采用复合益生菌发酵浓香型酒糟生产抗生素代替剂的方法
阅读说明：本技术 采用复合益生菌发酵浓香型酒糟生产抗生素代替剂的方法 (Method for producing antibiotic substitute by fermenting Luzhou-flavor vinasse by adopting composite probiotics ) 是由 古绍彬 崔玉明 张献敏 吴影 何昭惠 赵丽娜 李璇 马金亮 于 2021-01-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及采用复合益生菌发酵浓香型酒糟生产抗生素代替剂的方法,属于固体发酵领域,该方法包括如下步骤：S1.原料预处理：将浓香型白酒糟pH调定、烘干,得一定含水率的酒糟；S2.原料发酵前改善：酒糟掺玉米粉,采用尿素和磷酸二氢钾混合处理液喷洒酒糟；S3.将植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌在各自液体培养基中进行活化扩培；S4.接种发酵：将凝结芽孢杆菌和酿酒酵母溶液接种于发酵物料中,搅拌均匀,控温发酵两天,将植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌接种于物料中,搅拌均匀,控温发酵,最终得到抗生素代替剂。本发明工艺简单,通过该方法得到高活菌含量、营养丰富的抗生素代替剂,有助于高效高质利用酒糟。(The invention relates to a method for producing an antibiotic substitute by fermenting Luzhou-flavor vinasse with composite probiotics, belonging to the field of solid fermentation and comprising the following steps: s1, raw material pretreatment: adjusting the pH value of the strong aromatic distiller's grains, and drying to obtain distiller's grains with a certain water content; s2, improving the raw materials before fermentation: mixing distiller's grains with corn flour, and spraying the distiller's grains with mixed treating solution of urea and potassium dihydrogen phosphate; s3, activating and expanding lactobacillus plantarum, bacillus coagulans, saccharomyces cerevisiae and bacillus subtilis in respective liquid culture media; s4, inoculating and fermenting: inoculating the bacillus coagulans and saccharomyces cerevisiae solution into the fermented material, uniformly stirring, fermenting at a controlled temperature for two days, inoculating lactobacillus plantarum and bacillus subtilis into the material, uniformly stirring, fermenting at a controlled temperature, and finally obtaining the antibiotic substitute. The method has simple process, and the antibiotic substitute with high viable bacteria content and rich nutrition is obtained by the method, thereby being beneficial to the high-efficiency and high-quality utilization of the vinasse.)
