合部分或其生物材料的应用也属于本发明的保护范围之内。所述应用为在制备检测拉沙洛菌素和/或盐霉素的产品或检测拉沙洛菌素和/或盐霉素中的应用。
本文中，所述产品可为试剂盒。
本发明提供了一种上述单链抗体或双特异性单链抗体的制备方法，包括将单链抗体基因或双特异性单链抗体基因通过双酶切连接到质粒载体上，通过电转化的方式将质粒载体转入到大肠杆菌感受态细胞中，优化诱导剂浓度和诱导时间使单链抗体或双特异性单链抗体大量表达。采用超声裂解法破碎细胞壁，从而得到大量的单链抗体或双特异性单链抗体。最后采用不同浓度梯度的咪唑在镍柱中纯化抗体。
本发明提供的双特异性单链抗体可用于检测盐霉素和拉沙洛菌素残留。该检测方法可包括将待检测样品经过提取和脱脂，制成浓缩后的待检样品，采用双特异性单链抗体通过间接竞争ELISA检测浓缩后的待检样品。本发明制备的双特异性单链抗体制备简便，可大量表达，并能够实现两种药物的检测，该检测方法的灵敏度高，稳定性好。
附图说明
图1为拉沙洛菌素的化学结构式。
图2为盐霉素的化学结构式。
图3为实施例1单链抗体基因构建路线示意图。
图4为实施例3制备的标准曲线。
图5为实施例6基质加标标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
大肠杆菌RV308和pJB33质粒载体均为本实验室保存(记载于Wen K，G，Schillberg S，et al.Improved fluoroquinolone detection in ELISA throughengineering of a broad-specific single-chain variable fragment bindingsimultaneously to 20 fluoroquinolones[J].Analytical and bioanalyticalchemistry，2012，403(9)：2771-2783.)
下述实施例使用的试剂具体如下。
(1)2×Fast Pfu mix：北京全式金生物科技有限公司/AS221-01
(2)2×YT液体培养基：
胰蛋白胨 17g
酵母提取物 10g
NaCl 5g
加蒸馏水定容至1000mL，经高温灭菌后储存于37℃恒温箱
(3)LB固体培养基：取3g细菌琼脂粉加入到200mL的LB液体培养，高温灭菌后储存于37℃恒温箱。
(4)LB液体培养基：
胰蛋白胨 10g
酵母提取物 5g
NaCl 10g
用蒸馏水定容至1000mL，高温灭菌20min。
(5)Binding buffer：
50mM NaH2PO4·H2O 6.90g
300mMNaCl 17.54g
10mM咪唑 0.68g
用超纯水定容至1000mL后，用1M NaOH调pH至8.0。
(6)拉沙洛菌素包被原：北京维德维康生物技术公司
(7)盐霉素包被原：北京维德维康生物技术公司
(8)洗液(20X)：
加超纯水定容至1000mL。
(9)LAS标准品：美国sigma公司/73996
(10)SAL标准品：美国sigma公司/S4526
(11)抗His标签抗体：北京全式金生物科技有限公司
(12)HRP标记的羊抗鼠IgG：北京全式金生物科技有限公司
(13)限制性内切酶Sfi I：美国NEB公司
实施例1、单链抗体基因片段的拼接
1、单链抗体VH和VL基因序列的确定
(1)将能够分泌SAL抗体的杂交瘤细胞和LAS抗体的杂交瘤细胞分别复苏培养，连续传代两次，取细胞培养液进行抗体亚型鉴定，SAL和LAS抗体的重链均为IgG1型，轻链均为Kappa型。
(2)提取步骤(1)培养的细胞总RNA，并反转录为cDNA，将cDNA连接一段已知的单链DNA序列(AS Linker，序列如表2中所示)，得到cDNA-AS Linker。
(3)根据抗体分型结果，以cDNA-AS Linker为模板，采用相对应的引物分别扩增抗体的重链和轻链，抗体的重链所使用的引物为AS-F和IgG1-R，抗体的轻链所使用的引物为AS-F和Kappa-R。
(4)将步骤(3)扩增到的抗体重链和轻链进行1％琼脂糖凝胶确定，并将胶回收，得到回收产物。
(5)步骤(4)回收后的抗体重链和轻链分别连接到质粒中，将质粒转入到大肠杆菌感受态细胞中进行TA克隆。挑选白色单菌落进行测序。将测序结果用基因翻译工具和abYsis分析，得到SAL和LAS抗体的重链可变区和轻链可变区的基因序列。
2、抗体VH和VL基因片段的拼接
