一种新型离子液体功能化可注射导电水凝胶的制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种新型离子液体功能化可注射导电水凝胶的制备方法及应用 (Preparation method and application of novel ionic liquid functionalized injectable conductive hydrogel ) 是由 李春涯 刘盼 王炎英 何梦 于 2021-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医用材料制备技术领域,具体涉及一种新型离子液体功能化可注射导电水凝胶的制备方法及应用。本发明通过制备出含正电荷活性基团的双氨基咪唑四氟硼酸盐离子液体：1,1’-(乙基-1,2-)-双-(3-(3-氨丙基))-1H咪唑四氟硼酸盐离子液体,聚合后再与醛基功能化的透明质酸以3:(1～4)的质量比例混合,通过席夫碱反应,得到一种新型的可注射型导电水凝胶PIL-OHA。本发明所制备的水凝胶PIL-OHA,具有优良的抗菌性能和机械性能,耦合外源交流电刺激时,可显著促进糖尿病模型小鼠皮肤伤口愈合。(The invention belongs to the technical field of biomedical material preparation, and particularly relates to a preparation method and application of novel ionic liquid functionalized injectable conductive hydrogel. The invention prepares the diamino imidazole tetrafluoroborate ionic liquid containing positive charge active groups: 1,1' - (ethyl-1, 2-) bis- (3- (3-aminopropyl)) -1H imidazole tetrafluoroborate ionic liquid, mixing the polymerized ionic liquid with aldehyde-functionalized hyaluronic acid in a mass ratio of 3 (1-4), and reacting with Schiff base to obtain the novel injectable conductive hydrogel PIL-OHA. The hydrogel PIL-OHA prepared by the invention has excellent antibacterial performance and mechanical performance, and can remarkably promote the healing of the skin wound of a diabetes model mouse when coupled with exogenous alternating current stimulation.)
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技术领域
]本发明属于生物医用材料制备
技术领域
，具体涉及一种新型离子液体功能化可注射导电水凝胶的制备方法及应用。[
背景技术
