一种铜纳米簇作为电化学信号探针的β-淀粉样蛋白寡聚体传感器
阅读说明：本技术 一种铜纳米簇作为电化学信号探针的β-淀粉样蛋白寡聚体传感器 (Beta-amyloid oligomer sensor with copper nanocluster as electrochemical signal probe ) 是由 周艳丽 吕玉冰 董辉 刘澜涛 徐茂田 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种铜纳米簇作为电化学信号探针的β-淀粉样蛋白(Aβ)寡聚体传感器,属于新型功能纳米复合材料及生物传感器检测技术领域。本发明以金纳米粒子修饰的垂直石墨烯/碳布膜作为基底电极,以聚胸腺嘧啶为模板原位合成铜纳米簇作为电化学信号探针。通过Au-S键将朊蛋白固定在基底电极表面,作为Aβ寡聚体的受体；核酸适配体-T30-铜纳米簇偶联物通过核酸适配体识别Aβ寡聚体后引入了铜纳米簇作为电化学信号探针。实验表明：该方法构建的电化学生物传感器灵敏度高、检测限低、特异性高且稳定性好,在人血清样本中的检测中表现出可行性,对阿尔茨海默病的早期诊断和治疗具有重要意义。(The invention relates to a beta-amyloid (Abeta) oligomer sensor with a copper nanocluster as an electrochemical signal probe, belonging to the technical field of novel functional nano composite materials and biosensor detection. According to the invention, a gold nanoparticle modified vertical graphene/carbon cloth membrane is used as a substrate electrode, and poly-thymine is used as a template to synthesize a copper nano-cluster in situ as an electrochemical signal probe. The prion protein is fixed on the surface of a substrate electrode through an Au-S bond and is used as a receptor of the Abeta oligomer; the aptamer-T30-copper nanocluster conjugate introduces the copper nanoclusters as electrochemical signaling probes after the aptamer recognizes A beta oligomers. Experiments show that: the electrochemical biosensor constructed by the method has high sensitivity, low detection limit, high specificity and good stability, shows feasibility in detection in human serum samples, and has important significance for early diagnosis and treatment of Alzheimer's disease.)
技术领域
本发明涉及一种用于超灵敏检测β-淀粉样蛋白寡聚体的电化学生物传感器及其制备方法，具体是以金纳米粒子修饰的垂直石墨烯/碳布作为基底电极，以聚胸腺嘧啶为合成模板的铜纳米簇作为信号探针，制得电化学传感器，属于生物传感和电分析化学检测技术领域。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)作为一种最常见的进行性神经退行性疾病，已经成为一个非常严重的社会健康问题。AD的病理特征是由β-淀粉样蛋白(Aβ)组成的细胞外斑块沉积所致。在Aβ的不同聚集状态中，小分子可溶性寡聚体是主要的神经毒性物质。因此Aβ寡聚体被认为是早期诊断AD的可靠分子生物标志物。
由于人体液中Aβ寡聚体的浓度极低，并且易形成非均相混合物，Aβ寡聚体的准确检测是一个很大的挑战。为了解决这些问题，提高分析性能，许多具有优异性能的新型功能纳米材料，如金属氧化物、碳纳米粒子、量子点和磁性纳米材料被引入到电化学、荧光、比色和其他分析方法中。特别是铜基材料因为价格合理，储量丰富，并且具有独特的电化学性质而被用作电化学传感器的电极修饰。尽管铜基金属有机骨架或氧化铜具有独特的电化学性质，信号转导仍然是铜基材料在电化学传感器构建应用当中的一个重要难题。因此，从铜基材料的设计和可控制备着手，构建高灵敏检测Aβ寡聚体的电化学传感器，实现体液中的Aβ寡聚体的检测对AD的早期诊断和病情控制具有重要的意义。
