具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。

本发明提供一种凝胶制剂，所述凝胶制剂包括透明质酸或其盐、依克多因、聚乙二醇、聚乙烯醇、麻醉剂和消泡剂。

其中，透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)是一种天然存在于人体组织细胞间质种的高分子多糖，由于透明质酸具有卓越的保湿性、润滑性、黏弹性，并具有多种生物活性，已广泛应用于化妆品、保健品及医药领域。透明质酸具有多种不同的分子量，各分子量的HA具有不同的功效与表现，高分子HA具有优秀的成膜与锁水的作用，低分子的水解HA可以渗透皮肤，对皮肤进行深度补水，且低分子透明质酸还具有一定的抑制炎性反应、抗肿瘤、促进骨和血管生成等作用。

依克多因，又称四氢嘧啶，其系统名称是2-甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸，四氢嘧啶不仅是一种重要的渗透压补偿溶质，而且对处于高温、高盐、冷冻、干燥、辐射等不良环境刺激下的细胞和生物大分子(生物膜、蛋白质、酶和核酸)有着很好的保护作用。四氢嘧啶分子的环状结构具有较强的电负性，容易与水分子形成氢键，增强水分子的缔合能力，使水分子在其周围定向排列，改变水分子的空间排布，具有长效的保湿作用。

在一个具体的实施方式中，按占所述凝胶制剂的质量百分比计，所述透明质酸或其盐为0.1％-9％，例如可以为0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％，优选为1％-5％；所述依克多因为0.1％-5％，例如可以为0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％，优选为1％-4％；所述聚乙二醇为1％-20％，例如可以为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％，优选为10％-20％；所述聚乙烯醇为1％-15％，例如可以为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％，优选为5％-15％；所述麻醉剂为0.5％-2.0％，例如可以为0.5％、1％、1.5％、2％；所述消泡剂为1％-5％，例如可以为1％、2％、3％、4％、5％。

在一个具体的实施方式中，所述透明质酸或其盐由寡聚透明质酸或其盐和交联透明质酸或其盐构成，其中所述寡聚透明质酸或其盐的分子量为1k-50kDa，例如可以为1kDa、2kDa、5kDa、10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa，优选为1k-10kDa。

交联透明质酸或其盐是透明质酸经化学修饰后形成的衍生物，通过交联修饰后的透明质酸或其盐可以提高其分子量，改变粘弹性、润滑性、水溶性等理化性质。所述交联透明质酸或其盐是由分子量为500k-2000kDa的透明质酸或其盐交联而得，例如可以由分子量为500kDa、600kDa、700kDa、800kDa、900kDa、1000kDa、1100kDa、1200kDa、1300kDa、1400kDa、1500kDa、1600kDa、1700kDa、1800kDa、1900kDa、2000kDa，优选为500k-1000kDa的透明质酸或其盐交联而得。

交联度是指透明质酸分子被交联剂修饰的程度，为交联透明质酸或其盐经透明质酸酶酶解后，液相色谱检测的寡糖色谱峰面积与总色谱峰面积的比值。交联透明质酸的理化性质与交联度的大小密切相关。所述交联透明质酸或其盐的交联度为3-5％，例如可以为3％、4％、5％。

进一步地，所述交联透明质酸或其盐可以通过以下方式得到：

(1)将透明质酸或其盐溶解在预混了交联剂的氢氧化钠水溶液中，溶解均匀，进行交联反应，交联温度为37-42℃，交联时间为12-36h；

(2)反应结束将反应溶液调整pH值至中性；

(3)在搅拌下流加有机溶剂或其水溶液使反应产物以微球形式沉淀，收集沉淀，将沉淀洗涤、干燥，得交联透明质酸粉末。

进一步地，所述寡聚透明质酸或其盐和所述交联透明质酸或其盐的质量比为1:1-10，例如可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10，优选为1:2-4。

进一步地，所述寡聚透明质酸盐是透明质酸的可溶性盐，例如可以为透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌或它们的组合。

