含锶的饮用水及其用途

文档序号:56669 发布日期:2021-10-01 浏览:23次 >En<

阅读说明:本技术 含锶的饮用水及其用途 (Drinking water containing strontium and use thereof ) 是由 阮国洪 于 2021-08-04 设计创作,主要内容包括:本发明公开了含锶的饮用水及其用途,所述饮用水由纯水和锶配制而成,饮用水中锶浓度为0.1-5.0mg/L,含锶的饮用水用于制备抗氧化药物,所述药物用于增强增心脏SOD酶、肾脏CAT酶以及肝脏SOD和GSH-Px酶活性,从而增加相应脏器中NDA~(+)的合成;所述药物用于增加肾脏、肝脏以及心脏中NAMPT、NMNAT1含量,进而增强机体抗衰能力。(The drinking water is prepared from pure water and strontium, the concentration of strontium in the drinking water is 0.1-5.0mg/L, the drinking water containing strontium is used for preparing antioxidant drugs, and the drugs are used for enhancing the activities of heart-increasing SOD enzyme, kidney CAT enzyme, liver SOD and GSH-Px enzyme, so as to increase NDA in corresponding organs &#43; Synthesizing; the medicine is used for increasing the NAMPT and NMNAT1 content in kidney, liver and heart, and further enhancing the anti-aging capability of organism.)

含锶的饮用水及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域,具体涉及含锶的饮用水及其用途。

背景技术

锶是一种天然存在的碱土金属,有调查研究发现长寿乡饮用水锶平均浓度(0.73mg/L)明显高于非长寿乡饮用水锶平均浓度(0.44mg/L)。我国存在着明显的区域长寿现象,多位于华南地区。Du Y等研究发现华南长寿地区饮用水中锶浓度为82.1μg/L,而中国南方和华北非长寿地区饮用水中锶浓度分别为7.45μg/L和748.65μg/L,可见,饮用水中适宜的锶浓度才能较为有效的起到延长寿命的作用。但是关于饮水锶在抗衰老和延长寿命方面的作用机制目前国内外鲜有相关的动物研究报道,水中的锶元素是否起到延长寿命的作用?若是,是否存在剂量效应?又对生物体存在怎样的调控作用?有待研究探明。

谈寿命离不开衰老,谈衰老离不开抗氧化。活性氧(ROS)是活细胞产生的正常细胞代谢副产物,适量的ROS具有积极的作用,包括杀死入侵的病原体,伤口愈合和修复过程。过量的ROS暴露会破坏氧化还原稳态,导致氧化应激和ROS介导的重要细胞器和生物分子如DNA和蛋白质的损伤。氧化应激被认为是在各种信号和病理生理情况下促进细胞死亡的重要因素。因此,细胞已经进化出一个平衡的系统来中和多余的ROS,即由酶性抗氧化剂如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、硫氧还蛋白(Trx)以及共同降低氧化状态的非酶性抗氧化剂组成的抗氧化系统。

衰老的核心机制是细胞基因受损和线粒体能量生成减少,导致细胞提前凋亡或者活力下降,NMN是人体固有的代谢产物,它可以直接转换为关键性辅酶NAD+。因NAD+是人体近一半代谢活动不可或缺的物质,但随年龄增长而快速下降。

蚤状溞是水蚤中较为优势的一个种类,水蚤对多种有毒物质敏感,是国际公认的标准毒性实验生物,水环境监测中常用的无脊椎动物。目前水蚤多被用以进行水质毒性污染监测,但未见使用水蚤进行饮用水营养功能评价的研究报道,由于其繁殖能力较强,对水质敏感,加上生存期仅1-3月不等,远短于小鼠等其他哺乳动物的寿命。故使用蚤状溞为生物模型探究水质及水中矿物元素锶对其生存期及酶性抗氧化系统的影响,再进一步使用ICR级小鼠进行饮水锶抗衰机制的探究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含锶的饮用水,并研究含锶的饮用水对机体抗衰的调控作用,为长寿水的研发提供理论指导,为人类长寿机制的研究提供科学理论基础。

为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:

