一种用于检测角蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法
阅读说明：本技术 一种用于检测角蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法 (Preparation method of photoelectrochemical immunosensor for detecting keratin ) 是由 王秉 周晴晴 李青青 王钟元 胡智文 万军民 于 2021-01-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及光电化学传感领域,公开了一种用于检测角蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法,本发明首先提取丝素蛋白的提取并合成AuNPs和聚多巴胺,并使CdSeQDs-PDA负载Ab-2,然后逐层自组装制备间接型传感器。AuNPs由于局域表面等离子体共振效应来增强光催化活性。MoS-2-GO构成了2D-2D异质结,通过能带的匹配,来增大光电流信号的响应。如PDA膜上的醌官能团可以通过迈克尔加成反应,与胺封端的抗体共价偶联。CdSeQDs发射峰与Au NPs等离子体带之间有重叠,由于竞争吸收光激子能量转移(EET)的作用,可以减小的光电流信号。(The invention relates to the field of photoelectrochemical sensing, and discloses a preparation method of a photoelectrochemical immunosensor for detecting keratin 2 And then self-assembling layer by layer to prepare the indirect sensor. AuNPs enhance photocatalytic activity due to localized surface plasmon resonance effects. MoS 2 GO forms a 2D-2D heterojunction, and the response of the photocurrent signal is increased through the matching of energy bands. Quinone functional groups on films such as PDA can be reacted by Michael additionIt should be covalently coupled to an amine-terminated antibody. The CdSeQDs emission peak and Au NPs plasma band are overlapped, and the light current signal can be reduced due to the action of competitive absorption Exciton Energy Transfer (EET).)
技术领域
本发明涉及光电化学传感领域，尤其涉及一种用于检测角蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法。
背景技术
中国自古以来就是纺织品大国，生产的纺织品种类丰富，工艺精美，舒适透气。其中毛织品的生产量遥遥领先，毛织品文物是社会交替，人文交融的历史见证者。毛织品的主要成分是羊毛，羊毛所含蛋白质主要是角蛋白。但是，羊毛织品文物中的羊毛作为一种有机高分子材料，由于常年处于地下墓葬环境中易受光、热、酸碱、微生物等的影响发生降解，从而造成结晶度、分子量等结构及性能的变化；另一方面，文物出土的时候往往会伴有许多杂质，真正的有效成分极少。所以常规的检测方法灵敏度低，受杂质干扰影响大，不适合对文物进行检测，因此需要开发一种灵敏度好，特异性强的检测古代毛织品的方法存在着很重要的意义。
国内外报道的纺织品残留物的分析方法主要有化学降解法和生物质谱法等。然而，古代纺织品成分复杂，微小的成分变化就会导致质谱测定的较大误差，而且整个实验过程也必须经过残留物提取、酶切、质谱分析、结果分析等实验步骤，较为繁琐。因此，寻找一种灵敏度极高、特异性极强、快速、高效的方法对纺织品残留物进行鉴定显得尤为重要。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测角蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法，本发明首先进行角蛋白的提取和Au NPs、PDA的合成，并进行核壳结构[email protected]2的制备，然后通过逐层自组装工艺，制备间接型MoS2-GO /Au NPs传感器，最后用自组装PEC系统测试传感器性能。