技术领域
本发明属于固体发酵技术领域，具体地，涉及采用复合益生菌发酵浓香型酒糟生产抗生素代替剂的方法。
背景技术
由于抗生素对环境的污染以及耐药菌的威胁，各国陆续推出相关法律法规，禁止饲料添加抗生素。全面禁止添加抗生素，对养殖业将带来持续挑战，为此，人们不断研究在饲料配方和养殖过程中代替抗生素的技术和寻找有效的替代产品，在众多潜在的抗生素替代产品中，最受欢迎的抗生素替代产品和最有效的饲料添加剂都是有机酸、益生菌和酶制剂。
虽然，针对健康有益的抗生素代替物的研发工作一直都在继续，但大多是中药类及其提取物，适口性差、营养价值低、适用范围小、价格贵、功能相对单一，对动物的免疫力和饲料报酬的改善效果不明显。
同时我国是一个资源短缺的国家，每年需要进口大量黄豆、鱼粉用于饲料加工和养殖业。并且我国地域广阔，各种农产品及食品加工后的副产物丰富，如酒糟、醋糟、酱渣与果渣等。其中浓香型白酒糟中粗蛋白> 13.0 %、淀粉> 15.0 %，可作为一种优质的发酵基质资源。但浓香型白酒糟因其含水率高，易变质，不易运输，严重限制了其应用范围。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供采用复合益生菌发酵浓香型酒糟生产抗生素代替剂的方法，利用浓香型白酒糟进行复合益生菌发酵，其内不仅含有大量活菌，发酵过程中还会代谢出大量有机酸和酶类等，发酵后的酒糟可作为优质的抗生素代替剂应用于饲料养殖业，并且通过发酵能提升酒糟内蛋白质含量，降低粗纤维含量，进而改善酒糟的品质，实现酒糟资源的利用价值。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
采用复合益生菌发酵浓香型酒糟生产抗生素代替剂的方法，包括以下步骤：
步骤一、原料预处理：将浓香型白酒糟进行pH调定和烘干预处理，得到含水率控制在50±2 %的处理酒糟；
步骤二、原料发酵前改善：向步骤一得到的处理酒糟掺入玉米粉，然后在塑料布上进行堆高压实，形成酒糟垛，采用处理液喷洒酒糟垛，得到基质物料；补充水分使所述基质物料含水量为60±2 %，然后密封基质物料；所述处理液为包含尿素和磷酸二氢钾的混合溶液，所述处理液中尿素为0.2-0.3 g/mL，磷酸二氢钾为0.05-0.15 g/mL；所述处理液的喷洒量为：每吨酒糟喷洒50 L处理液；
步骤三、菌种活化、扩培：将植物乳杆菌HZLp-005、凝结芽孢杆菌CGMCC9551在MRS液体培养基中进行活化扩培；将酿酒酵母在YPD液体培养基中进行活化扩培；将枯草芽孢杆菌CGMCC17305在LB液体培养基中进行活化扩培；
步骤四、接种发酵：将步骤三得到的活化好的凝结芽孢杆菌CGMCC9551和酿酒酵母溶液接种于经步骤二处理得到的基质物料中，搅拌均匀，控温发酵两天，得初始物料；将步骤三得到的活化好的植物乳杆菌HZLp-005和枯草芽孢杆菌CGMCC17305接种于所述初始物料中，搅拌均匀，并控温发酵，得到发酵物料；
步骤五、后处理：控制步骤四所得发酵物料的含水量在50%-55%，经冷冻后进行粉碎处理，检测合格后，抽真空包装，制成成品。
优选的，在步骤一中，将所述浓香型白酒糟的pH调至7±0.5；所述烘干的温度为400±50℃。
优选的，在步骤二中，所述玉米粉的掺入总量占基质物料重量的5±0.5 %。
优选的，在步骤二中，所述处理液中尿素为0.25 g/mL，磷酸二氢钾为0.1 g/mL。
优选的，在步骤三中，酿酒酵母、凝结芽孢杆菌CGMCC9551、植物乳杆菌HZLp-005、和枯草芽孢杆菌CGMCC17305均活化2～3代，接种浓度均为108 CFU/g。所用各菌种均为筛选得到的生长快、长势强的菌株。
优选的，步骤四中，酿酒酵母、凝结芽孢杆菌CGMCC9551、植物乳杆菌HZLp-005、和枯草芽孢杆菌CGMCC17305的接种量均为2 %～3 %。
优选的，在步骤四中，将凝结芽孢杆菌CGMCC9551和酿酒酵母接种后，在33±2℃下发酵2d，且所述发酵期间每3～4 h通风搅拌一次，每次通风时间为30 min；发酵2d后再接种植物乳杆菌HZLp-005和枯草芽孢杆菌CGMCC17305，再于33±2℃下发酵3 d，且所述发酵期间每3～4 h通风搅拌一次，每次通风时间为30 min。