通过观察蚤状溞在五种饮用水(纯水、自来水、富氢水、过滤水、某品牌矿泉水)中的生存期,并测定五种饮用水的水质指标及常见金属元素的含量,分析发现饮用水中对生存期有影响的矿物质锶。

采用纯水和锶配制含锶的饮用水,饮用水中锶浓度为0.1-5.0mg/L。

以蚤状溞为生物模型,研究不同浓度锶(0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、1.6mg/L、2.0mg/L)对生存期的影响及其相关影响机制。结果显示,水中0.1mg/L、0.2mg/L和0.4mg/L锶能够显著延长蚤状溞生存期,其中0.4mg/L锶浓度组蚤状溞生存期最长。2.0mg/L以内的锶浓度未缩短蚤状溞生存期,提示无显著毒性作用。水中0.1mg/L-0.8mg/L的锶浓度干预至蚤状溞7日龄、14日龄、21日龄时可显著增强其CAT、GSH-Px酶活性以及抑制羟自由基能力,并不同程度地调控蚤状溞SOD酶活性,可能从而增强其抗氧化能力,进而起到延缓衰老,延长寿命的作用。

通过饮水锶对小鼠体内抗氧化系统的影响,研究锶对小鼠的抗衰老机制。结果显示含锶的饮用水可增强心脏SOD酶活性,增强肾脏CAT酶活性以及肝脏SOD和GSH-Px酶活性,从而可能提高机体抗氧化能力,减少ROS的积聚,使Bcl-2/Bax比值保持较高状态,进而减少caspase-3的活化,降低细胞发生凋亡的概率,可能延长细胞寿命。且饮水锶在一定程度上增加了组织中NAMPT和NMNAT1的含量,可能促进NAD+的合成。通过以上综合调控作用,并结合水中锶延长蚤状溞生存期的观察结果猜测饮水锶可能延长小鼠甚至人类寿命。

附图说明

图1为不同浓度饮水锶干预下小鼠体重变化趋势;

注:*表示相较于PWC组差异有统计学意义(P<0.05,n=20)。

图2为不同浓度饮水锶对小鼠饮食量(A)和饮水量(B)的影响;

注:“&”表示与0.5mg/L浓度组的差异具有统计学意义(P<0.05,n=20);“#”表示与5.0mg/L的差异具有统计学意义(P<0.05,n=20)。

图3为饮水锶对小鼠脏器系数的影响;

注:“*”表示与PWC组相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=10)。

图4为饮水锶对小鼠血清抗氧化指标的影响

注:“*”表示与PWC组相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=6);“&”表示与0.5mg/L锶浓度组相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=6);“▲”表示与2.5mg/L浓度锶浓度组相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=6)。

图5为饮水锶对小鼠各脏器T-AOC的影响;

图6为饮水锶对小鼠各脏器羟自由基清除能力的影响;

图7为饮水锶对小鼠各脏器SOD活性的影响;

图8为饮水锶对小鼠各脏器GSH-Px活性的影响;

图9为饮水锶对小鼠各脏器POD活性的影响;

图10为饮水锶对小鼠各脏器CAT活性的影响;

图11为饮水锶对小鼠各脏器MDA含量的影响;

注:图3-5至图3-11中,“*”表示与PWC组相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=6);“&”表示与0.5mg/L锶浓度组相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=6);“▲”表示与2.5mg/L浓度锶浓度组相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=6)。

图12为饮水锶对小鼠各脏器CAT基因mRNA表达水平的影响;

图13为饮水锶对小鼠各脏器Mn-SOD基因mRNA表达水平的影响;

图14为饮水锶对小鼠各脏器GSH-Px1基因mRNA表达水平的影响;

图12至图14中,“*”表示与PWC组相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=6);“&”表示与0.5mg/L锶浓度组相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=6);“▲”表示与2.5mg/L浓度锶浓度组相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=6)。

图15为饮水锶对小鼠凋亡相关蛋白表达量的影响;

注:“*”表示与PWC组相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=3);“&”表示与0.5mg/L锶浓度组相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=3)。

图16为饮水锶对各脏器NAMPT(A)和NMNAT1(B)含量的影响;

注:“*”表示与PWC组相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=6);“&”表示与0.5mg/L锶浓度组相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=6);“▲”表示与2.5mg/L浓度锶浓度组相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=6)。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1水中长寿元素锶及其对蚤状溞生存期的影响