单链抗体基因(ScFv基因)构建路线示意图如图3所示，采用SOE PCR将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过Linker连接得到ScFv基因。
第一轮SOE-PCR：将上述测序正确的菌液扩大培养后提取质粒，将质粒提取液作为模板，进行PCR扩增，其中，扩增SAL抗体的重链可变区(SLA-VH)采用的引物为SAL-VH-F1和SAL-VH-R1，扩增SAL抗体的轻链可变区(SAL-VL)采用的引物为SAL-VL-F1和SAL-VL-R1，扩增LAS抗体的重链可变区(LAS-VH)采用的引物为LAS-VH-F1和LAS-VH-R1，扩增LAS抗体的轻链可变区(LAS-VL)采用的引物为LAS-VL-F1和LAS-VL-R1。其PCR反应体系如下：
涡旋混匀后点甩离心，PCR反应条件：95℃5min；95℃1min，55℃50s，72℃1min；30个循环；72℃10min。经1％琼脂糖凝胶电泳后，进行切胶回收。
第二轮和第三轮SOE-PCR的PCR反应体系和PCR反应条件和第一轮SOE-PCR相同。不同之处在于以后每一轮的反应模板是上一轮PCR扩增反应的回收产物，VL扩增两次，VH扩增三次，第三轮VH扩增以第二轮VH扩增的回收产物为模板，引物采用表1中的引物。
表1 SOE-PCR反应所需要的引物
纯化回收第二轮的VH和VL的PCR产物。以LAS-VH-R3和LAS-VL-F2作为引物，将LAS-VH和LAS-VL连接得到完整的LAS-ScFv基因片段。以SAL-VH-R3和SAL-VL-F2作为引物，将SAL-VH和SAL-VL连接得到完整的SAL-ScFv基因片段。反应体系如下：
PCR反应条件同第一轮SOE-PCR反应条件。反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收完整的scFv基因片段。
LAS-scFv基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其中，第1-341位为VL序列，第342-387位为Linker序列，第388-741位为VH序列，第76-114为LAS-VL的CDR1序列，第159-174为LAS-VL的CDR2序列，第276-309为LAS-VL的CDR3序列，第459-489为LAS-VH的CDR1序列，第534-561为LAS-VH的CDR2序列，第669-711为LAS-VH的CDR3序列。
SAL-scFv基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其中，第1-326位为VL序列，第327-372位为Linker序列，第373-729位为VH序列，第75-99为SAL-VL的CDR1序列，第144-159为SAL-VL的CDR2序列，第261-294为SAL-VL的CDR3序列，第444-471为SAL-VH的CDR1序列，第519-549为SAL-VH的CDR2序列，第657-699为SAL-VH的CDR3序列。
实施例2、甘油法制备RV308感受态细胞
向冻存的大肠杆菌RV308细胞中加入500μL的2×YT液体培养基，37℃200rpm振荡培养2h，使菌种复苏。菌种复苏后，蘸取微量菌液在LB固体培养基上倒置培养至菌落大小均一，弥漫分布于平板；挑取单一的菌落接种于2mL的LB液体培养基中进行短暂的复苏培养，随后在200mL的LB液体培养基中对其进行扩大培养，直至OD600约0.6左右；所需溶液和试剂均需置于冰浴中，至少30min，包括无菌水、10％甘油、菌落培养液，把200mL培养液均分，装于50mL离心管中，经4℃3000rpm离心15min后，弃去上清液，保留下层沉淀；用10mL冰浴无菌水将重悬菌体后，冰浴水补足40mL，再次以同样转速离心20min，弃去上清液，保留沉淀；加入10％冰浴甘油30mL洗涤沉淀，离心后弃去上清液获得RV308感受态细胞；加入10％冰浴甘油1.5mL，分装，每管100μL，-70℃快速冷冻保存。
实施例3、单链抗体的转化与表达
1、ScFv-pJB33重组质粒的电击转化