本发明还请求保护利用上述方法方法制备得到的抗生素代替剂在制备动物饲料、饲料添加剂或助消化型药物方面的应用。
有益效果：
1、本发明选用浓香型酒糟为原料，其与酱香型、清香型在酿造工艺、发酵容器和接种剂等方面差异较大，如酱香型酒原料为高梁（酿酒）、小麦（制大曲），大曲工艺是高温曲，原料采用清蒸处理，用曲量大（1：1.2），入窖前采用堆集工艺，窖池是石壁泥底；清香型原料为高粱，大曲为低温曲，发酵采用地缸来进项发酵且周期短；浓香型原料虽然是高梁、小麦，大曲则是中温，原料混蒸混烧处理，采用周而复始的万年糟发酵工艺，用曲量为20％左右，窖池是肥泥窖，为丁己酸菌等微生物提供了良好的栖息地。不同香型的酒糟组分存在差异，经过大量实践证实，采用浓香型酒糟为原料，结合本发明的发酵方法制备的成品在营养水平、活菌数和相关酶的活性等方面均更优。
2、本发明摒弃了现有技术中多采用酵母单菌处理酒糟进行蛋白富集的做法，所选菌种除酵母外，还加入了植物乳杆菌（HZLp-005）、枯草芽孢杆菌（CGMCC17305）和凝结芽孢杆菌（CGMCC9551）进行组配发酵，其中凝结芽孢杆菌作为唯一可以产L-乳酸的杆菌，各菌协同作用，在益生方面有非常显著成效。
3、本发明以浓香型酒糟为原料，采用多菌组配发酵，最终不仅得到了高值活菌数，而且蛋白质和氨基酸的提升、纤维素的降解均达到显著水平，还具有较高酶活性。这些对于牲畜的健康和营养成分积累来说至关重要。
4、本发明所述方法首先对原料进行烘干，一方面可以杀灭酒糟中的杂菌，另一方面可以降低酒糟的含水量，便于后续的原料储存及喷洒尿素和磷酸二氢钾混合溶液；通过向酒糟内添加玉米粉和喷洒尿素和磷酸二氢钾混合溶液，可增加菌体生长繁殖动力，提高发酵物活菌量，并改善发酵物的品质；产品中酵母菌发酵产生的代谢产物能够改良固体基质、并且酵母细胞内容物和酵母细胞壁多糖也能改良固体基质；产品中凝结芽孢杆菌(CGMCC9551)能有效抑制大肠杆菌、志贺杆菌等致病菌，并且能发酵过程中会产生大量有机酸，改良发酵基质；产品中植物乳杆菌(HZLp-005)发酵过程中产生大量有机酸等物质，能有效改良发酵基质；枯草芽孢杆菌(CGMCC17305)生产代谢过程中会分泌大量的淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等酶系，能有效改良发酵基质；本发明能发酵得到高活菌含量、丰富酶系和有机酸的抗生素代替剂，有助于高效高质利用酒糟。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
以下实施例中没有注明具体实验条件的试验方法，通常遵循常规实验条件。
所使用的材料试剂等，如无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂及材料。
实施例1
采用复合益生菌发酵浓香型酒糟生产抗生素代替剂的方法，具体步骤包括如下步骤：
1、原料预处理：
将pH调至7的浓香型白酒糟在滚筒烘干设备中进行烘干预处理，控制烘干温度为400℃，得到含水率为50%的酒糟，经过烘干预处理，浓香型白酒糟中的杂菌被杀灭，并且其含水率适宜在后续过程中添加玉米粉和尿素和磷酸二氢钾的混合溶液，控制得到适宜的含水量，有助于后续发酵。
2、将步骤1得到的含水率为50％的一吨酒糟内掺重量5%的玉米粉，并向酒糟内喷洒处理液50L，得到基质物料，采用塑料薄膜覆盖并密封基质物料，减少基质物料与空气的接触，防止酒糟的霉变和毒素的产生；所述处理液为包含尿素和磷酸二氢钾的混合溶液，混合溶液中尿素为0.25g/mL，磷酸二氢钾为0.1 g/mL。补充适当水分使物料含水量为60%。
3、将植物乳杆菌(HZLp-005)、凝结芽孢杆菌(CGMCC9551)在MRS液体培养基中进行活化扩培；酿酒酵母在YPD液体培养基中进行活化扩培；枯草芽孢杆菌(CGMCC17305)在LB液体培养基中进行活化扩培；得到活化扩培好的菌液；
4、将步骤3得到的活化好的凝结芽孢杆菌(CGMCC9551)和酿酒酵母溶液采用计量泵喷雾的方式接种于步骤2得到的基质物料中，使得凝结芽孢杆菌(CGMCC9551)和酿酒酵母接种量分别为物料重量的2.5%，搅拌均匀在33℃下发酵2d，且所述发酵期间每3～4 h通风搅拌一次，每次通风时间为30 min，得初始物料；