1、实验用水

纯水:由福建医科大学CPB-PLUS型直供式实验室纯水系统(福州东泽医疗器械有限公司)制备,电导率≤5μs/m。

矿泉水:市售某品牌矿泉水。

过滤水:自来水流经福建金源泉科技发展有限公司产净水机过滤制得,该净水机含有5个滤芯,即聚丙烯熔喷滤芯、陶瓷复合滤芯、压缩活性炭滤芯、复合滤芯和压缩活性炭滤芯,滤芯按净水机使用说明定期更换。设组前烧开放凉。

自来水:由福州市政供水系统提供的管道水,采样地点为福建医科大学公共卫生学院506实验室,采样前打开水龙头放水流10min左右,把管道存水流掉后进行取样,并用热水壶烧开放凉后使用。

富氢水:纯水烧开放凉后于福建品行科技发展有限公司产(PX-HO2型)富氢水杯制得。

2、实验方法

2.1蚤状溞生存期观察分组与处理

2.1.1五种饮用水对蚤状溞生存期的影响

将同期出生的幼溞随机分为纯水组(PWC)、矿泉水组(MW)、自来水组(TW)、富氢水组(HW)、过滤水组(FW),每组100mL对应饮用水且置40只蚤状溞,以对应受试水作为唯一培养水源。空调控制各组培养温度于16℃~25℃,间隔24h喂食10ml酵母培养液(30ml/L,使用对应受试水作为溶剂配置)并观察记录存活溞数,死亡及新繁殖的幼溞用一次性吸管吸出。

2.1.2水中锶对蚤状溞生存期的影响

以氯化锶和纯水配置不同浓度锶溶液(0mg/L、0.5mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L),设置不同锶浓度组,每组100mL对应浓度锶溶液且置40只幼溞。空调控制各组培养温度于16℃~25℃,间隔24h喂食10mL酵母培养液(30ml/L,使用纯水溶剂配置)并观察记录存活溞数,死亡及新繁殖的幼溞用一次性吸管吸出。

2.2受试水水质参数测定

每种饮用水分别采集水样10件,每件量筒准确量取100mL,用多功能水质分析仪进行测定,检测指标包含:pH值、溶解性总固体(total dissolved solids,TDS)、氧化还原电位(oxidation-reduction potential,ORP)。偏硅酸测定采用硅钼黄分光光度法。主要元素测定为每种饮用水采样10件,采用电感耦合等离子体质谱法进行检测。

3、实验结果

实验结果显示五个饮用水组中蚤状溞寿命存在一定程度的差异,MW组中蚤状溞生存期最长,HW组与FW组次之,PW组与TW组蚤状溞生存期最短。可初步判断不同水质对蚤状溞生存期存在影响,其中矿泉水水质极大延长了蚤状溞生存期。水质分析结果可见相较其它四类饮用水,某品牌矿泉水总溶解固体含量最多,达到500mg/L以上,元素分析结果可见锶元素含量呈现明显的优势,高达451.32μg/L。有研究发现我国长寿乡饮用水中锶元素显著高于非长寿乡,与上述研究结果相符。为印证锶是否作为主要长寿元素促使某品牌矿泉水极大延长了蚤状溞生存期且是否存在剂量效应,本发明接着使用蚤状溞为研究生物,通过前期预实验以及考虑到蚤状溞对水环境较为敏感设置了锶浓度间隔较窄的九个组:纯水对照组、自来水对照组、0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、1.6mg/L、2.0mg/L。设置自来水对照组以排除可能存在的纯水组缩短蚤状溞生存期而造成锶浓度组延长其生存期的错误判断;设置同样浓度梯度的氯化钠浓度组,以排除氯化锶中氯离子的干扰。

研究结果表明纯水与自来水对照组间生存期差异无统计学意义;0.4mg/L锶浓度组中蚤状溞生存期最长;0.1mg/L和0.2mg/L低锶浓度组中蚤状溞生存期长于纯水组,短于0.4mg/L浓度组;0.8mg/L、1.0mg/L、1.6mg/L、2.0mg/L锶浓度组对蚤状溞生存期无显著延长作用,与对照组相比无显著差异。