以聚胸腺嘧啶(聚T)为模板合成铜纳米簇过程简单，且合成的铜纳米簇具有荧光和电化学活性。另一方面，Aβ寡聚体的核酸适配体的成功筛选为Aβ寡聚体检测传感器的构建中检测的专一性提供了可能。核酸适配体是通过指数富集的方式在体外筛选而来，是由20～60个碱基组成的单链寡聚核苷酸。因此，通过核酸适配体的设计可以将聚T序列修饰其上，进一步以聚T为模板合成具有电化学活性的铜纳米簇，而连接的核酸适配体可以实现Aβ寡聚体的识别。
因此，尝试设计含有聚T修饰的核酸适配体，用于铜纳米簇的合成，将其用于检测Aβ寡聚体电化学生物传感中的信号放大，制备成具有高灵敏度、高选择性和高稳定性的电化学生物传感器对于理解Aβ寡聚体作为AD标志物的角色具有重要意义。
发明内容
基于现有技术，本发明提供了一种高灵敏、高选择性检测Aβ寡聚体传感器；另一目的在于提供其制备方法。
为实现本发明目的，本发明以金纳米粒子修饰的垂直石墨烯/碳布膜为基底电极，以原位合成的铜纳米簇为信号探针，构建了一种用于Aβ寡聚体超灵敏检测的双放大信号的电化学传感器。
具体采用以下技术方案：
(1)将洁净的垂直石墨烯生长的碳布浸入氯金酸溶液中进行恒电位电沉积，获得金纳米粒子修饰的垂直石墨烯/碳布薄膜并将之用作基底电极；
(2)将步骤(1)制得的基底电极浸入巯基化朊蛋白溶液中室温孵育，朊蛋白与金纳米粒子通过Au-S键进行结合后，用1-巯基己醇溶液对电极进行封闭，以消除非特异性结合位点；将制备好的修饰电极分别与不同浓度的Aβ寡聚体在室温下孵育，利用朊蛋白对靶标物质的特异性实现对Aβ寡聚体的特异性识别；
(3)室温条件下，将核酸适配体-T30与L-抗坏血酸充分混合，再加入CuSO4·5H2O溶液，室温避光搅拌，得核酸适配体-聚T-铜纳米簇偶联物溶液；
(4)将步骤(2)识别Aβ寡聚体后的电极与核酸适配体-聚T-铜纳米簇偶联物溶液共同孵育，通过核酸适配体与电极表面Aβ寡聚体的结合，将铜纳米簇引入到电极表面，制得Aβ寡聚体电化学传感器。
应用时进行差示脉冲伏安法测定，通过铜纳米簇的氧化还原峰电流改变值与Aβ寡聚体浓度的关系实现Aβ寡聚体的定量测定。优选在pH＝7.4的0.1mol·L-1磷酸盐缓冲溶液进行。
进一步的，步骤(1)所述金纳米粒子修饰垂直石墨烯/碳布，恒电位为-0.1V，时间为100s，氯金酸溶液浓度是20mmol·L-1。
进一步的，所述的Aβ寡聚体核酸适配体-T30的序列是GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCG-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT，朊蛋白的序列为：HS-ThrHisSerGlnTrpAsnLysProSerLysProLysThrAsnMetLys，利用两者与Aβ寡聚体的强相互作用和高特异性，可以提高对Aβ寡聚体检测的选择性。
进一步的，进行了实验条件的优化，步骤(3)进行铜纳米簇合成时铜粒子的浓度为0.5mmol·L-1；步骤(2)朊蛋白固定时的浓度为4μmol·L-1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明制备的金纳米粒子修饰的垂直石墨烯/碳布基底具有较大的表面积(平面电极的3倍)，从而促进了电子传导，提供放大的电化学信号。
(2)本发明以聚T为模板的铜纳米簇作为信号探针，可以实现二次信号放大，从而使检测具有良好的灵敏性。
(3)本发明利用朊蛋白及核酸适配体对Aβ寡聚体的高亲和力，使Aβ寡聚体可以高选择性地被捕获在夹心结构中，通过朊蛋白和核酸适配体对靶标分子的双重识别，保证了该传感策略的高特异性，避免使用昂贵的酶标抗体试剂。
(4)本发明电化学传感器采用柔性的碳布电极基底，易于微型化；且基底电极和铜纳米簇的电化学信号均具有很高的稳定性，使其具有高的重复性和稳定性。
(5)本发明电化学传感器实现了Aβ寡聚体的高灵敏、高选择性测定，检测限为3.5pmol·L-1，可用于人体血清中Aβ寡聚体的测定，对于AD的辅助诊断和治疗具有重要意义，是一种高灵敏度、高选择性和高稳定性的电化学生物传感器，具有很好的开发应用前景。
本发明涉及的Aβ寡聚体核酸适配体-T30的DNA序列及朊蛋白的氨基酸序列见序列表。
附图说明
图1是本发明技术路线图。
图2是本发明制备的铜纳米簇电化学探针的荧光光谱图(a)以及透射电镜图(b),其中a中(1)-(2)分别代表加入核酸适配体-聚T模板前后的荧光光谱曲线。
图3是本发明垂直石墨烯/碳布膜进行金纳米粒子修饰前后的扫描电镜。
图4是本发明传感器制备过程中阻抗及循环伏安表征图，(1)-(5)分别代表垂直石墨烯/碳布电极、金纳米粒子修饰的垂直石墨烯/碳布电极、固定朊蛋白后的电极、识别Aβ寡聚体的电极及铜纳米簇引入后的电极。
图5是本发明传感器对Aβ寡聚体的响应：A为测定的微分脉冲伏安曲线图；B为电流改变值随浓度变化的标准曲线；C为本发明电化学传感器的选择性图，(1)-(7)分别代表Aβ寡聚体、空白、Aβ纤维、Aβ单体、胰岛素、人肿瘤坏死因子及C-反应蛋白；D为本发明电化学传感器的稳定性：(1)-(2)分别代表进行放置两周前后的响应。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，以下实施例仅用于说明本发明，但不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1基于Au-VG/CC基底和聚T模板CuNPs双重信号放大策略检测Aβ寡聚体的核酸适配体电化学传感器的制备方法