将上述实施例1得到的LAS-ScFv基因片段和SAL-ScFv基因片段分别通过双酶切连接到pJB33质粒载体上，得到ScFv-pJB33重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶回收。LAS-ScFv-pJB33重组质粒是在将pJB33质粒载体的pelB和(His)6tag识别位点之间插入的片段(小片段)替换为上述LAS-ScFv基因片段，保持pJB33质粒载体的其它核苷酸序列不变的载体。SAL-ScFv-pJB33重组质粒是在将pJB33质粒载体的pelB和(His)6tag识别位点之间的片段(小片段)替换为上述SAL-ScFv基因片段，保持pJB33质粒载体的其它核苷酸序列不变的载体。
将回收产物(ScFv-pJB33重组质粒)分别电击转化至实施例2制备的RV308感受态细胞中，具体操作如下：
提前紫外照射电转杯半小时，小心将透析膜置于去离子水液面，取ScFv-pJB33重组质粒20μL滴至透析膜上，整个透析过程要在冰浴条件下至少30min；从-80℃取出一管100μL感受态细胞RV308，待其恰好解冻时加入透析产物，轻微晃动试管使其混匀；转移至干燥电转杯中，装入电转仪中，在2250v、25uF、150Ω的条件下，电转5ms；电转结束后，将电转产物全部吸取至含有900μL的2×YT液体培养基的试管中，在37℃温度下振荡培养1h；取100μL上述培养液，在2×YT琼脂平板上(含氯霉素34μg/mL)均匀涂布于，37℃倒置培养12h。
阳性筛选：
对上述平板中白色菌落，挑单扩大培养，在含CAP的2×YT液体培养基中进行，37℃温度下振荡培养至OD值约0.6左右，以pJB33 F和pJB33 R为上下游引物，进行菌液PCR反应，鉴定阳性菌落，反应体系如下：
PCR反应条件同实施例1。反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性菌落，取1.5mL阳性菌液送Biomed公司测序。测序正确的菌落保种，-80℃保存。
菌株RV308-LAS-ScFv表达LAS-ScFv基因片段，表达产物为单链抗体LAS-ScFv，单链抗体LAS-ScFv的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，第1-114位为VL序列，第115-129位为Linker序列，第130-247位为VH序列，第26-38为LAS-VL的CDR1序列，第54-58为LAS-VL的CDR2序列，第93-103为LAS-VL的CDR3序列，第154-163为LAS-VH的CDR1序列，第179-187为LAS-VH的CDR2序列，第224-237为LAS-VH的CDR3序列。
菌株RV308-SAL-ScFv表达SAL-ScFv基因片段，表达产物为单链抗体SAL-ScFv，单链抗体SAL-ScFv的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，第1-109位为VL序列，第110-124位为Linker序列，第125-243位为VH序列，第26-33为LAS-VL的CDR1序列，第49-53为LAS-VL的CDR2序列，第88-98为LAS-VL的CDR3序列，第149-157为LAS-VH的CDR1序列，第174-183为LAS-VH的CDR2序列，第220-233为LAS-VH的CDR3序列。
2、ScFv的表达和纯化
(1)大量诱导表达时，挑取上述测序正确的菌落，在100mL含氯霉素(34μg/mL)的2×YT液体培养基中进行培养。经过37℃振荡培养过夜(16h)后取20mL培养液接种至4L2×YT液体培养基(含氯霉素34μg/mL)中扩大培养。扩大培养至OD600约0.6～0.8时，添加诱导剂IPTG至0.1mM，然后在16℃下诱导，振荡培养过夜。第二天收集菌液，将收集的菌液在4℃下10000rpm离心10min，收集菌体。高压后的PBS经冰浴冷却后，洗涤菌体，离心后菌体可稳定的储存于-80℃，以便进行后续试验。
在ScFv基因片段(LAS-ScFv基因片段或SAL-ScFv基因片段)表达时，诱导条件对其可溶性表达和包涵体十分重要。在诱导温度16℃，IPTG浓度为0.1mM条件下过夜(16h)表达。采用超声裂解仪使大量诱导表达的菌体细胞壁破碎，得到细胞表达产物。取合适体积的Binding buffer将菌体重悬，超声破碎仪在200W功率下，冰浴超声，使细胞壁破裂(超声3s，停2s)，得到质地均一的细胞悬液，将其在4℃下10000rpm离心20min，转移上清液至新的离心管中，此上清液即为ScFv提取液。