综上所述,水中0.1mg/L、0.2mg/L、和0.4mg/L锶能够显著延长蚤状溞生存期,其中0.4mg/L锶浓度组蚤状溞生存期最长。2.0mg/L以内的锶浓度未缩短蚤状溞生存期,提示无显著毒性作用。

实施例2水中锶对蚤状溞抗氧化能力的影响

1、实验方法

1.1生物模型的建立

将同期出生的幼溞随机分为纯水组与不同锶浓度组(0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L),锶溶液均用SrCl2和纯水配置。每组置100mL对应锶溶液与40只幼溞于培养皿中,同上述操作每个浓度组设12个平行的培养皿,使每组溞数达到480只,以保证7、14、21三个日龄抗氧化指标测定所需的样本量。空调控制各组培养温度于16℃~25℃之间,每隔24h喂食10ml酵母培养液(30ml/L)并观察记录蚤状溞存活数,死亡以及新繁殖的幼蚤用一次性吸管吸出。

1.2标本的收集与保存

1.2.1蚤状溞体长与心率测定标本的收集

各组于设组7日、14日、21日、28日分别取8只健康蚤状溞于待测皿中当日完成测定。

1.2.2抗氧化指标测定标本收集与保存

分别于设组7、14、21日后各组吸取100只蚤状溞,用蒸馏水清洗三遍后,在电子天平上称其重量,根据指标测定说明书加入一定量的生理盐水,在组织破碎仪上进行匀浆。匀浆后离心,取上清液,分装在数支1.5ml离心管中,于-80℃环境中保存备用。

1.3蚤状溞心率的测定

取待测样本,逐只置于显微镜下,能明显看见心脏搏动部位,使用录像工具录下十秒的心率,放慢播放倍速数下十秒心脏跳动次数最终得到心率(次*min-1)。

1.4蚤状溞体长的测定

待心率测完之后将平皿中的水吸干,于显微镜下测量蚤状溞头部至腹部最低平行处即为体长。

1.5抗氧化指标的测定

取匀浆离心处理完冻于-80℃的样本,冰上融化,按照试剂盒说明书,分别检测其T-AOC、抑制羟自由基能力、抑制超氧阴离子能力、抗氧化酶SOD、CAT、POD、GSH-Px的活性;以及MDA、H2O2的含量,并进行总蛋白浓度的测定,最后按照试剂盒说明书计算。

3、实验结果

水中2.0mg/L浓度以内的锶含量对七日幼龄蚤状溞的体长无显著影响,一方面可能由于七天的干预时间较短,一方面可能由于七日龄幼溞尚未处于主要生长发育阶段,所以导致组间未表现出显著差异。随着蚤状溞日龄的增加,锶对其体长的影响逐渐显现,在14日龄时0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L锶浓度组体长显著高于纯水对照组,促进了蚤状溞的生长,其中0.4mg/L锶浓度组体长最长,与实施例1研究中已发现的0.4mg/L锶浓度组蚤状溞生存期最长相符,说明水中0.4mg/L锶含量可能最适合蚤状溞生存。实施例1研究结果显示某品牌矿泉水中锶浓度为0.45mg/L左右,与0.4mg/L接近。21日龄之后蚤状溞开始进入衰老阶段,此时锶干预21天,0.2mg/L与0.4mg/L锶浓度组溞体长仍然长于PWC组。28日龄时,0.1mg/L-0.8mg/L四个锶浓度组溞体长均长于PWC组。上述结果可见水中一定浓度锶可在蚤状溞发育期促进其生长,衰老期时在一定程度上保持其体长,减轻形体的萎缩。心脏是维持机体正常运转的重要器官,心率评估则一直被用作健康的标志。实验结果显示7日龄时0.1mg/L和较高浓度的0.8mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L锶浓度组蚤状溞心率显著低于PWC组,0.2mg/L、0.4mg/L锶浓度组心率与PWC组相比无显著差异,且14日龄、21日龄、28日龄时各组中蚤状溞心率组间差异均无统计学意义,因此提示锶元素可能对蚤状溞心脏功能的影响不显著。