进一步地，所述交联透明质酸盐是交联透明质酸的可溶性盐，例如可以为交联透明质酸钠、交联透明质酸钾、交联透明质酸钙、交联透明质酸镁、交联透明质酸锌或它们的组合。

在一个具体的实施方式中，所述聚乙二醇选自聚乙二醇-200、聚乙二醇-400、聚乙二醇-1000、聚乙二醇-1500、聚乙二醇-2000、聚乙二醇-3000中的一种或两种以上。

在一个具体的实施方式中，所述麻醉剂为局部麻醉剂，选自利多卡因、普鲁卡因、苯佐卡因、布比卡因、达克罗宁中的一种或两种以上。

利多卡因(Lidocaine)是局部麻醉及抗心律失常药，它是可卡因的一种衍生物，但没有可卡因产生幻觉和上瘾的成分。利多卡因其盐酸盐为白色结晶性粉末，易溶于水，毒力和普鲁卡因相当，但局部麻醉效果较强而持久，有良好的表面穿透力，可注射也可作表面麻醉。利多卡因是非常好的局部麻醉剂，一般施用一到三分钟后即生效，效果维持一到三小时。

普鲁卡因是局部麻醉药。临床常用其盐酸盐，又称“奴佛卡因”。白色结晶或结晶性粉末，易溶于水。毒性比可卡因低。注射液中加入微量肾上腺素，可延长作用时间。用于浸润麻醉、腰麻、“封闭疗法”等。除用药过量引起中枢神经系统及心血管系统反应外，偶见过敏反应，用药前应作皮肤过敏试验。其代谢产物对氨苯甲酸(PABA)能减弱磺胺类药的抗菌效力。

对氨基苯甲酸乙酯，又名苯佐卡因，化学式是C₉H₁₁NO₂，是一种有机化合物。为无色斜方形结晶，无嗅无味。易溶于醇、醚、氯仿，能溶于杏仁油、橄榄油、稀酸，难溶于水。临床上用于创面、溃疡面、烧伤、皮肤擦裂及痔的镇痛、止痒。

布比卡因，化学名为1-正丁基-2-(2,6-二甲胺甲酰基)哌啶，常用其盐酸盐，为白色结晶性粉末，无臭、味苦。在乙醇中易溶，在水中溶解，在氯仿中微溶，在乙醚中几乎不溶。其水溶液pH为4.5～6.0。临床上属于麻醉药类别。

达克罗宁，英文名dyclonine，本品能阻断各种神经冲动或刺激的传导，抑制触觉和痛觉，对皮肤有止痛、止痒及杀菌作用。

在一个具体的实施方式中，所述消泡剂为非离子型表面活性剂，优选地选自聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚、聚氧乙烯烷基醇酰胺中的一种或两种。

进一步地，所述凝胶制剂还包括防腐剂和pH调节剂。

在一个具体的实施方式中，所述防腐剂选自苯甲酸钠、羟苯乙酯钠中的一种或两种，所述pH调节剂选自氢氧化钠、碳酸氢钠、盐酸中的一种或两种。

本发明还提供一种凝胶制剂，所述凝胶制剂由透明质酸或其盐、依克多因、聚乙二醇、聚乙烯醇、麻醉剂、消泡剂、防腐剂、pH调节剂和水构成。

透明质酸或其盐、依克多因、聚乙二醇、聚乙烯醇、麻醉剂、消泡剂、防腐剂、pH调节剂的质量含量如上所述。

本发明还提供一种凝胶制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

将透明质酸或其盐、聚乙二醇、聚乙烯醇加入水中溶胀，得到第一溶液；

将依克多因、麻醉剂、消泡剂、防腐剂加入水中溶解，得到第二溶液；

将所述第二溶液加入所述第一溶液中，调节pH值为5.5-7.0，湿热灭菌得到凝胶制剂。

在一个具体的实施方式中，所述透明质酸或其盐由寡聚透明质酸或其盐和交联透明质酸或其盐构成，其中所述寡聚透明质酸或其盐的分子量为1k-50kDa，例如可以为1kDa、2kDa、5kDa、10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa，优选为1k-10kDa。所述交联透明质酸或其盐是由分子量为500k-2000kDa的透明质酸或其盐交联而得，例如可以由分子量为500kDa、600kDa、700kDa、800kDa、900kDa、1000kDa、1100kDa、1200kDa、1300kDa、1400kDa、1500kDa、1600kDa、1700kDa、1800kDa、1900kDa、2000kDa，优选为500k-1000kDa的透明质酸或其盐交联而得，交联度为3-5％。在第一溶液的制备过程中将寡聚透明质酸或其盐和交联透明质酸或其盐与聚乙二醇、聚乙烯醇一同加到加入水中进行溶胀。