将步骤3得到的活化好的植物乳杆菌(HZLp-005)和枯草芽孢杆菌(CGMCC17305)采用计量泵喷雾的方式接种于经凝结芽孢杆菌(CGMCC9551)和酿酒酵母发酵两天的初始物料中，使得植物乳杆菌(HZLp-005)和枯草芽孢杆菌(CGMCC17305)接种量分别为初始物料重量的2.5%，搅拌均匀于33℃下发酵3d，且所述发酵期间每3～4 h通风搅拌一次，每次通风时间为30 min，得到发酵物料；发酵期间采用塑料布覆盖，能够有效防止霉菌污染。
5、产品后处理：为了尽可能使物料内益生菌维持在最高水平，保留各种消化酶、酸溶蛋白、多糖等有益成分，整个处理运输过程要避免高温；发酵好的物料含水量在50 %-55%，经冷冻后进行粉碎处理，检测合格后，进行抽真空包装，制成成品。
检测本实施例制成的成品益生菌活菌含量，干料真蛋白含量、纤维含量和氨基酸含量，成品糖化酶、纤维素酶和蛋白酶活力，将检测数据列入表1；其中活菌量采用稀释涂板的方法检测；真蛋白含量采用氢氧化铜沉淀，再用凯氏定氮仪进行检测；粗纤维按GB/T6434-1994中规定检测；氨基酸按GB/T18246-2019中规定检测；糖化酶和纤维素酶采用3,5-二硝基水杨酸法测定，蛋白酶采用Folin-酚法测定。
实例2
本实施例与实施例1中的步骤基本相同，不同之处在于，步骤1中，pH调至6.5，烘干温度为350℃，得到含水率为50％的酒糟；步骤2中，处理液中尿素为0.2g/mL、磷酸二氢钾为0.05g/mL，每吨添加50L处理液，补充适当水分使物料含水量为58%；步骤4中，凝结芽孢杆菌(CGMCC9551)、酿酒酵母、植物乳杆菌(HZLp-005)、枯草芽孢杆菌(CGMCC17305)的接种量分别为2%，搅拌均匀，发酵过程温度为31℃。
检测本实施例制成的成品益生菌活菌含量，干料真蛋白含量、纤维含量和氨基酸含量，成品糖化酶、纤维素酶和蛋白酶活力，将检测数据列入表1。
实施例3
本实施例与实施例1中的步骤基本相同，不同之处在于，步骤1中，pH调至7.5，烘干温度为450℃，得到含水率为50％的酒糟；步骤2中，处理液中尿素为0.3g/mL、磷酸二氢钾为0.15g/mL，每吨添加50L处理液，补充适当水分使物料含水量为62%；步骤4中，凝结芽孢杆菌(CGMCC9551)、酿酒酵母、植物乳杆菌(HZLp-005)、枯草芽孢杆菌(CGMCC17305)的接种量分别3%，搅拌均匀，发酵过程温度为35℃。
检测本实施例制成的成品益生菌活菌含量，干料真蛋白含量、纤维含量和氨基酸含量，将检测数据列入表1。
初始发酵酒糟基干料真蛋白含量、纤维含量和氨基酸含量检测，成品糖化酶、纤维素酶和蛋白酶活力，将检测数据列入表1。
表1本发明实施例成品和初始发酵基的成分检测数据。
项目
活菌数(10<sup>10</sup>CFU/g)
真蛋白(%）
粗纤维(%）
Met(%）
Thr(%）
Trp(%）
糖化酶（u/g）
纤维素酶（u/g）
蛋白酶（u/g）
实施例1
3.2
13.6
26.1
0.41
0.73
0.24
786
68
863
实施例2
5.6
16.2
23.7
0.62
0.87
0.31
846
79
924
实施例3
4.1
14.8
24.9
0.53
0.79
0.28
804
76
889
初始基质
0
8.68
29.2
0.28
0.59
0.18
0
0
0
如表1所示，本发明通过对发酵工艺进行优化，使得发酵后制成的成品中拥有百亿的活菌数，并且真蛋白量提高56.7%以上，粗纤维含量降低9.6%以上，蛋氨酸提高46.4%以上，苏氨酸提高23.7%以上，色氨酸提高33.3%以上，发酵后的酒糟拥有较强的糖化酶、纤维素酶、蛋白酶活性，酒糟营养物含量的变化使得更容易被动物消化吸收，饲喂牲畜能够调节动物肠道菌群，改善动物健康水平，提高机体免疫力及饲料的消化利用率，进而提高生产性能，从而使得酒糟得到更好的高质再利用。
虽然已经通过示例对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围，本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例来做出各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的方向或者超越所附权利要求书所定义的范围。本领域的技术人员应该理解，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。