活性氧(ROS)是一类化学性质活泼,具有较高氧化活性的分子或离子的总称。主要包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基、一氧化氮等。细胞对ROS十分敏感,过量的ROS会对蛋白质、核酸和脂质等生物大分子造成损伤,从而影响其正常的生理功能。生物体存在清除ROS的体系,包括酶性抗氧化剂如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化物酶(POD)等和非酶性抗氧化剂如维生素E等。本实施例研究测定了锶干预7日、14日、21日三个日龄蚤状溞的总抗氧化能力(T-AOC)、抑制羟自由基能力、抑制超氧阴离子能力,测定了CAT、SOD、GSH-Px、POD四种主要抗氧化酶的活性,以及测定MDA和H202的含量来反映水中锶对蚤状溞抗氧化能力的影响。

结果显示,干预至蚤状溞7日龄时,0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、1.0mg/L锶浓度组中溞T-AOC显著高于PWC组,0.4mg/L锶浓度组SOD酶活性显著高于PWC组,0.2mg/L与2.0mg/L锶浓度组的POD酶活性显著高于PWC组,0.4mg/L锶浓度组POD酶活性显著低于PWC组,0.1mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L锶浓度组中溞MDA含量显著低于PWC组。干预至蚤状溞14日龄时,0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L锶浓度组中溞T-AOC显著高于PWC组,而1.0mg/L锶浓度组中溞T-AOC显著低于PWC组,0.1mg/L-0.8mg/L四个锶浓度组中溞SOD酶活性均显著高于PWC组,各锶浓度组蚤状溞MDA含量均显著低于PWC组,0.2mg/L锶浓度组中蚤状溞POD酶活性显著高于PWC组,0.1mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L锶浓度组中蚤状溞POD酶活性与PWC组相比无显著差异,1.0mg/L和2.0mg/L锶浓度组POD酶活性显著低于PWC组。干预至21日龄时,0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L锶浓度组中蚤状溞T-AOC显著高于PWC组,0.1mg/L、0.2mg/L、0.8mg/L锶浓度组中蚤状溞SOD酶活性显著高于PWC组,0.4mg/L与2.0mg/L锶浓度组蚤状溞POD酶活性显著高于PWC组,而0.8mg/L锶浓度组中POD酶活性显著低于PWC组,各锶浓度组MDA含量均显著低于PWC组。另外,0.1mg/L-0.8mg/L四个锶浓度组干预至蚤状溞7日龄、14日龄、21日龄时与PWC组相比均显著增强了蚤状溞CAT和GSH-Px的酶活性。各锶浓度组在干预至蚤状溞7、14、21日龄时与PWC组相比均显著增强了溞的抑制羟自由基能力。综合以上反映抗氧化功能的指标测定结果,提示水中锶可能通过增强蚤状溞各个生命阶段机体中CAT、GSH-Px、SOD酶活性,增强其抗氧化能力,进而起到延缓衰老,延长寿命的作用,且结果提示锶对蚤状溞抗氧化能力的影响存在剂量效应,水中0.1mg/L-0.8mg/L锶含量影响作用显著。体内抗氧化酶的合成以氨基酸作为主要原料,但同样需要矿物元素参与,在蛋白浓度测定结果中发现0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L锶浓度干预至14日龄时蚤状溞蛋白浓度均显著高于PWC组,0.1mg/L-0.8mg/L锶浓度组干预至蚤状溞21日龄时其蛋白浓度亦显著高于PWC组,说明水中锶尚且影响蚤状溞体内蛋白的合成,抗氧化酶也属于蛋白质,锶元素可能作为CAT、GSH-Px、SOD酶合成原料参与酶的合成,进而影响抗氧化酶的含量从而使单位蛋白中酶活性增加。

综上所述,水中锶可通过调控蚤状溞抗氧化酶活性延缓衰老进程,进而可能延长蚤状溞寿命,水中0.1mg/L-0.8mg/L范围的锶含量作用显著。

实施例3饮水锶对小鼠抗氧化系统的影响

1、实验方法

1.1动物模型的建立

80只3周龄小鼠适应性喂养1W后,按体重随机分为4组:纯水对照组,0.5mg/L低剂量锶浓度组,2.5mg/L中剂量锶浓度组,5.0mg/L高剂量锶浓度组。在饲养期间各组分别给予对应浓度锶溶液进行饮水。每组20只,雌雄各半,雌雄分笼饲养,每笼置5只小鼠。每两天换一次水、饲料及垫料,并且记下初始放置饲料量,水量以及余饲料量、余水量。初设组时称量每只小鼠体重,之后每周称一次体重。持续饲养两个月。