]全球有超过650万人罹患糖尿病伤口，每年医疗保健费用超过250亿美元(Y.Lu，Y.Wang，J.Zhang，X.Hu，Z.Yang，Y.Guo，Y.Wang，ActaBiomaterial，2019，89：217-226)。目前糖尿病伤口治疗方法有高压氧疗法，负压伤口治疗，生长因子以及皮肤替代品的应用，但这些策略成本高，时间长，且不能达到令人满意的治疗结果，因此慢性伤口的加速和彻底治疗面临着巨大的挑战(Q.Bai，K.Han，K.Dong，C.Zheng，Y.Zhang，Q.Long，T.Lu，IntemationalJournal ofNanomedicine，2020，15：9717-9743)。在这些策略中，电刺激由于其安全性和有效性，引起了越来越多研究者的关注。电刺激是将电极置于伤口附近或伤口床中以输送低强度电流，由于其安全性、有效性和低成本，吸引了越来越多研究者的关注。体外研究表明，外源性ES能增强成纤维细胞和胶质形成细胞的迁移和增殖，促进成纤维细胞分泌多种用于伤口闭合的细胞外基质(Y.Wang，M.Rouabhia，D.Lavertu，Z.Zhang，Tissue Engineeringand Regenerative Medicine，2017，11：1110-1121)。体内和临床研究也表明ES疗法对治疗慢性伤口具有积极作用(A.Polak，J.Taradaj，A.Nawrat，C.Kucio，Journal ofWound Care，2016，25：742-751)。然而，当前基于电极的ES策略受到了一些限制，例如，所施加的ES不能覆盖整个伤口区域，在大伤口上施加的高参数ES对人体也是不利的(Y.Lu，Y.Wang，J.Zhang，X.Hu，Z.Yang，Y.Guo，Y.Wang，ActaBiomaterialia，2019，89：217-226)。
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发明内容
]为了克服上述现有技术中电刺激策略中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种新型离子液体功能化可注射导电水凝胶的制备方法及应用。与已报道的离子液体功能化水凝胶相比(P.Liu，K.Jin，W.Wong，Y.Wang，C.Li，Chemical Engineering Journal，2021，415：12905)，本发明方法制备的是一种可注射水凝胶，其在使用前是流动液体，注射到目标位置后，能在生理条件下快速完成溶胶-凝胶的转变过程，其出色的流动性可以填充各类不规则的伤口。所述的可注射导电水凝胶可以完全覆盖伤口，应用ES后可以刺激整个伤口区域，在治疗大伤口方面也显示较大的潜力。所述的可注射导电水凝胶的制备方法工艺简单、成本低廉；经该方法制备得到的可注射导电水凝胶具有良好的机械性能、粘合性、止血性能以及抗菌性能，耦合交流电刺激后，能够显著加快糖尿病伤口的愈合。
本发明的构思和原理说明如下：经化学交联的水凝胶具有较高的强度和稳定性，其中席夫碱反应是用含醛、酮的化合物与一级胺类化合物进行的亲核加成反应，该反应条件温和，速度快，常用来制备快速交联固化的水凝胶。本发明利用醛基和氨基易于发生席夫碱反应的特点，首先制备了双氨基功能化的离子液体，离子液体聚合后与醛基功能化的透明质酸混合，发生化学交联(席夫碱反应)，聚离子液体与氧化透明质酸通过动态化学键连接得到水凝胶，所得水凝胶在生理条件下，即可完成溶胶-凝胶的转变，因此所得水凝胶为可注射水凝胶。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种新型离子液体功能化可注射导电水凝胶PIL-OHA，其结构式为：
所述可注射导电水凝胶PIL-OHA，由聚PBAimBF4离子液体(PIL)，与氧化透明质酸(OHA)发生席夫碱反应制备而成。
进一步，所述聚PBAimBF4离子液体(PIL)的结构式为：
进一步，所述聚PBAimBF4离子液体(PIL)的合成路线为：
进一步，所述氧化透明质酸(OHA)的结构式为：
进一步，所述氧化透明质酸(OHA)通过NaIO4氧化透明质酸(HA)，其合成路线为：
