具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，如打孔操作的打孔器，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

如图1所示，本实施例需要使用一种加富PDA琼脂真菌培养基，其制备方法包括以下步骤：

1、制备树汁混合液：取杜仲皮200g；桂花叶100g；榆树根100g；箬竹叶100g；玉米须50g；麸皮100g，加水20升，煮沸，再加入2升水，煮沸2小时，用生石灰粉调节PH至8.0左右，取上清液备用。

2、制备基础PDA琼脂：土豆过滤汁(800g新鲜土豆，切成20*30毫米左右小颗粒加4000毫升自来水加热煮沸30分钟后取上清液用3层纱布过滤取过滤液)3000毫升放冷至56度左右，加入葡萄糖80g、磷酸二氢钾4g、硫酸镁2g、琼脂粉80g、蛋白胨16、西洋参粉10g，再一起加热融化煮沸3分钟备用。

3、取上述步骤1制备的树汁混合液400毫升，加入3000毫升已经融化的步骤2制备的基础PDA琼脂培养基，再加水至4000毫升混匀加热煮沸1分钟，分别分装试管，三角瓶(用于制作跨越平板)，放高压锅115度灭菌45分钟。试管放斜面，三角瓶琼脂顷倒9厘米平板使用。

本实施例中，通过PDA平板直接分离羊肚菌组织跨越抑菌培养液获得纯菌种的方法的还需要的准备工作如下：

制备青霉素蔗糖抑菌溶液：药店购买400万单位青霉素钾安瓶一瓶，用无菌注射取4毫升市售细菌微量蔗糖生化发酵鉴定管液，稀释至每毫升100万单位浓度青霉素蔗糖抑菌液使用，其中微量蔗糖发酵管液主要是稀释抗生素作用，也有为羊肚菌菌丝提供营养的作用。

如图2-5所示，本发明示出了两种跨越PDA平板制备方法，即平板打孔法和塑料水管预制法，本实施例采用塑料水管预制法制备中心凹槽PDA平板。

一、预备工作：按照本实施例PDA琼脂真菌培养基的步骤S3制备普通PDA平板，供第一次羊肚菌组织切取摆放使用。

二、制备中心凹槽PDA选择性平板：

塑料水管预制法：选用市售20毫米直径耐高温PP-R水管，切成长度为15毫米的短管，与PDA平板琼脂一起放高压锅115度灭菌45分钟备用。倾倒琼脂至90毫米平板，趁热将已经灭菌好的预制15*20毫米短管放在90毫米平板中央，等待平板琼脂冷却后用无菌手段取出中心预制耐热塑料短管，置28度条件培养3天，确认无菌后备用。

本实施例中，打孔操作的打孔器为商用不锈钢打孔器，于网上采购。

本实施例中，通过PDA平板直接分离羊肚菌组织跨越抑菌培养液获得纯菌种的方法，包括以下步骤：

子实体采集：

采集羊肚菌子实体必须是出菇最早、菇型标准、菌帽皱褶还未完全张开的羊肚菌子实体。连羊肚菌子实体泥土一起采集。

子实体运输：

小心放进500毫升无菌塑料瓶，不用盖子，运输过程中尽量避免抖动，避免接触其他物品，保持空气畅通。

子实体分离前处理：

子实体在实验室20±1度环境条件下避光干燥存放置18-24小时，让羊肚菌组织在最适温度下活化，在子实体孢子自然弹射最佳窗口期，开始取种操作。

子实体组织切取摆放：

接种人员按照常规方法消毒双手及接种器材(组织剪、组织夹、组织刀、9厘米直径加富PDA平板)，先将羊肚菌子实体菌盖柄交接处切开一30*40毫米的切口，左手持紧羊肚菌子实体，右手持11号组织刀片，采用无菌操作在肉眼可见有白色雾状突起组织上用刀尖切取2*3毫米的组织块，快速放在普通PDA琼脂平板上，一个平板按照中心一粒，四方对角一粒的方式摆放共5个点进行第一次菌丝初步分离培养。