2.2标本的收集与保存

血清:两个月后,对小鼠进行眼球静脉取血,全血室温下放置30min-60min后以3500rpm 4℃离心15min,取上清,于-20℃冰箱保存。

标本采集:处死小鼠,取出肝脏、肾脏、心脏在生理盐水中浸润洗去血渍,用滤纸吸干水分之后称重。用于计算小鼠脏器系数,计算方法为:脏器指数=脏器重量(g)/体重×100%。

肝匀浆:选取部分肝脏用冷生理盐水漂洗去除积血,拭净后称重,按1:9(g/mL)比例加入试剂盒配备的提取液,用玻璃匀浆器于冰水混合物中研磨制备肝匀浆,匀浆至肉眼不见纤维颗粒,然后8000rpm,4℃离心10min,吸取上清液保存于-80℃冰箱,用于肝脏抗氧化指标测定。

用于心脏、肾脏抗氧化指标测定的组织匀浆处理同上述肝匀浆。

RT-PCR法检测基因表达:取部分肝脏、肾脏、心脏迅速于液氮冷冻后存于-80℃冰箱。

Elisa法检测NDA+合成相关酶:取部分肝脏、肾脏、心脏迅速于液氮冷冻后存于-80℃冰箱。

Western-blot法测定蛋白质表达:剪取部分肝脏组织迅速于液氮冷冻后存于-80℃冰箱。

2.3抗氧化指标的测定

包括T-AOC测定、羟自由基抑制率测定、四个抗氧化酶活性(SOD酶、CAT酶、POD酶、GSH-Px酶)的测定、MDA含量测定

2.4实时荧光定量PCR法检测抗氧化相关基因mRNA的表达量

2.5蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达量

2.6酶联免疫分析法检测NDA+合成相关酶的含量

3、实验结果

本实施例以小鼠为实验模型,三周龄开始进行实验干预,干预方式为让其自然饮用不同浓度含锶水,模仿正常状态下饮水锶对机体的影响,干预时间为两个月。我国饮用天然矿泉水标准规定锶的限量值为5.0mg/L,作为饮水中锶浓度组设置的依据,设0.5mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L三个低、中、高浓度组,以及纯水对照组(PWC)。

结果显示小鼠饲喂8周后,出现5.0mg/L锶浓度组体重显著低于PWC组,饲喂期间各锶浓度组与PWC组比较平均每日每只小鼠饮食饮水量均无显著差异,但5.0mg/L锶浓度组饮食量显著低于0.5mg/L和2.5mg/L锶浓度组,可能因为较长时间的高锶饮水使小鼠食欲减退,导致体重有所减轻。三个锶浓度组平均每日每只小鼠饮水量与PWC组相比无显著差异,在一定程度上排除了饮水量差异导致的锶摄入量差异,使后续各锶浓度组与PWC组结果的比较更具可靠性。脏器系数一般用来衡量和反映动物各脏器的功能状态。在脏器系数结果中各组肝脏系数和肾脏系数均无显著差异,2.5mg/L锶浓度组的心脏系数显著低于PWC组,其余组间心脏系数均无显著差异,说明2.5mg/L锶浓度组小鼠心脏功能可能受到显著影响(图1-图3)。

小鼠体内过量的ROS暴露会破坏氧化还原稳态,导致氧化应激和ROS介导的重要细胞器和生物分子如DNA和蛋白质的损伤,并且会导致癌症、糖尿病、心脏疾病、神经衰退等损伤。体内抗氧化酶系统在清除多余ROS,保护机体抵抗氧化损伤中起重要作用,CAT、SOD、GSH-Px、POD是生物体中主要的抗氧化酶,其中SOD主要清除体内超氧阴离子,CAT、GSH-Px、POD主要清除H2O2。MDA是细胞膜发生脂质过氧化反应的主要终末产物,其在细胞中的含量高低可反映机体脂质过氧化的程度,间接的反映机体受ROS攻击的严重程度,从而间接反映机体清除ROS水平。