(2)表达后的ScFv蛋白带有6×His标签，可以与镍柱结合，经高浓度咪唑洗脱从而达到纯化的目的。首先根据蛋白表达量，用合适体积的Ni-NTA填充纯化柱，约1h左右，Ni-NTA填充均匀，接着用超纯水洗涤镍柱，再用合适体积的Binding buffer(10mM咪唑)平衡柱子。
(3)用0.45μm滤膜过滤ScFv提取液，与镍填料混匀后4℃晃动结合2h，缓慢过柱，收集穿流液。
(4)全部上样液流出后，用Washing buffer(50mM咪唑)洗涤柱子，除去黏附在柱子上的杂蛋白，洗涤的同时用Bradford测定蛋白浓度，直到无蛋白流出为止。
(5)最后用Elutionbuffer(300mM咪唑)洗脱结合在柱子上的目的蛋白，收集洗脱液，洗脱的同时用Bradford测定蛋白浓度，直到无蛋白流出为止。
(6)洗脱蛋白用PBS透析48h，每12h更换一次PBS，收集目的蛋白(即纯化后的蛋白)，储存时加入等体积的甘油保护蛋白不变性，置于-20℃。
(7)镍柱再生：用10倍柱体积的超纯水洗涤，然后用20％乙醇封存置于4℃。
使用蛋白电泳结合Western-blotting的方法鉴定目的蛋白，并对目的蛋白的纯度作出分析。
ScFvs的SDS-PAGE鉴定：
配置所需凝胶和溶液，清洗电泳槽和玻璃板，固定玻璃板后开始灌胶，灌胶时先快后慢，防止气泡出现。等胶块彻底凝固后，垂直方向小心拔出齿梳，即形成加样孔；取纯化后的ScFv 100℃加热变性样品20μL；加入电泳液至没过玻璃板，确定无漏液后准备上样，加样结束后连接电源开始电泳，首先是低电压约80V电泳，约30min后样品已电泳至分离胶时，调整电压至120V，约1h电泳结束后关闭电源；小心取出玻璃板，撬开玻璃板取出胶块，将其浸泡在0.25％的考马斯亮蓝染色液中进行振荡染色2h，若染色不均匀，可适当延长染色时间；染色结束后，取出胶块，用蒸馏水清洗掉染色液，然后将其放入脱色液中浸泡，进行扩散脱色，脱色时要随时更换脱色液，直至使蛋白条带清晰。
ScFvs的Western-blotting鉴定：
(1)蛋白条带清晰可见时，切去胶孔和浓缩胶后将分离胶浸泡在转移缓冲液中，剪同等大小的PVDF膜和6张滤纸，也浸泡在转移缓冲液中，使其充分湿润；按照从负极到正极，顺序依次为纤维素垫、滤纸、胶、膜、滤纸、纤维素垫，进行放置。每一步都要随时赶走气泡，气泡会影响电转。
(2)放置好之后将转膜夹子固定在电泳槽中，安装完成后在110V电压下转移2h，整个转膜过程须在并与条件下进行，且要随时加冰以降温，转移结束后取膜。
(3)将膜正面朝上，在1×PBST溶液中晃动洗膜3次，每次洗10min。转移至5％脱脂奶中，室温晃动2h。
(4)封闭完全后取出膜，用1×PBST缓冲液洗涤，洗膜3次，每次洗10min。
(5)加入抗His抗体(用PBST以1：5000稀释)，室温晃动结合约1h。接着洗膜，同第(4)步。
(6)加入HRP标记的羊抗鼠IgG(用PBST以1∶8000稀释)，室温晃动结合1h。弃去液体后，洗膜，同第(4)步。
(7)NC膜的正面朝上滴加显色液，避光显色后，在凝胶成像仪中，设定不同的曝光时间成像，保存清晰明亮的图片。
鉴定标准：实验结果出现的特异性蛋白条带大小与目的蛋白大小相符，且目的条带附近的杂带较少，即证明纯化后的蛋白代表为目的蛋白。
鉴定结果表明，RV308-LAS-ScFv大量诱导表达LAS-ScFv基因片段，纯化产物后获得单链抗体LAS-ScFv；RV308-SAL-ScFv大量诱导表达SAL-ScFv基因片段，纯化产物后获得单链抗体SAL-ScFv。
采用BCA试剂盒测定上述制备的纯化后的蛋白中单链抗体浓度，其中，单链抗体LAS-ScFv在纯化后的蛋白中的浓度为1.5mg/mL，单链抗体SAL-ScFv在纯化后的蛋白中的浓度为2.0mg/mL。
ScFvs的icELISA检测：
(1)包被：将拉沙洛菌素包被原和盐霉素包被原用PBS稀释1000倍，分别向96孔板中加入，每孔100μL，37℃温箱避光孵育2h。
(2)洗涤：甩出孔内液体，每孔270μL洗液，洗3次，甩出孔内液体后，拍干。
(3)封闭：每孔150μL的5％脱脂牛奶进行封闭，37℃温箱避光孵育2h，甩出孔内液体后，拍干。
(4)加样：每孔分别加入50μL用PBS梯度稀释浓度为0ng/mL，0.1ng/mL，0.3ng/mL，0.9ng/mL，2.7ng/mL，8.1ng/mL的的LAS或SAL标准品和按1∶1000稀释的上述纯化后的蛋白，37℃温箱避光孵育30min，洗涤同(2)。
