OXPHOS抑制剂作为抗肿瘤药物Alisertib增效剂的应用
阅读说明：本技术 OXPHOS抑制剂作为抗肿瘤药物Alisertib增效剂的应用 (Application of OXPHOS inhibitor as antitumor drug Alisertib synergist ) 是由 刘强 张子健 王自峰 严敏 曾德顺 卓俊晓 雷杰 雷鑫星 于 2021-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了OXPHOS抑制剂作为抗肿瘤药物Alisertib增效剂的应用。发明人通过研究发现,Alisertib处理的乳腺癌细胞呈现出对氧化磷酸化及相关信号通路的依赖状态。Alisertib的处理会快速降低有丝分裂期M期细胞的ATP水平。OXPHOS抑制剂处理可以在多种细胞系中增强Alisertib的肿瘤杀伤作用。发明人发现OXPHOS抑制剂与Alisertib联用时可以进一步降低M细胞的ATP水平,延长有丝分裂时间和有丝分裂期细胞死亡的概率。在小鼠实验中发明人发现,通过灌胃的方式联用Alisertib和二甲双胍可以显著抑制肿瘤生长,肿瘤抑制效率相比于单药显著提升,而未导致显著的小鼠体重下降。这些研究表明氧化磷酸化抑制剂二甲双胍与Alisertib的联用可以有效提高肿瘤抑制效率,增强杀伤效果,同时副作用较低。(The invention discloses an application of an OXPHOS inhibitor as an antitumor drug Alisertib synergist. The inventor finds out through research that the breast cancer cells treated by the Alisertib present a dependent state on oxidative phosphorylation and related signal paths. Treatment with Alisertib rapidly reduces ATP levels in mitotic phase M cells. OXPHOS inhibitor treatment can enhance the tumor killing effect of Alisertib in a variety of cell lines. The inventors have found that OXPHOS inhibitors in combination with Alisertib further reduce ATP levels in M cells, prolonging mitotic time and the probability of cell death during mitosis. In a mouse experiment, the inventor finds that the combination of the Alisertib and the metformin can obviously inhibit the growth of the tumor in a gastric lavage mode, and the tumor inhibition efficiency is obviously improved compared with that of a single medicine, without causing obvious weight reduction of the mouse. The researches show that the combination of the oxidative phosphorylation inhibitor metformin and the Alisertib can effectively improve the tumor inhibition efficiency and enhance the killing effect, and meanwhile, the side effect is low.)
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及OXPHOS抑制剂作为抗肿瘤药物Alisertib增效剂的应用。