如图4,小鼠血清中各抗氧化指标结果显示2.5mg/L锶浓度组T-AOC显著高于PWC组,且显著高于0.5mg/L和2.5mg/L锶浓度组,居首位,而5.0mg/L锶浓度组显著低于其余各组。说明2.5mg/L锶浓度组增强了小鼠血清中的总抗氧化能力,而5.0mg/L高锶浓度组可能存在某种毒性效应导致小鼠血清中T-AOC降低。此外,5.0mg/L锶浓度组小鼠的血清抑制羟自由基能力亦显著弱于其余三组,与T-AOC结果相符,但脂质过氧化产物MDA含量却显著低于其余三组,反而0.5mg/L锶浓度组MDA最高。体内MDA不仅通过脂质过氧化产生,如脂肪氧化酶催化其它反应也会产生MDA,出现上述较为矛盾结果提示饮水中锶元素可能不仅影响小鼠的抗氧化能力,还存在其它通路的作用,有待进一步探究。另外,研究结果表明各组小鼠血清中CAT和SOD酶活性无显著差异。

如图5-11之一所示,研究中分析了各组小鼠心脏、肝脏、肾脏抗氧化指标,结果显示小鼠三种脏器中各组T-AOC和羟自由基清除率均无显著差异。结果显示小鼠心脏组织中,0.5mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L锶浓度组SOD酶活性显著高于PWC组,而各组GSH-Px、POD酶、CAT酶活性无显著差异,5.0mg/L锶浓度组MDA含量显著高于PWC组。在肾脏组织中,2.5mg/L、5.0mg/L锶浓度组CAT酶活性显著高于PWC组,而各组SOD、GSH-Px和POD酶活性均无显著差异,各组MDA含量无显著差异。在肝脏组织中,0.5mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L锶浓度组SOD酶活性均显著高于PWC组,5.0mg/L锶浓度组GSH-Px酶活性显著高于PWC组,各组POD和CAT酶活性无显著差异,0.5mg/L、5.0mg/L锶浓度组MDA含量显著低于PWC组。综上,饮水锶对小鼠不同脏器中抗氧化酶活性的调控作用存在差异,主要调控小鼠心脏中SOD酶活性,肾脏中CAT酶活性以及肝脏中SOD和GSH-Px酶活性。0.5mg/L和5.0mg/L锶浓度组中肝脏MDA含量降低,而5.0mg/L饮水锶干预使心脏MDA含量升高,说明饮水锶主要增强肝脏的抗氧化水平,对其保护作用最为明显。

根据分子中所含的金属辅基不同,SOD可分为Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD和Ni-SOD,其中Mn-SOD更易受外界因素影响。GSH-Px主要包括4种,分别为胞浆GSH-Px(GSH-PX1)、血浆GSH-Px、磷脂氢过氧化物GSH-Px及胃肠道专属性GSH-Px。根据上述三种脏器抗氧化酶活性结果,取小鼠心脏、肾脏、肝脏组织分别测定CAT、Mn-SOD、GSH-Px1三种酶基因的mRNA相对表达量。如图12-14所示,结果发现0.5mg/L饮水锶在心、肾、肝脏中均未影响CAT、Mn-SOD、GSH-Px基因的mRNA表达;2.5mg/L饮水锶上调了心脏Mn-SOD和GSH-Px基因mRNA的表达,下调了肾脏中GSH-Px基因mRNA的表达;5.0mg/L饮水锶下调了心脏中Mn-SOD酶基因和肾脏中GSH-Px基因mRNA的表达。结合三种脏器抗氧化酶活性变化结果提示饮水锶未通过影响抗氧化酶基因mRNA的表达而影响酶活性,可能存在其它通路作用影响了酶活,具体分子机制尚不清楚。