其中，所述湿热灭菌为在121℃下灭菌20-30min。

本发明还提供上述的凝胶制剂或上述方法制备的凝胶制剂在内窥镜检查中的应用。具体地，可以在内窥镜检查中作为润滑剂、消泡剂、麻醉剂、视野清晰剂使用。

本发明的凝胶制剂具有良好的凝胶粘附力，凝胶垂直黏附力均在11.23g以上，可以保证凝胶很好地黏附在内窥镜上；本发明的凝胶制剂具有良好的润滑度，可以保证内窥镜顺利地进入体内；本发明实施例制备的凝胶不易沾染粘附油脂，能保证涂有实施例凝胶的内窥镜进入体内后的镜头的清洁；本发明实施例1-6的凝胶样品表现出了较强的人表皮细胞迁移能力，细胞迁移率均达到60％以上，表明上述样品具有很好的创伤修复功能。

本申请中所使用的透明质酸钠、依克多因均购自华熙生物科技股份有限公司，其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

(1)交联透明质酸钠制备

将10g透明质酸钠(Mw＝1000kDa)溶于100mL1wt％氢氧化钠溶液中，加入交联剂BDDE，交联剂用量为透明质酸质量的4wt％，混合均匀后于40℃水浴中交联24h；反应结束将反应溶液调整pH值至中性；在搅拌下流加有机溶剂或其水溶液使反应产物以微球形式沉淀，收集沉淀，将沉淀洗涤、干燥，得交联透明质酸钠粉末，交联度为3.1％。

(2)凝胶制剂制备

将2g步骤(1)中制备的交联透明质酸钠、1g寡聚透明质酸钠(Mw＝5kDa)、15g聚乙二醇-2000(PEG-2000)、10g聚乙烯醇加入水中，在搅拌下溶胀20min，得到第一溶液；将3g依克多因、1g利多卡因、2g聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚、0.2g苯甲酸钠加入水中，搅拌使其溶解，得第二溶液；在搅拌下将溶液第二溶液加入到第一溶液中，补水至100g，搅拌20min，用氢氧化钠调节溶液pH＝6.5，121℃湿热灭菌25min得凝胶制剂。

实施例2-6、对比例1-8与实施例1的不同之处在于交联透明质酸钠、寡聚透明质酸钠、聚乙二醇、依克多因的含量以及寡聚透明质酸钠的分子量不同，具体如表1。

表1

验证例1凝胶黏附力

(1)切向黏附力

取上述实施例和对比例制备的凝胶各0.1g于7cm*7cm的玻璃板上，将2.5cm*2.5cm硬质塑料薄片置于样品上，并用500g砝码压在硬质塑料薄片上5min，使样品在硬质塑料薄片及玻璃板之间铺展开。将玻璃板垂直固定，在塑料薄片上安装小钩、细线、塑料小杯，打开滴流装置控制阀，水滴以20mL·min^-1流速进入小塑料杯中，直至薄片开始滑动，记录薄片、钩线、小塑料杯和水的重量，即得凝胶的切向黏附力。结果见表2。

(2)垂直黏附力

取上述实施例和对比例制备的凝胶各0.1g于7cm*7cm的玻璃板上，将2.5cm*2.5cm硬质塑料薄片置于样品上，并用500g砝码压在硬质塑料薄片上5min，使样品在硬质塑料薄片及玻璃板之间铺展开。将玻璃板水平固定，在塑料薄片上安装小钩、细线、塑料小杯，打开滴流装置控制阀，水滴以20mL·min^-1流速进入小塑料杯中，直至薄片开始滑动，记录薄片、钩线、小塑料杯和水的重量，即得盐酸利多卡因凝胶的垂直黏附力。结果见表2。