背景技术
肿瘤对人们的健康构成严重威胁。为了治疗肿瘤，人们针对不同的靶点，开发了多种药物。
有丝分裂受到精密调控，该过程保证了遗传物质可以稳定的代代相传。有丝分裂调控的异常会导致不受控制的细胞增殖，导致非整倍性和遗传不稳定，最终导致癌症发展。考虑到磷酸化在有丝分裂检查点，纺锤体功能和染色体分离中的核心作用，因而有丝分裂激酶与肿瘤发生发展密切相关。因此，靶向控制染色体传递保真度的有丝分裂激酶似乎是癌症治疗中的有前途的途径。有丝分裂激酶抑制剂与传统化疗药物相比主要有三个主要优势。1）仅靶向增殖的细胞，对非分裂组织(如心脏和肝脏)的毒性低。2）避免了DNA损伤，从而消除了诱发与治疗有关的继发性癌症的风险。3）这类药物与常用的DNA损伤类药物的作用机制不同，因而可以用在已经对DNA损伤药物耐药的病人中。
Alisertib (MLN8237)是有丝分裂激酶抑制剂的一个典型代表，目前正在多种血液和实体瘤中进行临床研究(clinicaltrials.gov)1–3。Alisertib是一种口服的AURAK选择性小分子抑制剂。作为一种高选择性的有丝分裂激酶抑制剂(选择性比AURKB激酶高200倍)， Arisertib具有有丝分裂激酶抑制剂的优势，对非增殖性组织的毒性极小4。此外，Alisertib还具给药简单的特点，前期研究显示其对难治性恶性肿瘤的潜在疗效5。
尽管细胞周期激酶抑制剂在肿瘤治疗中有这样或那样的优势，临床实验中依然遇到了明显的障碍。问题主要存在于缺乏治疗窗口，患者体内正常增殖的细胞和组织受到抑制，并带来显著的毒副作用6。同样以Alisertib为例，在针对复发性B细胞和T细胞淋巴瘤的二期临床实验中，Alisertib表现出有效性和安全耐受性，客观反应率(ORR)分别为27%和30%。与其它细胞周期激酶抑制剂在临床试验中遇到的问题类似，药物相关的副作用主要表现在对正常增殖细胞的杀伤，包括造血组织，消化道，皮肤和毛囊(参见综述5)。在实体瘤中二期临床实验数据显示在乳腺癌中ORR为18%，小细胞肺癌中21%，非小细胞肺癌中为 4%，头颈鳞癌为9%, 胃食管腺癌9%。最常见的副作用表现为骨髓抑制，脱发，粘膜炎和疲劳。临床试验显示，Alisertib组和对照组中分别有9％和13％的患者因毒性而停止治疗。这些研究结果表明，需要进一步采取措施降低剂量并获得足够的治疗窗口，例如与其他药物联用，进行联合治疗。
OXPHOS抑制剂是一种有潜力的肿瘤治疗制剂，现有用于肿瘤治疗的OXPHOS抑制剂对正常代谢旺盛的细胞也具有较大的杀伤力，其副作用大，使用受限7–9。
二甲双胍是临床应用多年的药物，具有良好的安全性，主要用于糖尿病的治疗，也有研究表明其具有调脂、减肥，治疗NAFLD、PCOS、骨质疏松，心血管保护等作用。在肿瘤治疗方面，已有研究表明二甲双胍能降低肿瘤的发病风险及死亡率。其机制可能与二甲双胍对肿瘤细胞的直接作用[如对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（LKB1）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、人类表皮生长因子受体2（HER2）的作用]，及降低血糖、提高胰岛素敏感性等作用间接抑制肿瘤发生相关。虽然有众多文献公开二甲双胍可与抗肿瘤药物联用，但是其效果差异巨大，与具体的肿瘤、联合使用的抗肿瘤药物之间的联用规律不可寻。未有文献报导二甲双胍可以提高Alisertib的疗效。
通过联合用药，降低现有肿瘤治疗药物的副作用，提高其疗效，具有非常实际的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供OXPHOS抑制剂作为抗肿瘤药物Alisertib增效剂的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
OXPHOS抑制剂在制备Alisertib抗肿瘤活性增效剂中的应用，所述OXPHOS抑制剂选自二甲双胍、叠氮化钠或去极化剂CCCP中的至少一种。
在一些实例中，所述肿瘤选自乳腺癌、淋巴瘤、人急性早幼粒白血病、宫颈癌。
在一些实例中，所述乳腺癌为三阴乳腺癌。
在一些实例中，所述OXPHOS抑制剂为二甲双胍，二甲双胍和Alisertib的质量比为(10～30)：1。
在一些实例中，人体中，二甲双胍的用量为500～2500 mg/天，Alisertib的用量为20～100 mg/天。