进一步，所述氧化透明质酸(OHA)中透明质酸(HA)的氧化度为40％-50％，优选的，氧化度为45％；
进一步，发生席夫碱反应的聚PBAimBF4离子液体(PIL)与氧化透明质酸(OHA)的质量比为3∶(1～4)，优选的，质量比为1∶1；
一种新型离子液体功能化可注射导电水凝胶PIL-OHA的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备聚PBAimBF4离子液体(PIL)：
在N2保护下，以乙腈为溶剂，1-(3-氨丙基)咪唑与1，2-二溴乙烯按摩尔比为7∶3在80℃油浴下发生亲核取代反应；将所得产物加入四氟硼酸钠的饱和水溶液中，使Br-全部被替换为BF4-，经过离子交换后的产物通过硅胶柱层析法(V甲醇∶V乙酸乙酯＝1∶3)纯化，得到PBAimBF4离子液体；然后将APS(过硫酸铵)加入到PBAimBF4水溶液中，在N2保护下，60℃加热，得到聚PBAimBF4离子液体；
(2)制备氧化透明质酸(OHA)：
将NaIO4溶于去离子水后，黑暗下搅拌滴加至透明质酸水溶液中，搅拌，再将乙二醇加入其中以除去过量的NaIO4，得混合液；使用透析袋(MWCO＝3000DA)分离混合液中副产物和OHA，以去离子水作为透析缓冲液，直至透析缓冲液中无沉淀产生，取透析袋内溶液冷冻干燥，得氧化透明质酸；
(3)PIL-oHA水凝胶的制备：将步骤(1)所得聚PBAimBF4离子液体溶于缓冲溶液中得溶液1，将步骤(2)所得氧化透明质酸溶于缓冲溶液中得溶液2，溶液1与溶液2混合，交联，得到可注射导电水凝胶(PIL-OHA)；
进一步，所述步骤(3)混合液中：氧化透明质酸与聚PBAimBF4离子液体的质量比为3∶(1～4)。
优选的，所述步骤(3)混合液中：氧化透明质酸与聚PBAimBF4离子液体的质量比为1∶1。
进一步，所述步骤(3)中，溶液1中聚PBAimBF4离子液体的浓度为2wt％-8wt％。
进一步，所述步骤(3)中，交联温度为人体生理温度。
进一步，所述步骤(3)中，交联温度为37℃。
进一步，所述步骤(3)中，缓冲溶液为pH＝7.4的0.01mol/LPBS。
上述新型离子液体功能化可注射导电水凝胶PIL-OHA在制备皮肤伤口修复药物中的应用。
进一步，上述新型离子液体功能化可注射导电水凝胶PIL-OHA耦合交流电刺激在制备皮肤伤口修复药物中的应用。
进一步，所述交流电参数为：3v，25Hz和0.5h。
进一步，所述皮肤伤口是由糖尿病引发的皮肤伤口。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
离子液体可以发生聚合反应形成聚离子液体，聚离子液体在重复单元上存在阴离子和阳离子电解质基团，从而具有良好的离子电导率。同时，离子液体和聚离子液体已被证明对微生物(革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌和真菌)具有良好的抗菌性能。透明质酸(HA)是一种无毒，无过敏，能够刺激上皮细胞迁移，增强血管生成并减轻炎症的天然聚合物，被认为是开发水凝胶的理想材料。本发明记载的制备方法，将含正电荷活性基团的双氨基咪唑四氟硼酸盐离子液体聚合后，与醛基功能化的HA混合，通过席夫碱键连接，制备出可注射导电水凝胶PIL-OHA。本发明方法制备的水凝胶，尤其是PIL-OHA-6水凝胶，具有良好的机械性能和生物相容性，与皮肤组织有相似的电导率，在不外加抗生素的情况下，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用。耦合外源交流电刺激后，其对糖尿病皮肤伤口的治疗结果优于商业TegadermTM薄膜。
经本发明方法制得的水凝胶具有以下优点：
1.本发明中，PIL-OHA可注射水凝胶拥有优良的抗菌性能，是由于聚离子液体所含的正电荷基团与细菌细胞壁之间的静电相互作用破坏细菌的完整性，从而起到良好的杀菌效果。