本发明的具体技术方案为：一种用于检测角蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：羊毛角蛋白的提取：取羊毛添加至乙醇中，搅拌1-3h后，用去离子水冲洗并烘干；取4-6g烘干的羊毛以1:18-20 的浴比添加至CB缓冲液中，加入1-1.4g亚硫酸钠，在55-65℃下反应25-35min，用去离子水冲洗烘干，取处理后的羊毛1.8-2.2g浸入18-22ml 1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐离子液体中，再加入20-25ml的二甲基亚砜，进行超声处理；向所得溶液中加入18-22ml 1-烯丙基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液体，再加入20-25ml的二甲基亚砜，进行超声离心处理，取上层清液于透析袋透析，冷冻干燥，研磨，得到羊毛角蛋白。
步骤2：AuNPs的制备：取30-34ml 0.01%的HAuCl4溶液，加热后，加入38.8mM柠檬酸钠溶液，继续反应15-20min，冷却至室温，冷藏备用。
本发明半导体纳米晶体与AuNPs纳米粒子之间的荧光共振可以使能量转移，AuNPs由于局域表面等离子体共振效应来增强光催化活性。因为在较短的工作距离内，半导体材料的发射可以激发金属纳米材料中的表面等离子体共振。
步骤3：MoS2-GO纳米复合材料的水热法制备：在超声波作用下，将45-55mg GO粉末分散到60ml蒸馏水中，然后将0.5-0.6g NaMoO4和0.7-0.75g硫脲加入到所得悬浮液中混合，将所得混合液转移到高压釜中，在230-240℃下反应20-30h，冷却至室温，离心收集黑色MoS2/GO，用蒸馏水和无水乙醇洗涤，最后在50-60℃下干燥，备用。
本发明中MoS2-GO构成了2D-2D异质结，通过能带的匹配，来增大光电流信号的响应，而且二维（2D）纳米材料具有比表面积大、光学和电学性能优异等优点。MoS2是一种由弱范德华力共同作用的层状结构。该结构具有带隙窄、载流子迁移率高等优点。
步骤4：聚多巴胺的制备：往容器中加入8-10ml无水乙醇和18-20ml去离子水，随后加入550-600ul浓氨水；将所得混合溶液搅拌25-30min后，缓慢加入2ml 45-55mg/ml的多巴胺溶液；随后，在常温下搅拌反应25-30h，将所得溶液于8000-10000rpm下离心3-7min后备用。
本发明考虑到生物探针的结合位点通常有限，通过将纳米材料与具有大表面积的聚多巴胺膜材料相结合。仿生类材料聚多巴胺（PDA）可以在不同类型的无机物和有机物表面上自发地形成均匀的超薄涂层，并且具有很高的生物相容性，PDA 在整个紫外-可见（UV-vis）和近红外（NIR）区域附近有很强的吸收，与二抗结合，可以竞争吸收光子和激子，提高系统光电流淬灭性。并且PDA具有丰富的官能团，如PDA 膜上的醌官能团可以通过迈克尔加成反应，与胺封端的抗体共价偶联，从而负载更多的生物复合物。
步骤5：核壳结构[email protected]2的制备：取0.80-0.88ml的巯基乙酸和55-65ml的去离子水混合均匀，然后再向其中加入45-55mL 0.1M的氯化镉水溶液并搅拌均匀，用NaOH 溶液调节上述溶液pH为9.5-10.5，然后通入高纯氮气以除去溶液中的氧气，接着继续加入11-13ml 0.2M的NaHSe溶液并搅拌均匀，然后将所得反应前驱液在高纯氮气保护下75-85℃下反应3-5h，最后将所得亮黄色CdSeQDs溶液冷却至室温，离心清洗定容，加入10-15ml步骤4制得的聚氨多胺，于30-35℃下充分结合1-3h，去离子水冲洗3-5min，加入到15-20ml的含10ul/ml Ab2的 BSA溶液中，于30-35℃下孵育0.5-1.5h，去离子水冲洗3-5min，并置于1-5℃条件下保存备用。
本发明CdSeQDs作为一种窄禁带半导体，与PDA和二抗结合，可以竞争吸收光子和激子，增大空间位阻，来降低光电流信号的响应。
步骤6：活化MoS2-GO/AuNPs/ITO电极：将180-200ul的巯基丙酸加入到1ml步骤3所得MoS2-GO和1mg步骤2所得AuNPs的混合悬浊液中，连续超声20-30h，离心收集羧基修饰的MoS2-GO/AuNPs，最后将羧基化的MoS2-GO/AuNPs分散到2ml 0.05wt%CS溶液中，滴加15-20ul于ITO电极，室温下过夜，然后于70-80℃下干燥0.5-1.5h，最后把电极浸泡在1ml 0.05MMES缓冲液中，并置于50-60℃中孵育50-70min，将巯基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯，用PBS缓冲液洗净。
本发明GO 表面带有丰富的羧基活性位点，可以进一步共价偶联生物分子，同时增加了溶液的分散性。
步骤7：ITO导电玻璃电极预处理：取面积为0.35-0.45cm2的ITO导电玻璃电极，分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗10-20min，在50-60℃中干燥过夜。