本发明的第二个方面，提供：
一种提高Alisertib抗肿瘤活性的方法，包括将Alisertib和OXPHOS抑制剂联合使用，所述OXPHOS抑制剂选自二甲双胍、叠氮化钠或去极化剂CCCP中的至少一种。
在一些实例中，所述肿瘤选自乳腺癌、淋巴瘤、人急性早幼粒白血病、宫颈癌。
在一些实例中，所述乳腺癌为三阴乳腺癌。
在一些实例中，所述OXPHOS抑制剂为二甲双胍，二甲双胍和Alisertib的质量比为(10～30)：1。
在一些实例中，人体中，二甲双胍的用量为500～2500 mg/天，Alisertib的用量为20～100 mg/天。
本发明的第三个方面，提供：
一种治疗肿瘤的方法，包括：
确定患者患有肿瘤；
给患者同时施用Alisertib和OXPHOS抑制剂，所述OXPHOS抑制剂选自二甲双胍、叠氮化钠或去极化剂CCCP中的至少一种。
在一些实例中，所述肿瘤选自乳腺癌、淋巴瘤、人急性早幼粒白血病、宫颈癌。
在一些实例中，所述乳腺癌为三阴乳腺癌。
在一些实例中，所述OXPHOS抑制剂为二甲双胍，二甲双胍和Alisertib的质量比为(10～30)：1。
在一些实例中，人体中，二甲双胍的用量为500～2500 mg/天，Alisertib的用量为20～100 mg/天。
本发明的有益效果是：
发明人通过研究发现，Alisertib处理的乳腺癌细胞呈现出对氧化磷酸化及相关信号通路的依赖状态。进一步研究表明Alisertib的处理会快速降低有丝分裂期M期细胞的ATP水平（图2）。包括二甲双胍在内的氧化磷酸化抑制剂处理可以在多种细胞系中增强Alisertib的肿瘤杀伤作用（图3）。在机制上，发明人发现氧化磷酸化的抑制剂与Alisertib联用时可以进一步降低M细胞的ATP水平，延长有丝分裂时间和有丝分裂期细胞死亡的概率（图4）。在小鼠实验中发明人发现，通过灌胃的方式联用Alisertib和二甲双胍可以显著抑制肿瘤生长，肿瘤抑制效率相比于单药显著提升，而未导致显著的小鼠体重下降（图5）。这些研究表明氧化磷酸化抑制剂二甲双胍与细胞周期激酶抑制剂Alisertib的联用可以有效提高肿瘤抑制效率，增强杀伤效果（图6）。
附图说明
图1是CRISPR/Cas9全基因组筛选使Alisertib敏感的基因和通路；
图2～4是Alisertib导致M期细胞内ATP水平下降的结果；
图5～7是 Alisertib和二甲双胍联用导致有丝分裂中细胞死亡比例上升的结果；
图8是二甲双胍联用增强Alisertib的抗肿瘤效果的结果；
图9和10是 Alisertib和二甲双胍联用抑制小鼠移植瘤进展的结果；
图11是二甲双胍增强细胞周期激酶抑制剂Alisertib的肿瘤杀伤作用示意图。
具体实施方式
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
一、基于Crispr/Cas9的全基因组筛选
为了寻找可以增强Alisertib敏感性，且易于靶向的生物学过程，发明人在Alisertib或DMSO处理的MDA-MB-231细胞中进行了基于CRISPR / Cas9的全基因组筛选(图1A)。简而言之，将感染了GeCKO CRISPR文库10的MDA-MB-231细胞用嘌呤霉素筛选7天，以获得表达sgRNA的细胞。然后用药物溶剂(DMSO)或Alisertib处理表达sgRNA的细胞。每组用不少于4×107个细胞提取处理前细胞和经过药物7天处理的细胞的基因组DNA。扩增sgRNA结构以构建文库并送测序。通过使用MAGeCK算法计算每个基因的富集β得分(β得分)11。发明人主要关注在Alisertib处理下的阴性选择基因，用以探索可增强Alisertib抗肿瘤作用的靶点(图1 B)。
全基因组敲除筛选发现Alisertib使敏感的基因参与氧化磷酸化紧密相关(图1C)，而氧化磷酸化抑制剂与细胞周期激酶抑制剂之间的联合作用及机制研究尚不明确。这些使肿瘤细胞对Alisertib敏感的基因直接与电子传输链(ETC)复合物I(NDUFS4，NDUFV1，NDUFA4等)，复合物III(CYC1，UQCRB，UQCRQ等)，复合物Ⅳ(COX5A)，COX7B，COX8A等)和复合物V(ATP5O，ATP5G2，ATP5G2等)的成分相关(图1 C)。除此之外还发现在ETC成熟和线粒体蛋白质合成中起作用的基因也与Alisertib的敏感性有关(图1 C)。