2.本发明中，聚PBAimBF4离子液体的氨基和氧化透明质酸的醛基在生理环境下会发生动态结合，形成动态席夫碱键。
3.本发明中氧化透明质酸的醛基可以与皮肤组织的氨基之间发生化学反应，同时水凝胶中的正电荷基团与黏液膜上带负电的唾液酸基团以及细胞膜的磷脂之间相互结合，赋予了该水凝胶良好的粘合性能。
4.本发明制备的水凝胶结构稳定，胶凝时间短(2-3min即可)，粘合性能优异，可牢固地粘附到出血部位，因此该水凝胶拥有良好的止血性能。
5.当聚PBAimBF4离子液体的浓度从2wt％增加至8wt％时，水凝胶的交联密度逐渐提高，电导率从0.28mS/em增加到0.76mS/em。所有水凝胶样品都具有与皮肤组织相似的电导率值，因此这些水凝胶在转移生物电信号和加速伤口愈合过程中具有巨大潜力。
6.本发明方法制得的可注射导电水凝胶在糖尿病模型小鼠全厚度皮肤损伤模型中，通过评估伤口愈合率，肉芽组织厚度，肿瘤坏死因子和细胞生长因子的含量，该水凝胶PIL-OHA表现出优于商业TegadermTM薄膜的治疗效果。
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附图说明
]图1是PBAimBF4离子液体的1H NMR谱图。
图2a是PBAimBF4离子液体的飞行时间质谱图，图2b是PBAimBF4离子液体的红外光谱图。
图3a是OHA的1H NMR谱图，图3b是HA和OHA的红外光谱图。
图4a是OHA溶液，聚PBAimBF4离子液体溶液(PIL)以及PIL-OHA-6水凝胶在常温常压、下的状态图，图4b是PIL-OHA-6水凝胶的字符形成实验，图4c是PIL-OHA-6水凝胶转化成溶胶的图像。
图5是PIL-OHA-6水凝胶的红外光谱图。
图6是PIL-OHA-x水凝胶的流变行为图。
图7a是PIL-OHA-2水凝胶的SEM图，图7b是PIL-OHA-4水凝胶的SEM图，图7c是PIL-OHA-6水凝胶的SEM图，图7d是PIL-OHA-8水凝胶的SEM图。
图8a是本发明制得的PIL-OHA-x水凝胶的拉伸应力-应变曲线图，图8b本发明制得的是PIL-OHA-x水凝胶的压缩应力-应变曲线图。
图9a是用圆盘法评估本发明制得的PIL-OHA-x水凝胶的抗菌能力图，图9b是用菌落计数法评估本发明制得的PIL-OHA-x水凝胶抑菌率的统计图，图9c是PIL-OHA-6水凝胶的Zeta电位图。
图10是本发明制得的PIL-OHA-x水凝胶对蛋白质的吸附性能测试图。
图11a是本发明制得的PIL-OHA-x水凝胶和成纤维细胞L929共培养48h后的活死细胞染色图，图11b是本发明制得的PIL-OHA-x水凝胶和成纤维细胞L929共培养48h后细胞存活数目统计图。
图12是本发明制得的PIL-OHA-x水凝胶的溶血能力测试图。
图13是本发明制得的PIL-OHA-x水凝胶的粘附性能图。
图14a是空白对照组和本发明制得的PIL-OHA-6水凝胶的止血能力对比图，图14b是空白对照组和本发明制得的PIL-OHA-6水凝胶的止血能力统计图。
图15a是经空白对照组，ES组，PIL-OHA-6水凝胶组，以及ES+PIL-OHA-6水凝胶组治疗6h前后的体外细胞划痕的显微图像，图15b是经空白对照组，ES组，PIL-OHA-6水凝胶组，以及ES+PIL-OHA-6水凝胶组治疗6h前后的体外细胞划痕面积的量化统计图。
图16a是第0、3、7和14天用不同方案治疗糖尿病皮肤伤口的图像，图16b是第0、3、7和14天用不同方案治疗糖尿病皮肤伤口后愈合程度的折线图。
图17a是经商业TegadermTM薄膜治疗糖尿病伤口14天后的H&E染色图，图17b是经PIL-OHA-2水凝胶治疗糖尿病伤口14天后的H&E染色图，图17c是经PIL-OHA-4水凝胶治疗糖尿病伤口14天后的H&E染色图，图17d是经PIL-OHA-6水凝胶治疗糖尿病伤口14天后的H&E染色图，图17e是经PIL-OHA-8水凝胶治疗糖尿病伤口14天后的H&E染色图，图17f是经ES治疗糖尿病伤口14天后的H&E染色图，图17g是经ES+PIL-OHA-6水凝胶治疗糖尿病伤口14天后的H&E染色图。