步骤8：构建间接型免疫探针：滴加5-10 ul 1ul/ml的步骤1所得角蛋白的CB液，使其端氨基与活化后的羧基结合，用PBS缓冲液彻底清洗去除未结合的抗原后，再用10-15 ul的1 % BSA在35-40℃下将电极封闭20-40 min；随后，用1%的BSA封闭0.5-1.5h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，继续滴加3-7ul 1ul/ml的兔抗角蛋白抗体溶液，即Ab1抗体溶液，置于25-35℃中50-70min，用PBS缓冲液洗净未固定的Ab1，最后滴加8-12ul的步骤5所得[email protected]2，置于25-35℃中50-70min，用PBS缓冲溶液洗净未固定的[email protected]2，即得到电化学免疫传感器。
作为优选，步骤1中：离心速率为7000-8000r/min，离心时间为9-15min；所得溶液用截留分子量为7000-10000的纤维素透析袋在去离子水中透析2-3天，并每隔4-5h换一次水，将角蛋白溶液真空冷冻干燥2-3天。
作为优选，步骤1和8中：所述CB缓冲液的pH=9.6。
作为优选，步骤2中：加热到温度稳定于95-105℃后，再加入柠檬酸钠溶液，反应时需不断匀速搅拌，观察颜色先变蓝后变红。
作为优选，步骤4中，所述浓氨水的浓度为25-28wt%。
作为优选，步骤5中，所述Ab2为羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体。
作为优选，步骤6中，所述悬浊液中MoS2-GO的浓度为3-7mg.ml-1，所述AuNPs的浓度为0.34-0.39 ug/ml。
作为优选，步骤6中，所述MES缓冲液中含有0.05M的EDC和0.03M的NHS。
作为优选，步骤6和8中，所述PBS缓冲液的pH=7.4。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
（1）本发明半导体纳米晶体与AuNPs纳米粒子之间的荧光共振可以使能量转移，AuNPs由于局域表面等离子体共振效应来增强光催化活性。因为在较短的工作距离内，半导体材料的发射可以激发金属纳米材料中的表面等离子体共振。
（2）本发明MoS2-GO构成了2D-2D异质结，通过能带的匹配，来增大光电流信号的响应，而且二维（2D）纳米材料具有比表面积大、光学和电学性能优异等优点。MoS2是一种由弱范德华力共同作用的层状结构。该结构具有带隙窄、载流子迁移率高等优点。
（3）本发明考虑到生物探针的结合位点通常有限，通过将纳米材料与具有大表面积的聚多巴胺膜材料相结合。仿生类材料聚多巴胺（PDA）可以在不同类型的无机物和有机物表面上自发地形成均匀的超薄涂层，并且具有很高的生物相容性，PDA 在整个紫外-可见（UV-vis）和近红外（NIR）区域附近有很强的吸收，与二抗结合，可以竞争吸收光子和激子，提高系统光电流淬灭性。并且PDA具有丰富的官能团，如PDA 膜上的醌官能团可以通过迈克尔加成反应，与胺封端的抗体共价偶联，从而负载更多的生物复合物。
（4）本发明CdSeQDs作为一种窄禁带半导体，与PDA和二抗结合，可以竞争吸收光子和激子，增大空间位阻，来降低光电流信号的响应。
（5）本发明 PEC 免疫分析中，除了空间位阻效应是一种重要的信号放大策略，CdSeQDs发射峰与 Au NPs 等离子体带之间有重叠，由于竞争吸收光激子能量转移（EET）的作用，可以减小的光电流信号。本发明构建间接型免疫传感器，不同于常规的夹心型光电化学免疫传感器。检测底液为包含0.1M抗坏血酸（AA）的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol/L，pH=7.4)，作为光电阳极电流的电子供体。
附图说明
图1为实施例1所得CdSeQDs的高分辨TEM图；
图2为实施例1所得MoS2-GO的扫描电镜图（左）和透射电镜图（右）；
图3为实施例1所得MoS2的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
步骤1：羊毛角蛋白的提取：取羊毛添加至乙醇中，搅拌1h后，用去离子水冲洗并烘干；取4g烘干的羊毛以1：18 的浴比添加至CB 9.6缓冲液中，加入1g亚硫酸钠，在55℃下反应25min，用去离子水冲洗3次烘干，取处理后的羊毛1.8g浸入18ml 1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐离子液体中，再加入20ml的二甲基亚砜，进行超声处理；向所得溶液中加入18ml1-烯丙基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液体，再加入20ml的二甲基亚砜，进行离心，速率为7000r/min，离心时间为9min，所得溶液用截留分子量为7000的纤维素透析袋在去离子水中透析2天，并每隔4h换一次水，将角蛋白溶液真空冷冻干燥2天，研磨，得到羊毛角蛋白；