为了进一步研究氧化磷酸化与细胞对Alisertib响应情况之间的联系，发明人通过RNA测序分析了Alisertib处理6小时后MDA-MB-231细胞的转录组。差异表达基因(DEG)的GO分析发现氧化磷酸化(FDR = 0.00018)，ATP生物合成(FDR = 0.00066)，能量电化学梯度(FDR = 0.00531)，电子传输链(FDR = 0.020362)等过程显著富集(图1 D和1E)。基因集富集分析(GSEA)12显示OXPHOS相关过程，包括氧化磷酸化(NES = 2.426，p <0.0001)，呼吸电子转运链(NES = 2.345，p <0.0001)以及其他与线粒体呼吸相关的基因集被显著富集。总结以上结果，发明人的CRISPR / Cas9全基因组筛选和RNA测序转录组数据均表明Aurora-A抑制剂Alisertib与OXPHOS所需的一组基因之间存在合成致死相互作用。
二、Alisertib对细胞能量水平的影响分析
细胞分裂是一个高度耗能的过程13。前期研究显示细胞内的ATP在间期逐步积累，在有丝分裂的后期显著下降14。利用胸腺嘧啶双阻滞的方法将细胞同步化并释放到预期的周期阶段，发明人发现细胞能量逐渐积累，在G2/M达到顶峰，细胞分裂完成后ATP迅速下降，与前期实验结果一致(图2A和2B)。紧接着发明人将细胞利用nocodazole同步化至M期的前中期，并用Alisertib对细胞进行处理，检测该药物M期细胞内ATP水平的影响。结果显示，加入Alisertib后短时间内即可观察到细胞内ATP浓度的下降(图2C)。这提示Alisertib对细胞内的能量状态可以产生快速的影响。为了在活细胞中实时的研究Alisertib的作用,发明人在MDA-MB-231细胞以及另外两个常用于细胞生物学研究的细胞HEK293以及Hela中建立了稳定表达能量指示探针PercevalHR的细胞(图2D)。PercevalHR是一种生物荧光探针，可以快速响应细胞内ATP/ADP的变化，在这些稳定表达该荧光探针的细胞中发明人进行长时间实时观察。pH值的变化由pH探针BCECF-AM联合流式细胞技术矫正，在显微镜下利用pH生物探针pHRed矫正。发明人发现M期的MDA-MB-231, Hela和HEK293细胞在Alisertib，AURKA抑制剂ENMD-2076以及敲降AURKA的处理下均表现出ATP水平下降(图3)。这个结果提示Alisertib所引起的M期细胞内ATP水平下降并不是由于脱靶效应产生的，而是由AURKA被抑制产生。
为了进一步研究其它周期激酶抑制是否可以产生相类似的ATP降低效果，发明人使用了PLK1和CDK1的两个常用抑制剂BI-2536和RO-3306分别处理细胞。实验结果显示，1-2小时的BI-2536与RO-3306处理均可以降低M期细胞内的ATP水平 (图4 F和G)。高内涵成像系统实时观察细胞在不同处理情况下的ATP/DAP能量变化情况。上机前将同步化在M期，将培养基更换为含有Vehicle (Ctrl)， BI-2536, RO-3306和Alisertib的培养基，连续观察一小时。结果显示细胞周期激酶的抑制显著降低了有丝分裂期细胞的能量积累(图4 H)。
三、氧化磷酸化抑制对Alisertib的肿瘤杀伤增效作用分析
前一部分的实验结果显示Alisertib可以迅速降低有丝分裂细胞的细胞内ATP水平，结合全基因组筛选得到的OXPHOS相关基因敲除可以增强Alisertib的敏感性发明人提出假设：OXPHOS抑制剂的联合使用可能会进一步破坏有丝分裂细胞的能量稳态并增强Alisertib的抗肿瘤作用。根据这个假设，发明人测试了ETC抑制剂二甲双胍，叠氮化钠和去极化剂CCCP与Alisertib协同作用。实验结果显示，在以上药物的联合作用下，Alisertib的细胞杀伤作用均得到增强(图5 A)。
二甲双胍是2型糖尿病的一线治疗药物，二甲双胍抑制线粒体ETC的复合物I破坏OXPHOS和线粒体ATP的生成15–17。鉴于其出色的安全性，低成本和最小的副作用，二甲双胍具有和Alisertib联用的潜力。在4T1(小鼠乳腺癌细胞系)，U937（淋巴瘤细胞）和HL60细胞（人急性早幼粒白血病细胞）中发明人都观察到了二甲双胍对Alisertib的增强作用(图5 B)。