细胞对ROS十分敏感,若脂类脂肪酸被ROS破坏,原生质膜很可能不再完整,从而导致细胞内部受到损害和细胞信号转导机制被搅乱,当这样的破坏发生在线粒体,受损的线粒体会加剧ROS积累,最终激活线粒体凋亡途径,诱发凋亡。细胞凋亡是严格由Bcl-2家族成员(Bcl-2和Bax)和caspase家族成员控制的,Bcl-2对细胞凋亡起抑制作用,Bax对细胞凋亡起促进作用,当Bax/Bcl-2比率不平衡将启动细胞凋亡的过程。bcl-2高表达时,bax/bax二聚体大量解离,生成更为稳定的bcl-2/bax异源二聚体,抑制细胞凋亡。肝脏是合成蛋白的重要场所,且上述研究提示饮水锶主要增强肝脏抗氧化功能。本发明使用western blot方法测定了各组小鼠肝脏中的Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3蛋白的表达量。如图15,结果显示2.5mg/L和5.0mg/L锶浓度组的Bax蛋白表达量显著低于PWC。0.5mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L锶浓度组Bcl-2蛋白表达量显著高于PWC组,且2.5mg/L、5.0mg/L锶浓度组Bcl-2蛋白表达量显著高于0.5mg/L。2.5mg/L和5.0mg/L锶浓度组Bcl-2/Bax比值显著高于PWC组。以上结果说明三个锶浓度组均在不同程度上降低了Bax和增加了Bcl-2的表达,其中2.5mg/L和5.0mg/L锶浓度组相比PWC组提高了Bcl-2/Bax比值,有效抑制了触发细胞凋亡途径的其中关键一环。当Bcl-2/Bax比值降低时,凋亡信号会激活caspase-3,这是细胞凋亡的关键执行者,进而启动细胞凋亡。测定结果表明0.5mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L锶浓度组caspase-3蛋白表达量显著低于PWC组,2.5mg/L和5.0mg/L锶浓度组cleaved caspase-3表达量显著低于PWC组,即2.5mg/L和5.0mg/L锶浓度组有效抑制了caspase-3蛋白的活化,与Bcl-2/Bax结果相符合,说明2.5mg/L和5.0mg/L锶浓度组能够通过影响Bcl-2和Bax的表达,显著提高了Bcl-2/Bax比值,进而抑制caspase-3的活化,抑制线粒体凋亡途径的触发,抑制细胞发生凋亡。

NAD+是人体近一半代谢活动不可或缺的物质,但随年龄增长快速下降。有研究表明服用NMN可将NAD+水平提高,从而使细胞的能量水平恢复到年轻态,达到延缓甚至逆转衰老的效果。烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAmPRTase或Nampt)能够催化烟酰胺与5-磷酸核糖基-1焦磷酸盐的缩合生成烟酰胺单核苷酸(NMN),这是生产NAD+的必要步骤,NMN是NAD+的前体,其功能也主要通过NAD+(烟酰胺腺嘌呤双核苷酸)体现。NMNAT1(烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶1)编码一种限速酶,以NMN为重要底物,催化NAD+的生物合成。本发明使用Elisa方法探究饮水锶对心脏、肝脏、肾脏组织中NAMPT和NMNAT1含量的影响,如图16,结果显示0.5mg/L饮水锶增加了心脏中NMNAT1含量,增加了肾脏中NAMPT和NMNAT1含量,降低了肝脏中NAMPT含量;2.5mg/L饮水锶增加了心脏中NMNAT1、肝脏中NAMPT和NMNAT1含量;5.0mg/L饮水锶增加了心脏中NAMPT和NMNAT1含量,减低肾脏中NAMPT含量,但增加肾脏中NMNAT1含量,增加肝脏中NAMPT、NMNAT1含量。

综上所述,饮水锶可增强心脏SOD酶活性,增强肾脏CAT酶活性以及肝脏SOD和GSH-Px酶活性,从而可能提高机体抗氧化能力,减少ROS的积聚,使Bcl-2/Bax比值保持较高状态,进而减少caspase-3的活化,降低细胞发生凋亡的概率,可能延长细胞寿命。且饮水锶在一定程度上增加了组织中NAMPT和NMNAT1的含量,可能促进NAD+的合成。通过以上综合调控作用,并结合水中锶延长蚤状溞生存期的观察结果猜测饮水锶可能延长小鼠甚至人类寿命。

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