表2

结论：黏附力是内窥镜凝胶发挥作用必须要具备的性能，垂直黏附力大才能保证凝胶很好的黏附在内窥镜上。从上表可以看出，实施例和对比例所制备凝胶的切向黏附力差别不大，但是垂直黏附力却有很大的差异，本发明实施例制备的凝胶垂直黏附力均在11.23以上，尤其是实施例1，较对比例提高2.05-5.99以上，可以保证凝胶很好地黏附在内窥镜上。

验证例2润滑性

用MXD-01摩擦系数仪进行润滑性测定。

摩擦系数仪主要由不锈钢水平面、质量恒定的滑块和力值传感器组成。在滑块底面和水平面上分别固定PE膜和纤维膜，将实施例和对比例制备的凝胶制剂涂于PE膜和纤维膜之间，以涂抹水的作为对照，测定时将滑块与力值传感器连接并放于水平面上，力值传感器以恒定的速度拉动滑块运动一段距离后停止，即可测出滑块与水平面之间的摩擦系数，测定三次后仪器自动得出平均值。

表3

结论：凝胶赋予内窥镜一定的润滑度可以保证内窥镜顺利地进入体内。动摩擦系数小，凝胶的润滑性能越强。通过上表可以看出，涂抹凝胶后PE膜和纤维膜之间动摩擦系数明显较涂抹水的对照组小，这说明凝胶的存在减少了两者之间的摩擦力，尤其是涂抹本发明实施例的凝胶后其摩擦力减少更为优异。

验证例3油脂粘附评价

取15cm*10cm的玻璃板，分别均匀涂抹实施例、对比例的凝胶，将玻璃板平放在水平面上，于距离一边10cm处滴一滴血液，5s后将玻璃板竖起，观察血液的浸润和滚动情况，并记录血液滚动到另一边的时间。

表4

注：——表示观察时间内未滚动到另一边或滚动过程中全部浸润到凝胶中

结论：从上表数据可有看出，血液在涂有本发明实施例制备的凝胶的玻璃板上不浸润，容易滚动，在玻璃板上的滚动时间均在10s以下，说明本发明实施例制备的凝胶不易沾染粘附油脂，能保证涂有实施例凝胶的内窥镜进入体内后的镜头清洁。

验证例4创伤修复实验

1、制备凝胶浸提液

根据中华人民共和国国家标准《医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品》制备浸提液。将凝胶通过紫外臭氧箱进行消毒，在无菌超净工作台中将材料放入无菌的浸提容器中，使消毒后的材料完全浸泡在溶液中，浸提材料的介质采用无血清的DMEM培养基。浸提时间为48h，浸提液过滤除菌，密封，4℃保存备用。

2、细胞培养

细胞创伤修复采用ibidi小室，在24孔培养板中形成规则的划痕区域，考察样品对人表皮角质形成细胞(HaCaT)向划痕区域迁移能力的影响，以评价样品是否具有创伤修复的能力。

在新的24孔培养板中，放置ibidi小室，取处于对数生长期的人表皮角质形成细胞HaCaT，以3×10⁵个/mL的密度接种于24孔板中的ibidi小室中，小室的左右两孔各70μL细胞悬液，小室外补充400μL完全培养液，37℃、5％CO₂条件下培养24h。取出小室，吸弃旧培养液，加入1mL样品溶液。样品溶液为实验例及对比例浸提得到的样品，用DMEM高糖培养液配制成10％浓度(v/v)，用0.22μm滤膜过滤除菌后使用。对照组用不含样品的培养液代替。继续培养24h后观察拍照。结果用Image J软件分析计算迁移率。

迁移率＝实验组划痕区域面积/对照组划痕区域面积×100％

表5

结论：细胞迁移率高表示创伤修复能力越强。从上表数据可以看出，本发明实施例1-6的凝胶样品表现出了较强的人表皮细胞迁移能力，细胞迁移率均达到60％以上，表明上述样品具有很好的创伤修复功能。其中以实施例1的创伤修复效果最好，其迁移率显著优于对比例样品数据。对比例的迁移率明显降低，尤其是对比例4、5、7的迁移率最低，均在40％以下，这说明本发明中交联透明质酸、寡聚透明质酸、依克多因协同作用在创伤修复功能上达到了较好的效果，缺一不可。