(5)加His抗体：1∶3000稀释的抗His标签抗体，每孔50μL，37℃温箱避光孵育30min，洗涤同(2)。
(6)加二抗：每孔加入50μL的HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶3000稀释)，孵育30min，洗涤同(2)。
(7)显色：加入现用现配的显色液，每孔100μL，37℃温箱避光显色15min。
(8)终止：每孔加入50μL终止液，酶标仪中读取各孔OD450值。
(9)建立标准曲线：以标准品梯度浓度对应的OD450值为纵坐标，标准品浓度的对数为横坐标，经过Origin 8.5软件的处理，得到标准曲线，最终得到纯化后的蛋白IC50值和交叉反应率(CR)。
采用单链抗体LAS-ScFv制备的标准曲线如图4左侧图所示，IC50为12.9ng/mL，线性范围为6.9-24.0ng/mL。采用单链抗体SAL-ScFv制备的标准曲线如图4右侧图所示，IC50为8.6ng/mL，线性范围为4.7-16.0ng/mL。分别对如表2所示的8种常用聚醚类抗生素进行了icELISA试验，计算两种单链抗体对8中聚醚类药物的交叉反应率，从而来评价重组抗体的特异性。结果如表2所示，LAS-ScFv对7种常用聚醚类抗生素的交叉反应率均小于0.5％，无交叉反应，只能用于检测药物LAS，特异性良好；SAL-ScFv对甲基盐霉素的交叉反应率高达89％，这可能是由于盐霉素和甲基盐霉素分子只相差一个甲基基团，结构十分相似，导致抗原结合位点基本相同，对其余6种常用聚醚类抗生素的交叉反应率均小于0.5％。
表2 scFvs灵敏度和特异性
ScFvs的icELISA检测表明，上述纯化的单链抗体LAS-ScFv可用于检测LAS，上述纯化的单链抗体SAL-ScFc可用于检测SAL。
实施例4、双特异性单链抗体完整基因的拼接
(1)将实施例3获得的RV308-LAS-ScFv和RV308-SAL-ScFv的阳性菌液在37℃、200rpm条件下扩大培养过夜，对其培养液提取LAS-ScFv-pJB33重组质粒和SAL-ScFv-pJB33重组质粒作为VH和VL的扩增模板进行分别扩增。以LAS-ScFv-pJB33重组质粒为模板，采用引物P1，P2进行扩增获得LAS-VH。以LAS-ScFv-pJB33重组质粒为模板，采用引物P3，P4进行扩增获得LAS-VL。以SAL-ScFv-pJB33重组质粒为模板，采用引物P5，P6进行扩增获得SAL-VH。以SAL-ScFv-pJB33重组质粒为模板，采用引物P7，P8进行扩增获得SAL-VL。反应体系如下：
尽量保持在低温下加入该反应体系，轻微振荡混匀后点甩离心，进行PCR扩增反应，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃1min，55℃50s，72℃1min；30个循环；72℃延伸10min。经过凝胶电泳鉴定后，进行切胶回收。
(2)对步骤(1)纯化回收后的VH和VL产物进行进一步扩增，反应体系如下：
PCR反应条件同上。
(3)以步骤(2)PCR产物为模板，扩增两条杂交的ScFv基因片段。以LAS-VH和SAL-VL为模板，以P1和P9为引物扩增，获得VH(LAS)-LinkerA-VL(SAL)杂交链。以LAS-VL和SAL-VH为模板，以P10和P11为引物扩增，获得VH(SAL)-LinkerA-VL(LAS)杂交链。其反应体系如下：
在低温下加入该反应体系，低速涡旋混匀后点甩离心，进行PCR扩增反应，PCR反应条件同上。反应结束后，经电泳鉴定后，进行切胶回收。
(4)以步骤(3)回收产物(即步骤(3)获得的VH(LAS)-Linker A-VL(SAL)杂交链和VH(SAL)-LinkerA-VL(LAS)杂交链以等体积混合的产物)为模板，拼接完整的VH(LAS)-Linker A-VL(SAL)-Linker B-VH(SAL)-Linker A-VL(LAs)的双特异性单链抗体基因(ScDb基因)。其反应体系如下：
低温条件加入该反应体系，轻微振荡混匀后点甩离心，进行PCR扩增反应，PCR反应条件同上。同样经鉴定后切胶回收产物(即ScDb基因)。