步骤2：AuNPs的制备：取30ml 0.01%的HAuCl4溶液于100ml圆底烧瓶中，加热到温度稳定于95℃后，加入38.8mM柠檬酸钠溶液，继续反应15min，反应时需不断匀速搅拌，观察颜色先变蓝后变红，冷却至室温，4℃冰箱保存备用；
步骤3：MoS2-GO纳米复合材料的水热法制备：在超声波作用下，将45mg GO粉末分散到60ml蒸馏水中，然后将0.5gNaMoO4和0.7g硫脲加入到上述悬浮液中混合，将均匀混合液转移到高压釜中，在230℃下反应24h，冷却至室温，离心收集黑色MoS2/GO，用蒸馏水和无水乙醇洗涤5次，最后在50℃下干燥一夜，备用；
步骤4：聚多巴胺的制备：往洁净的烧杯中加入8ml无水乙醇和18ml去离子水，随后加入550ul浓氨水（25wt%）；将所得的混合溶液在磁力搅拌器上搅拌25min后，缓慢加入2ml多巴胺溶液（50mg/ml）;随后，在常温下磁力搅拌反应25h。将所得溶液于8000rpm下离心5min后备用；
步骤5：核壳结构[email protected]2的制备：取0.80ml的巯基乙酸和55ml的去离子水混合均匀，然后再向其中加入45mL0.1M的氯化镉水溶液并搅拌均匀，用0.1M NaOH 溶液调节上述溶液pH到9.5，然后通入高纯氮气以除去溶液中的氧气，接着继续加入11ml 0.2M的NaHSe溶液并搅拌均匀，然后将反应前驱液在高纯氮气保护下75℃下反应4h，最后将亮黄色CdSeQDs溶液冷却至室温，离心清洗定容，加入10ml 步骤4制得的PDA，于30℃下充分结合2h，去离子水冲洗3min，加入到15ml的含10ul/mlAb2（羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体）的BSA溶液中，于30℃下孵育1h，去离子水冲洗3min，并置于4℃条件下保存备用；
步骤6：活化MoS2-GO/AuNPs/ITO电极：将180ul的巯基丙酸加入到步骤3 1ml MoS2-GO（5mg.ml-1）和步骤2 1ml AuNPs（0.35 ug/ml）悬浊液中，连续超声24h，离心收集羧基修饰的MoS2-GO/AuNPs，最后将羧基化的MoS2-GO/AuNPs分散到2ml CS（0.05wt%）溶液中，滴加15ul于ITO电极，室温下过夜，然后于70℃下干燥1h，最后把电极浸泡在1ml 0.05 M EDC/0.03 M NHS 的MES缓冲液中，并置于50℃的烘箱中孵育50min，将巯基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯，用0.01mol·L -1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净；
步骤7：ITO导电玻璃电极预处理：取面积为0.40cm2的ITO导电玻璃电极，分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗10min，在50℃烘箱中干燥过夜；
步骤8：构建间接型免疫探针：滴加5ul 1ul/ml的步骤1角蛋白CB液，使其端氨基与活化后的羧基结合，用PBS (pH=7.4)彻底清洗去除未结合的抗原后，再用10 ul 的1 % BSA在37 ℃下将电极封闭30 min，随后，用1%的BSA封闭1h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用0.01mol·L -1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加5ul 1ul/ml的角蛋白抗体（Ab1）溶液，置于30℃的烘箱中50min，用0.01mol·L -1磷酸缓冲溶液(PBS) (pH＝7.4)洗净未固定的Ab1(兔抗丝素蛋白抗体溶液)，最后滴加10ul的步骤5 [email protected]2，置于30℃的烘箱中50min，用0.01mol·L -1磷酸缓冲溶液(PBS) (pH＝7.4)洗净未固定的CdSeQDs [email protected]2，将电极置于检测底液为包含0.1M抗坏血酸（AA）的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol/L，pH7.4)，即完成了电化学免疫传感器的组装。
如图1所示为实施例1所得CdSeQDs的高分辨TEM图；图2为实施例1所得MoS2-GO的扫描电镜图（左）和透射电镜图（右）；图3为实施例1所得MoS2的扫描电镜图。
实施例2
步骤1：羊毛角蛋白的提取：取羊毛添加至乙醇中，搅拌2h后，用去离子水冲洗并烘干；取5g烘干的羊毛以1：19 的浴比添加至CB 9.6缓冲液中，加入1.2g亚硫酸钠，在60℃下反应30min，用去离子水冲洗4次烘干，取处理后的羊毛2g浸入20ml 1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐离子液体中，再加入23ml的二甲基亚砜，进行超声处理；向所得溶液中加入20ml1-烯丙基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液体，再加入23ml的二甲基亚砜，进行离心,速率为7500r/min，离心时间为11min，所得溶液用截留分子量为9000的纤维素透析袋在去离子水中透析2天，并每隔4h换一次水，将角蛋白溶液真空冷冻干燥2天，研磨，得到羊毛角蛋白；