为进一步了解联用对正常细胞，特别是正常进行有丝分裂细胞的影响，发明人利用乳腺正常上皮细胞10A与Ras转化的10A细胞进行联用杀伤实验，实验结果显示，Alisertib与二甲双胍的联用对于恶行转化的细胞杀伤效果更为显著，强于对正常上皮细胞的杀伤作用（图5 C）。
克隆形成实验表明5 mM二甲双胍和100 nM Alisertib联用显著抑制了MDA-MB-231(图6 D和3E)，4T1(图6 F和G)，Hela(图6 H和I)以及HEK293的克隆形成能力。联用组只剩下形态异常的细胞。
Alisertib(100 nM)或二甲双胍(5 mM)的单药对3D培养中MDA-MB-231细胞团的大小影响较小，而相同剂量的联合治疗则明显降低了基质胶中细胞团形成的能力(图6 J-L)。但是，相同药物浓度下抑制效果较克隆形成实验所显示的要低。利用anexin V /碘化丙啶(PI)染色检测凋亡，发明人发现100 nm Alisertib和5 mM处理24 h的联合用药组细胞凋亡比例更高(图7 M)。相差显微镜下观察细胞状态，联合处理24小时后，球形细胞显着增加，这提示更多的细胞出现周期阻滞(图7 N)。这些数据表明，OXPHOS抑制剂(如二甲双胍)可显著增强Alisertib的抗癌功效，同时对正常细胞的杀伤作用较低。
四、氧化磷酸化抑制二甲双胍增强Alisertib肿瘤杀伤作用的机制分析
为了研究二甲双胍和Alisertib联合增强的细胞杀伤功效的潜在机制，发明人对细胞周期分布进行检测。5 mM 24 h二甲双胍治疗单独使用时可降低G2 / M期细胞的比例，但与100 nM Alisertib一起给药可显着提高G2 / M细胞的比例（图8A和B）。利用活细胞成像系统持续观察细胞在各种处理条件下的分裂情况。在联用组中发明人观察到，有丝分裂的时间显着延长，相较于Alisertib单药组，有丝分裂耗时分别在MDA-MB-231,4T1和Hela中延长1.3，0.7和0.2h。同时有丝分裂中出现异常的比例增加(图8 C-I)。由于ATP耗竭可引起滑移18，发明人认为联合治疗可导致严重的能量中断，从而增强Alisertib的有丝分裂效果。最近的研究证明细胞在细胞周期的G2 / M期依赖于OXPHOS提供能量19，丙酮酸可以增加细胞内ATP的水平20。与预期一致，在补充5 mM丙酮酸的双药处理过的细胞中，有丝分裂的持续时间在MDA-MB-231中平均比双药处理组短了1.1 h，4T1中0.8 h，Hela中 0.3 h (表1)。在补充5 mM丙酮酸的双药处理过的实验组中，ATP降低的情况得到缓解。这些结果表明二甲双胍和Alisertib的组合进一步加剧了有丝分裂失败和细胞死亡。氧化磷酸化抑制剂所带来的能量进一步下降在一定程度上可以解释联合治疗中上升的分裂问题。
五、二甲双胍和Alisertib联合治疗在小鼠移植瘤模型中的效果分析
动物实验严格参照中山大学肿瘤医院动物实验中心的管理要求，并通过伦理审核后实施。小鼠来源的4T1细胞以每100 μl含有1×105个细胞的浓度重悬在PBS缓冲液中。原位接种到5至6周龄BALB/c 雌性小鼠的第四对乳腺脂肪垫。待移植瘤生长至平均直径3 mm左右时随机分为4组，Alisertib单药组 (Alisertib 15 mg/kg/天)，二甲双胍单药(二甲双胍 mg/kg/天)，双药联用 (二甲双胍 300 mg/kg/天, Alisertib 15mg/kg/天) 以及仅含有药物载体的对照组(1% β-环糊精&1% 碳酸钠)。灌胃给药。肿瘤尺寸每两天测量一次，肿瘤体积按照公式V= (长度×宽度2)/2 计算。通过灌胃手段按照单药Alisertib mg/kg/天、单药二甲双胍mg/kg/天、联合用药以及对照分别处理接种了4T1的Balb/c各组小鼠。接种了MDA-MB-231的小鼠则分为单药Alisertib mg/kg/天、联合用药以及对照三组。与体外实验的趋势一致，与单一药物组和对照组相比，联合治疗组的肿瘤体积更小和肿瘤重量明显更低(p <0.01，图9、图10)。并且联合用药仅造成轻微的体重减轻(Balb/c 4%，裸鼠6%) (图9、图10)。
上述研究结果表明氧化磷酸化抑制剂二甲双胍与细胞周期激酶抑制剂Alisertib的联用可以有效提高肿瘤抑制效率，增强杀伤效果（图11）。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
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