ScDb基因结构为VH(LAS)-LinkerA-VL(SAL)-Linker B-VH(sAL)-LinkerA-VL(LAs)，ScDb基因序列如SEQ ID No.3所示，第1-354位为VH(LAS)，第355-375位为LinkerA，第376-702位为VL(sAL)，第703-747位为Linker B，第748-1104位为VH(SAL)，第1105-1125位为LinkerA，第1126-1467位为VL(LAS)。
ScDb基因表达抗体ScDb，抗体ScDb的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，第1-118位为VH(LAS)，第119-125位为Linker A，第126-234位为VL(SAL)，第235-249位为Linker B，第250-368位为VH(SAL)，第369-375位为Linker A，第376-489位为VL(LAS)。
实施例5、抗体ScDb的转化与表达
1、ScFv-pJB33重组质粒的电击转化
将上述实施例4得到的ScDb基因通过限制性内切酶Sfi I双酶切连接到pJB33质粒载体上，得到ScDb-pJB33重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶回收。ScDb-pJB33重组质粒是在将pJB33质粒载体的pelB和(His)6tag识别位点之间插入的片段(小片段)替换为上述ScDb基因，保持pJB33质粒载体的其它核苷酸序列不变的载体。
将回收产物(ScFv-pJB33重组质粒)电击转化至实施例2制备的RV308感受态细胞中，具体操作如下：
提前紫外照射电转杯半小时，小心将透析膜置于去离子水液面，取ScDb-pJB33重组质粒20μL滴至透析膜上，整个透析过程要在冰浴条件下至少30min；从-80℃取出一管100μL感受态细胞RV308，待其恰好解冻时加入透析产物，轻微晃动试管使其混匀；转移至干燥电转杯中，装入电转仪中，在2250v、25uF、150Ω的条件下，电转5ms；电转结束后，将电转产物全部吸取至含有900μL的2×YT液体培养基的试管中，在37℃温度下振荡培养1h；取100μL上述培养液，在2×YT琼脂平板上(含氯霉素34μg/mL)均匀涂布于，37℃倒置培养12h。
阳性筛选同实施例3的ScFv阳性筛选步骤。
菌株RV308-ScDb表达ScDb基因，其表达产物为抗体ScDb，抗体ScDb的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
菌株RV308-ScDb大量诱导表达方法和实施例3的大量诱导表达方法相同。
2、ScDb的表达和纯化
(1)在ScDb基因表达时，诱导条件对其可溶性表达和包涵体十分重要。在诱导温度16℃，IPTG浓度为0.1mM条件下过夜(16h)表达。采用超声裂解仪使大量诱导表达的菌体细胞壁破碎，得到细胞表达产物。取合适体积的Binding buffer将菌体重悬，超声破碎仪在200W功率下，冰浴超声，使细胞壁破裂(超声3s，停2s)，得到质地均一的细胞悬液，将其在4℃下10000rpm离心20min，转移上清液至新的离心管中，此上清液即为ScDb提取液。
(2)表达后的ScDb蛋白带有6×His标签，可以与镍柱结合，经高浓度咪唑洗脱从而达到纯化的目的。首先根据蛋白表达量，用合适体积的Ni-NTA填充纯化柱，约1h左右，Ni-NTA填充均匀，接着用超纯水洗涤镍柱，再用合适体积的Binding buffer(10mM咪唑)平衡柱子。
(3)用0.45μm滤膜过滤步骤(1)获得的ScDb提取液，与镍填料混匀后4℃晃动结合2h，缓慢过柱，收集穿流液。
(4)全部上样液流出后，用Washing buffer(50mM咪唑)洗涤柱子，除去黏附在柱子上的杂蛋白，洗涤的同时用Bradford测定蛋白浓度，直到无蛋白流出为止。
(5)最后用Elutionbuffer(300mM咪唑)洗脱结合在柱子上的目的蛋白，收集洗脱液，洗脱的同时用Bradford测定蛋白浓度，直到无蛋白流出为止。
(6)洗脱蛋白用PBS透析48h，每12h更换一次PBS，收集目的蛋白，储存时加入等体积的甘油保护蛋白不变性，置于-20℃。
(7)镍柱再生：用10倍柱体积的超纯水洗涤，然后用20％乙醇封存置于4℃。
目的蛋白的SDS-PAGE和Western-blotting鉴定步骤同实施例3ScFvs的鉴定步骤相同。