图18是用不同方案治疗糖尿病模型小鼠后背创建全厚度皮肤伤口14天后，创面组织的肿瘤坏死因子TNF-α的免疫荧光染色图，从左至右，最左侧为DAPI染色的细胞核，中间为TNF-α的荧光图，最右侧为两者的叠加图。
图19是用不同方案治疗糖尿病模型小鼠后背创建全厚度皮肤伤口14天后，创面组织的生长因子VEGF的免疫荧光染色图，从左至右，最左侧为DAPI染色的细胞核，中间为VEGF的荧光图，最右侧为两者的叠加图。
图20是本发明制得PIL-OHA水凝胶耦合电刺激治疗糖尿病皮肤伤口的原理图。
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具体实施方式
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下面结合具体的实施例及附图对本发明做进一步的详细说明，而不应理解为对本发明权利要求书请求保护范围的限定。
实施例1一种新型离子液体功能化可注射导电水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)聚PBAimBF4离子液体的制备；
(a)PBAimBF4离子液体的制备：
将1-(3-氨丙基)咪唑(7mmol，0.876g)溶于乙腈中，在0℃下加入0.216gNaH，反应3h后将其转移到油浴锅中，待温度升到80℃后，逐滴加入1，2-二溴乙烯(3mmol，0.558g)，N2保护下，磁力搅拌反应24h。旋转蒸发除去溶剂后，将产物溶于少量甲醇中，用无水乙醚洗涤三次。随后，将产物加入到四氟硼酸钠的饱和水溶液中，室温下搅拌2h，反应停止后，二氯甲烷萃取数次，用稀AgNo3溶液证实Br-和BF4 -的离子交换过程，至无浅黄色沉淀产生，以确保Bt-全部被替换为BF4 -。合并有机相，减压蒸馏得粗产物，通过硅胶柱层析法(V甲醇∶V乙酸乙酯＝1∶3)纯化产物，得1，1′-(乙基-1，2-)-双-(3-(3-氨丙基))-1H咪唑四氟硼酸盐离子液体，记为PBAimBF4离子液体；
(b)聚PBAimBF4离子液体的制备：将0.55g步骤(a)所得PBAimBF4离子液体置于25mL的两口圆底烧瓶中，向其中加入0.05g过硫酸铵，在N2保护下，60℃加热20min，得到聚PBAimBF4离子液体，简记为PIL。
(2)氧化透明质酸的制备：
取1g透明质酸(HA：2.5mmol)溶解在100mL去离子水中后，得HA溶液，备用，将0.54gNaIO4(2.5mmol)溶于5mL去离子水中，黑暗下搅拌滴加至上述HA溶液中，搅拌2h。将2mL乙二醇加入其中以除去过量的NaIO4，1h后反应停止，得混合液。使用透析袋(MWCO＝3000DA)分离混合液中副产物和氧化的HA，去离子水作为透析缓冲液，每天更换3次水，直到要换的水中无沉淀产生(用1wt％的硝酸银溶液检查)，将透析袋内溶液冷冻干燥后获得氧化产物OHA(HA的氧化度为45％)。
HA的氧化度按照Pan等(J.Pan，L.Yuan，C.Guo，X.Geng，T.Fei，W.Fan，S.Li，H.Yuan，Z.Yan，X.Mo，Jouanal ofMaterials Chemistry B，2014)的方法通过盐酸羟胺与醛基之间的定量反应来确定的。
(3)可注射导电水凝胶PIL-OHA的制备：