(1)金纳米粒子在垂直石墨烯/碳布电极上的沉积：将清洁的垂直石墨烯/碳布膜浸泡在5mL 20mmol·L-1氯金酸溶液中，在-0.1V恒定电位下电沉积100s获得金纳米粒子修饰的垂直石墨烯/碳布电极。
(2)朊蛋白的固定及Aβ寡聚体的识别：将金纳米粒子修饰的垂直石墨烯/碳布电极与10μL的4μmol·L-1HS-PrPC溶液共同孵育6h，然后用4mmol·L-1 1-己硫醇溶液封闭电极表面20min，制备得到朊蛋白修饰的传感器。将修饰的传感器与含有不同浓度的Aβ寡聚体共同孵育4h，然后用纯水冲洗电极。
(3)探针分子的制备及引入：室温下，将25μL的100μmol·L-1的核酸适配体-T30和25μL的300mmol·L-1抗坏血酸充分混合后，再加入2.5μL的500mmol·L-1CuSO4·5H2O溶液。避光搅拌5min后制得核酸适配体-聚T-铜纳米簇生物偶联物。将制备的溶液在pH＝7.6的MOPS缓冲溶液中稀释40倍，用Agilent Technologies的Cary Eclipse荧光分光光度计测定其荧光光谱。石英比色计的光程长度、激发波长、发射光谱记录范围、激发狭缝和发射狭缝分别设置为5nm、1.0cm、345nm、550nm和5nm。将溶液与步骤(2)识别Aβ寡聚体后的电极共同孵育，制得Aβ寡聚体电化学传感器。
应用例1本发明核酸适配体电化学传感器对Aβ寡聚体的测定
电位测试采用三电极体系，以本发明修饰后的电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极。在0.1mol·L-1磷酸盐(pH＝7.4)缓冲溶液中，在脉冲幅值为0.004V、脉宽为0.1μs、采样宽度为0.0167μs的条件下，在0.4V～-0.2V范围内用差示脉冲伏安法记录传感器的伏安响应信号，通过测定不同浓度Aβ寡聚体标准溶液，计算加入Aβ寡聚体后探针分子铜纳米簇的峰电流与空白溶液电流的改变值，以电流改变值-浓度绘制标准曲线。该电流改变值(ΔI)Aβ寡聚体的浓度(C)在10～2200pmol·L-1的范围内成正比，相关系数R2为0.998，检测限为3.5pmol·L-1。说明此电化学型传感器用于Aβ寡聚体的测定具有高的灵敏度。
实际血清样品测定时，根据电流改变值，基于上述线性方程，确定所述人体血清中Aβ寡聚体的浓度，从而实现定量检测。
应用例2本电化学传感器性能考察
为了研究本发明传感器的稳定性，用同一传感器对2.5nmol·L-1的Aβ寡聚体进行了7次重复测量，其电流响应的相对标准偏差值为4.8％。用6个独立的传感器检测Aβ寡聚体进行了重复性试验，相对标准偏差值为2.6％。为了研究电化学测定的长期稳定性，通过检测在4℃冰箱中存放2周后的伏安响应变化，伏安响应保持了初始信号响应的91.8％。结果表明，由于底物电极的稳定性和生物相容性的微环境，该方法具有较好的稳定性。此外，利用铜纳米簇的电化学信号代替了不稳定的荧光发射信号，保证了长时间、稳定的检测应用。
为了评价该传感器对Aβ寡聚体的特异性，对潜在干扰物质包括Aβ单体、Aβ纤维体以及血清中三种具有代表性的干扰物质肿瘤坏死因子-α、胰岛素和C-反应蛋白进行了检测,在干扰物质存在时，与目标物Aβ寡聚体相比，其他干扰物电化学信号非常低，表明PrPC与上述其他底物没有明显的结合。这种良好的特异性可能是由于Aβ寡聚体与PrPC和核酸适配体之间的特异性识别特性所致。
应用例3血清样品中Aβ寡聚体的测定
为评价电化学传感器检测Aβ寡聚体的实用性，对人血清样品进行检测，并对健康人和AD患者的血清样品用标准加入法检测回收率。如表1所示，2例健康人(样本1、2)和2例AD患者(样本3、4)血清中Aβ寡聚体浓度分别为72、68、97、90pmol·L-1，与文献中人血清Aβ寡聚体水平一致。当Aβ寡聚体的加入量分别为100、500、1000pmol·L-1时，回收率在93％～108％之间，相对标准偏差小于7％。这些结果表明该电化学传感器具有良好的准确性，在临床诊断中具有实际应用潜力。
表1.人血清样品中Aβ寡聚体的测定
序 列 表
< 110> 商丘师范学院
<120>一种铜纳米簇作为电化学信号探针的β-淀粉样蛋白寡聚体传感器
<160> 2
<210>1
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>核酸适配体-T30
<400> 1
gcctgtggtg ttggggcggg tgcgtttttt tttttttttt tttttttttt tttt 54
<210>2
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>朊蛋白
<400>2
Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
1 5 10 15
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