鉴定结果表明，RV308-ScDb大量诱导表达ScDb基因片段，纯化产物后获得单链抗体ScDb。
采用BCA试剂盒测定上述制备的纯化后的蛋白中单链抗体浓度，其中，单链抗体scDb在纯化后的蛋白中的浓度为3.8mg/mL。
实施例6、双特异性单链抗体的初步应用
1、单链抗体ScDb的应用
将拉沙洛菌素包被原和盐霉素包被原用PBS稀释9000倍，分别向酶标板中加入，每孔100μL，37℃温箱避光孵育2h；甩出孔内液体，每孔270μL洗液洗板3次，甩出孔内液体后，拍干；每孔150μL的5％脱脂牛奶进行封闭，同样条件孵育2h，甩出孔内液体后，拍干；每孔分别加入用PBS稀释的50μL梯度浓度为0ng/mL，0.1ng/mL，0.3ng/mL，0.9ng/mL，2.7ng/mL，8.1ng/mL的LAS和SAL标准品和9000倍稀释的实施例5制备的抗体ScDb，避光条件下37℃温箱孵育30min，洗涤，拍干；每孔加入50μL的抗His标签抗体(1：3000稀释)，同样条件孵育30min，洗涤，拍干；接着每孔加入50μL的HRP标记的羊抗鼠IgG(1：3000稀释)，避光37℃温箱孵育30min，洗涤，拍干；每孔加入100μL现用现配的显色液，在37℃温箱中避光显色15min；最后每孔加入50μL终止液，酶标仪中读取各孔OD450值。根据LAS或SAL的标准品的梯度浓度和OD450值建立LAS或SAL标准曲线。
结果表明，抗体ScDb可用于检测LAS，也可用于检测SAL。
2、间接竞争ELISA检测样品中的SAL和LAS的方法建立
1)建立基质加标标准曲线
称取不含LAS、SAL残留的鸡肝脏2g，于50mL离心管内，涡动混匀后，加入5mL甲醇提取，转移上清液至另一50mL离心管中，对原离心管中剩余基质进行重复提取，合并两次提取的上清，加正己烷10mL轻微振摇20s，5000r/min离心3min，弃去正己烷层，下层溶液在40℃下氮气吹干，最后用2mL的10％甲醇水复溶，振荡10min后获得鸡肝脏基质提取液，进行后续的检测试验。
用上述制备的鸡肝脏基质提取液代替PBS缓冲液，梯度稀释LAS和SAL标准品，建立基质加标标准曲线。建立标准曲线方法同1、单链抗体ScDb的应用。基质加标标准曲线如图4所示，左侧图为LAS基质加标标准曲线，右侧图为SAL基质加标标准曲线，其中x轴表示LAS和SAL的添加浓度，y轴表示OD450nm值，ScDb对LAS的IC50值为0.7ng/mn，ScDb对SAL的IC50值为0.4ng/mL。结果表明，抗体ScDb可用于检测样品中的LAS，也可用于检测样品中的SAL。
2)制备待测样品提取液
称取样品2g，于50mL离心管内，涡动混匀后，加入5mL甲醇提取，转移上清液至另一50mL离心管中，对原离心管中剩余基质进行重复提取，合并两次提取的上清，加正己烷10mL轻微振摇20s，5000r/min离心3min，弃去正己烷层，下层溶液在40℃下氮气吹干，最后用2mL的10％甲醇水复溶，振荡10min后获得复溶液(待测样品提取液)，进行后续的检测试验。
3)采用ScDb检测待测样品
将拉沙洛菌素包被原和盐霉素包被原稀释9000倍，分别向酶标板加入。每孔100μL，37℃温箱避光孵育2h；甩出孔内液体，每孔270μL洗液洗板3次，甩出孔内液体后，拍干；每孔150μL的5％脱脂牛奶进行封闭，同样条件孵育2h，甩出孔内液体后，拍干；每孔分别加入50μL待测样品提取液和实施例5制备的抗体ScDb(1：9000稀释)，避光条件下37℃温箱孵育30min，洗涤，拍干；每孔加入50μL的抗His标签抗体(1∶3000稀释)，同样条件孵育30min，洗涤，拍干；接着每孔加入50μL的HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶3000稀释)，避光37℃温箱孵育30min，洗涤，拍干；每孔加入100μL现用现配的显色液，在37℃温箱中避光显色15min；最后每孔加入50μL终止液，酶标仪中读取各孔OD450值。
将待测样品提取液的OD450值带入到基质加标标准曲线中，得到SAL和LAS的残留量。
4)方法准确度和精密度测定
根据上述标准曲线，如表3所示选择低、中、高三个浓度计算方法的准确度与精密度，按照每个浓度做6个平行，3个批次。
具体方法如下。