将步骤(2)制得OHA(HA的氧化度为45％)溶解在0.01mol/L PBS(pH＝7.4)中，形成6wt％的OHA溶液，将步骤(1)制得聚PBAimBF4离子液体溶解在0.01mol/L PBS(pH＝7.4)中配成2wt％，4wt％，6wt％，8wt％的聚PBAimBF4离子液体溶液。将6wt％的OHA分别与浓度为2wt％，4wt％，6wt％，8wt％的聚PBAimBF4离子液体等体积混合，在37℃下相互交联107-178s，分别得到可注射导电水凝胶PIL-OHA-2，PIL-OHA-4，PIL-OHA-6，PIL-OHA-8，简记为PIL-OHA-x，其中xwt％为所加聚PBAimBF4离子液体溶液的质量百分含量。
本实施例中制得聚PBAimBF4离子液体的合成路线如下所示：
本实施例中制得OHA的合成路线如下所示：
本实施例中制得PIL-OHA水凝胶的合成路线如下所示：
本发明中制得PIL-OHA水凝胶耦合电刺激治疗糖尿病皮肤伤口的原理图如图20所示。
将实施例1制得的PIL-OHA水凝胶进行表征及性能测试，结果如图1-19所示：
图1是PBAimBF4离子液体的核磁共振氢谱图，对分子结构中对应氢原子的化学位移及归属分析可得，成功合成了该离子液体。
图2b是PBAimBF4离子液体傅立叶红外光谱图，3445.94em-1和3415.47em-1是N-H的伸缩振动峰，3075.51是-CH＝CH2中C-H的伸缩振动峰，2964.13cm-1和2866.78cm-1是-C-H基团的伸缩振动峰，1635.21cm-1和1572.67cm-1分别为咪唑环上C＝C和C＝N的骨架振动峰，1236.33em-1为C＝N双键的弯曲振动峰。这些结果表明，合成的PBAimBF4离子液体含有目标化合物的主要官能团信息。图2a是PBAimBF4离子液体的飞行时间质谱图，由图可知m/z＝276.31，与PBAimBF4离子液体中的咪唑鎓盐阳离子的理论分子量(276.39)基本一致，表明成功制备目标离子液体。
图3a是OHA的核磁共振氢谱，对谱图分析后可知成功制备出OHA。图3b是OHA的红外光谱图，在1740cm-1处有一个新形成的峰，这与OHA的C＝O片段有关。
图4a是6wt％的OHA溶液，6wt％的聚PBAimBF4离子液体溶液(PIL)以及PIL-OHA-6水凝胶在常温(25℃)、常压下的状态图，图4b是PIL-OHA-6水凝胶的字符形成实验，图4c是PIL-OHA-6水凝胶转化成溶胶的图像。图4c为向PIL-OHA-6水凝胶中加入羟胺溶液(10mg/mL)，羟胺与聚PBAimBF4离子液体的氨基竞争，然后与OHA的醛基结合后，水凝胶从凝胶状态变成溶胶。水凝胶中的动态网络被破坏，证实了聚PBAimBF4离子液体与OHA之间通过席夫碱反应连接的。
图5为PIL-OHA-6水凝胶的FT-IR图谱，从图中可以看出1740cm-1处OHA的C＝O官能团的峰消失，同时，新形成了一个C＝N的伸缩振动峰(1584cm-1)，这是因为OHA溶液与聚PBAimBF4离子液体溶液混合后，醛基与氨基反应形成了亚胺键。
通过四探针法评估PIL-OHA水凝胶的电导率，如表1所示，表1是不同PIL-OHA水凝胶的胶凝时间与电导率性能。当聚PBAimBF4离子液体的浓度从2wt％增加至8wt％时，水凝胶的交联密度逐渐提高，电导率从0.28mS/cm增加到0.76mS/cm。所有水凝胶样品都具有与皮肤组织相似的电导率值，表明这些水凝胶在转移生物电信号和加速伤口愈合过程中具有巨大潜力。此外，水凝胶的胶凝时间对其实际的生物医学应用而言非常重要，通过管反转法可确定水凝胶的胶凝时间从178s减少到107s，且所有的水凝胶均适合临床医学应用。
表1
图6是对PIL-OHA-x(x＝2、4、6、8)水凝胶流变性能的评估结果，随着水凝胶中聚PBAimBF4离子液体浓度的增加，PIL-OHA四种水凝胶的储能模量(G′)从882Pa小幅度增加至891Pa，983Pa，1012Pa，这可能是因为交联密度增加导致的G′增加。
图7(a-d)的场发射扫描电镜图可以观察到，所有的PIL-OHA水凝胶都显示出相互连接的多孔结构，随着聚PBAimBF4离子液体含量增加，氨基与OHA中的醛基反应的机会增大，孔径从3-10μm(PIL-OHA-2水凝胶的孔径)降低到0.1-2μm(PIL-OHA-8水凝胶的孔径)，形成了更加致密的网络结构。这种多孔结构适用于3D环境中细胞的存活，并且有利于营养物和代谢废物的运输。