步骤2：AuNPs的制备：取32ml 0.01%的HAuCl4溶液于100ml圆底烧瓶中，加热到温度稳定于100℃后，加入38.8mM柠檬酸钠溶液，继续反应18min，反应时需不断匀速搅拌，观察颜色先变蓝后变红，冷却至室温，4℃冰箱保存备用；
步骤3：MoS2-GO纳米复合材料的水热法制备：在超声波作用下，将50mg GO粉末分散到60ml蒸馏水中，然后将0.55gNaMoO4和0.73g硫脲加入到上述悬浮液中混合，将均匀混合液转移到高压釜中，在235℃下反应24h，冷却至室温，离心收集黑色MoS2/GO，用蒸馏水和无水乙醇洗涤6次，最后在55℃下干燥一夜，备用；
步骤4：聚多巴胺的制备：往洁净的烧杯中加入9ml无水乙醇和19ml去离子水，随后加入580ul浓氨水（26wt%）；将所得的混合溶液在磁力搅拌器上搅拌27min后，缓慢加入2ml多巴胺溶液（50mg/ml）;随后，在常温下磁力搅拌反应27h。将所得溶液于9000rpm下离心5min后备用；
步骤5：核壳结构[email protected]2的制备：取0.84ml的巯基乙酸和55ml的去离子水混合均匀，然后再向其中加入50mL0.1M的氯化镉水溶液并搅拌均匀，用0.1M NaOH 溶液调节上述溶液pH到10，然后通入高纯氮气以除去溶液中的氧气，接着继续加入12ml 0.2M的NaHSe溶液并搅拌均匀，然后将反应前驱液在高纯氮气保护下80℃下反应4h，最后将亮黄色CdSeQDs溶液冷却至室温，离心清洗定容，加入12ml 步骤4制得的PDA，于33℃下充分结合2h，去离子水冲洗4min，加入到18ml的含10ul/mlAb2（羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体）的BSA溶液中，于32℃下孵育1h，去离子水冲洗4min，并置于4℃条件下保存备用；
步骤6：活化MoS2-GO/AuNPs/ITO电极：将190ul的巯基丙酸加入到步骤3 1ml MoS2-GO（5mg.ml-1）和步骤2 1ml AuNPs（0.35 ug/ml）悬浊液中，连续超声24h，离心收集羧基修饰的MoS2-GO/AuNPs，最后将羧基化的MoS2-GO/AuNPs分散到2ml CS（0.05wt%）溶液中，滴加18ul于ITO电极，室温下过夜，然后于70-80℃下干燥1h，最后把电极浸泡在1ml 0.05 MEDC/0.03 M NHS 的MES缓冲液中，并置于55℃的烘箱中孵育60min，将巯基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯，用0.01mol·L -1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净；
步骤7：ITO导电玻璃电极预处理：取面积为0.40cm2的ITO导电玻璃电极，分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗15min，在55℃烘箱中干燥过夜；
步骤8：构建间接型免疫探针：滴加8 ul 1ul/ml的步骤1角蛋白CB液，使其端氨基与活化后的羧基结合，用PBS (pH=7.4)彻底清洗去除未结合的抗原后，再用13 ul 的1 %BSA在37 ℃下将电极封闭30 min，随后，用1%的BSA封闭1h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用0.01mol·L -1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加5ul 1ul/ml的角蛋白抗体（Ab1）溶液，置于30℃的烘箱中60min，用0.01mol·L -1磷酸缓冲溶液(PBS)(pH＝7.4)洗净未固定的Ab1(兔抗丝素蛋白抗体溶液)，最后滴加10ul的步骤5 [email protected]2，置于30℃的烘箱中60min，用0.01mol·L -1磷酸缓冲溶液(PBS) (pH＝7.4)洗净未固定的CdSeQDs [email protected]2，将电极置于检测底液为包含0.1M抗坏血酸（AA）的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol/L，pH7.4)，即完成了电化学免疫传感器的组装。
实施例3