按照表3浓度将LAS和SAL标准品分别添加至不含LAS、SAL残留的鸡肝脏混匀作为样品。按照上述步骤3)和4)获得样品中的LAS、SAL的实测浓度。按下式计算回收率和变异系数：回收率(100％)＝实测浓度/添加浓度×100％；变异系数＝回收率标准差/平均值。
结果如表4所示，ScDb对LAS的基质添加回收率在81.8％～98.3％之间，批内变异系数小于6.6％，批间变异系数小于4.1％；ScDb对SAL的基质添加回收率在82.3％～99.0％之间，批内变异系数小于7.3％，批间变异系数小于6.8％，均满足兽药残留试验技术规范准确度与精密度的要求，可用于实际样品的残留检测。
表3鸡肝脏中LAS和SAL添加回收率和变异系数
上述实施例所用引物如表4和表5所示。
表4扩增scFv所需引物
表5扩增scDb所需引物
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 拉沙洛菌素和盐霉素单链抗体和双特异性单链抗体及其应用
<130> 212198
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatattttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtgtcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcct 300
ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacggg ctggtggtgg tggttctggc 360
ggcggcggct ccggtggtgg tggatccgaa gtgaagctgg tggagtctgg gggaggctta 420
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tatcccatgt cttgggttcg ccagactcca gaaaagaggc tggagtgggt cgcatccatt 540
agtagtggtg gtagtaccta ctatctagac aatgtggagg gccgattcac catctccaga 600
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<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgtttcatag ggagtggtta tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct 240
gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacaact atccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa acgggctggt ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt 360
ggtggtggat ccgaggtcca gctgcaacag tctggacctg agctggtgaa gcctggggct 420
tcagtgaaga tttcctgcag gacttctgga tacacattca ctgaatacac cattcactgg 480
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<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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gaggatctgg gagtttatta ctgctttcaa ggttcacatg ttcctccgac gttcggtgga 1440
ggcaccaagc tggaaatcaa acgggct 1467
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val Glu
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Val Ser Ala
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