第一次组织分离培养72小时后，通过显微镜观察，选择菌丝肉眼可见菌丝稀疏粗大、生长速度适度(每天约1厘米)、显微镜观察菌丝前端有典型羊肚菌菌丝分叉、后端菌丝角度逐渐由锐角变钝角的现象出现的前端琼脂块，用圆形不锈钢橡胶打孔器采用无菌操作切取适当琼脂块(直径12毫米)转移到事先制作好了的PDA跨越平板中心部位，保持边缘与外缘PDA平板之间的距离在1.5毫米左右，然后在这个圆形琼脂间隙中用无菌注射器滴入20滴(约0.1毫升)100万单位青霉素蔗糖抑制杂菌扩散，图10记录了滴加青霉素蔗糖的操作。

观察转种，待菌丝刚长满PDA平板时，通过羊肚菌菌丝平板生长情况观察，结合显微镜放大40倍确认是羊肚菌菌丝后，切取有菌核的PDA琼脂前端转种到试管斜面，培养5-7天后保藏菌种，或者进行转种栽培。

对试管、原种、栽培种观察：2019-2020年采用本方法分离培养出的羊肚菌试管母种1938-2、P2－B1核，经过2020年实验栽培效果良好；图7显示了1938-2羊肚菌显微镜下菌丝形态。图8显示了1938-2羊肚菌菌丝跨越实验第3天显微镜下形态。2021年复制相同的制种方法取得的菌种M-2142，F-2143，在显微镜下观察菌丝纯正粗壮，菌核丰富，色素形成慢，具有优秀羊肚菌菌丝的所有特征，在转原种、栽培种后菌丝生长快速旺盛色素形成慢。图6显示了跨越实验F-2143羊肚菌菌丝培养12小时后的生长情况。

下表一记录了2019-2020年羊肚菌栽培菌种扩种\栽培记录。

表一 2019-2020年羊肚菌栽培菌种扩种\栽培记录

此外，下表二显示了在重庆市酉阳土家族苗族自治县黑水镇平地坝村的栽培实验记录。

表二 羊肚菌平地坝栽培实验相关数据统计(2021.1.5)

下表三为2021年5月28前羊肚菌菌种保存、转种、观察记录。

表三 羊肚菌菌种观察记录

实施例二：

采用不同的培养基的对比实验，与实施例一相比，本实施例采用了市售的培养基以及采用市售培养基配方的自制培养基，实验方法与实施例一致，结果如下：

表四：使用不同配方PDA琼脂平板羊肚菌菌丝生长情况记录表

表四说明：

菌丝生长，+表示每天生长0.5厘米左右，++表示1厘米左右，+++表示1.5厘米左右；

菌核形成，+表示平板有3-5个菌核，++表示有5-10个，+++表示10-20个，++++表示满平板菌核。

对使用本发明的技术方案提供的PDA试管和常规市售PDA真菌琼脂分离扩种栽培，在2020年使用常规PDA试管扩种方法栽培7个菌种(7个大棚)约2亩平均亩产55.8公斤/亩，使用本发明提供的PDA平板纯化方法扩种2个菌种(6个大棚)1.6亩平均亩产154公斤，其具体产量见附图9以及如下表格。

下表中显示了在重庆市酉阳县黑水镇平地坝村羊肚菌栽培实验的相关数据，图9显示了使用常规试管与本发明的PDA琼脂平板纯化的菌株产量的对比，显然使用本发明的PDA琼脂平板纯化的菌株栽培具有更高的产量。

表五 使用常规试管与本发明的PDA琼脂平板纯化的菌株产量比较表

注：编号01混为混合菌种。

本发明第一次平板分离过程中可能有杂菌污染的羊肚菌菌丝通过特殊快速简单方法转移到另外一个平板上进行跨越抗生素液生长，实现羊肚菌纯化的目的，经过两次简单操作平板菌丝分离纯化菌丝转试管保存，其中2019年、2020年2株菌株：1928-2(3号菌种)、P2-B1核(11号菌种)经过实验性栽培验证，出菇产量效果满意。

本发明的菌种分离培养技术，子实体不消毒，减少了菌种分离前繁杂的消毒灭菌物资准备工作，也节省了大量时间和人力物力；跨越平板培养方法中耐热预制塑料管、琼脂打孔器、抗生素、微量蔗糖发酵管在市面或者网络购买容易；在平板上选择、纯化菌种比试管分离纯化方法，操作更加方便，观察更加容易，成本更加低廉。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。