步骤1：羊毛角蛋白的提取：取羊毛添加至乙醇中，搅拌3h后，用去离子水冲洗并烘干；取6g烘干的羊毛以1：20 的浴比添加至CB 9.6缓冲液中，加入1.4g亚硫酸钠，在65℃下反应35min，用去离子水冲洗5次烘干，取处理后的羊毛2.2g浸入22ml 1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐离子液体中，再加入25ml的二甲基亚砜，进行超声处理；向所得溶液中加入22ml 1-烯丙基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液体，再加入25ml的二甲基亚砜，进行离心，速率为8000r/min，离心时间为15min，所得溶液用截留分子量为10000的纤维素透析袋在去离子水中透析3天，并每隔5h换一次水，将角蛋白溶液真空冷冻干燥3天，研磨，得到羊毛角蛋白；
步骤2：AuNPs的制备：取34ml 0.01%的HAuCl4溶液于100ml圆底烧瓶中，加热到温度稳定于105℃后，加入38.8mM柠檬酸钠溶液，继续反应20min，反应时需不断匀速搅拌，观察颜色先变蓝后变红，冷却至室温，4℃冰箱保存备用；
步骤3：MoS2-GO纳米复合材料的水热法制备：在超声波作用下，将55mg GO粉末分散到60ml蒸馏水中，然后将0.6gNaMoO4和0.75g硫脲加入到上述悬浮液中混合，将均匀混合液转移到高压釜中，在240℃下反应24h，冷却至室温，离心收集黑色MoS2/GO，用蒸馏水和无水乙醇洗涤7次，最后在60℃下干燥一夜，备用；
步骤4：聚多巴胺的制备：往洁净的烧杯中加入10ml无水乙醇和20ml去离子水，随后加入600ul浓氨水（28wt%）；将所得的混合溶液在磁力搅拌器上搅拌30min后，缓慢加入2ml多巴胺溶液（50mg/ml）;随后，在常温下磁力搅拌反应30h。将所得溶液于10000rpm下离心5min后备用；
步骤5：核壳结构[email protected]2的制备：取0.88ml的巯基乙酸和65ml的去离子水混合均匀，然后再向其中加入55mL0.1M的氯化镉水溶液并搅拌均匀，用0.1M NaOH 溶液调节上述溶液pH到10.5，然后通入高纯氮气以除去溶液中的氧气，接着继续加入13ml 0.2M的NaHSe溶液并搅拌均匀，然后将反应前驱液在高纯氮气保护下85℃下反应4h，最后将亮黄色CdSeQDs溶液冷却至室温，离心清洗定容，加入15ml 步骤4制得的PDA，于30-35℃下充分结合2h，去离子水冲洗5min，加入到20ml的含10ul/mlAb2（羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体）的 BSA溶液中，于35℃下孵育1h，去离子水冲洗5min，并置于4℃条件下保存备用；
步骤6：活化MoS2-GO/AuNPs/ITO电极：将200ul的巯基丙酸加入到步骤3 1ml MoS2-GO（5mg.ml-1）和步骤2 1ml AuNPs（0.35 ug/ml）悬浊液中，连续超声24h，离心收集羧基修饰的MoS2-GO/AuNPs，最后将羧基化的MoS2-GO/AuNPs分散到2ml CS（0.05wt%）溶液中，滴加20ul于ITO电极，室温下过夜，然后于80℃下干燥1h，最后把电极浸泡在1ml 0.05 M EDC/0.03 M NHS 的MES缓冲液中，并置于60℃的烘箱中孵育70min，将巯基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯，用0.01mol·L -1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净；
步骤7：ITO导电玻璃电极预处理：取面积为0.40cm2的ITO导电玻璃电极，分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗20min，在50-60℃烘箱中干燥过夜；
步骤8：构建间接型免疫探针：滴加10 ul 1ul/ml的步骤1角蛋白CB液，使其端氨基与活化后的羧基结合，用PBS (pH=7.4)彻底清洗去除未结合的抗原后，再用15 ul 的1 %BSA在37 ℃下将电极封闭30 min，随后，用1%的BSA封闭1h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用0.01mol·L -1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加5ul 1ul/ml的角蛋白抗体（Ab1）溶液，置于30℃的烘箱中70min，用0.01mol·L -1磷酸缓冲溶液(PBS)(pH＝7.4)洗净未固定的Ab1(兔抗丝素蛋白抗体溶液)，最后滴加10ul的步骤5 [email protected]2，置于30℃的烘箱中50-70min，用0.01mol·L -1磷酸缓冲溶液(PBS) (pH＝7.4)洗净未固定的CdSeQDs [email protected]2，将电极置于检测底液为包含0.1M抗坏血酸（AA）的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol/L，pH7.4)，即完成了电化学免疫传感器的组装。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
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