图8a为PIL-OHA-x(x＝2、4、6、8)水凝胶的拉伸应力-应变性能的测试。这些水凝胶表现出良好的可拉伸性(128.4％-216.3％)，且PIL-OHA-8水凝胶表现出最高的断裂应变(约216.3％)，优于人类皮肤的可伸展性(60-75％)。水凝胶的拉伸应力也从7.6kPa增至30.1、43.4、85.6kPa，与人类皮肤相当。图8b是PIL-OHA-x(x＝2、4、6、8)水凝胶的压缩应力-应变性能的测试，压缩应力在60％的应变下从10.2kPa增至15.4、26.4、30.6kPa。因此，这些具有与人皮肤相似或更好的机械性能的水凝胶可以抵抗外力，并且可以很好地避免组织的潜在损伤。
图9a是使用圆盘法来评价可注射PIL-OHA-x(x＝2、4、6、8)水凝胶的抗菌能力。分别将100μL的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌悬浮液(1×108CFU/mL)铺在LB培养基(30mL)上，然后将消过毒的PIL-OHA-x(x＝2、4、6、8)水凝胶(2g)放在琼脂表面。37℃下孵育24h后，观察水凝胶周围细菌的生长情况。可以看到，PIL-OHA水凝胶没有出现明显的抑制区，在其表面上也没观察到菌落的生长。这种现象说明PIL-OHA水凝胶没有释放任何抗菌物质，其本身具有出色的抗菌能力。
图9b是使用菌落计数法来表征PIL-OHA-x(x＝2、4、6、8)水凝胶的抗菌特性。为了对水凝胶的抗菌效果进行定量评估，将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的细菌溶液(500μL，1×108CFU/mL)分别转移到灭菌的LB培养基(30mL)中，然后将消过毒的PIL-OHA水凝胶(0.5g)分别浸泡在上述LB培养基中，并在120rpm的振荡器中于37℃孵育。24h后将细菌悬浮液用LB培养基稀释到原始浓度的10-6倍，取10μL稀释后的细菌悬浮液分散到LB培养基的固体表面。在37℃下孵育24h后，分别对菌落形成单位(CFU)的数量进行计数，每个菌落重复测定超过三个独立的时间。没有水凝胶的细菌悬浮液被用作对照组(Control，其杀菌率视为0，其它组的杀菌率是在此基础上计算得到)。PIL-OHA-6水凝胶和PIL-OHA-8水凝胶均可以抑制99％以上的大肠杆菌(E.coil)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)，表明这些水凝胶在治疗细菌感染方面有巨大潜力。
图9c是PIL-OHA-6-x(x＝2、4、6、8)水凝胶的Ztea电位值，可以得出其Zeta电位为53.55mV，表明水凝胶表面带正电，这也是PIL-OHA水凝胶能够抗菌的原因。
图10是对PIL-OHA-x(x＝2、4、6、8)水凝胶对牛血清白蛋白(BSA)吸附能力的评估。将4种PIL-OHA-x(x＝2、4、6、8)水凝胶切成块状(重约50mg)，经75％医用酒精消毒1h后，在PBS(pH＝7.4，0.01mol/L)中浸泡达到溶胀平衡，然后将处理过的样品加入到0.75mL的10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)加中，37℃孵育24h，每种样品平行3次实验，用ShimadzuUV-2550在595nm处测定溶液中残留的BSA，根据吸光度测定吸附前后BSA的浓度从而来评价材料的吸附能力。计算公式为：其中C0和Ca分别是BSA吸附前、吸附后的浓度(mg/mL)，w是PIL-OHA水凝胶的重量，V是加入BSA的体积。PIL-OHA-2，PIL-OHA-4，PIL-OHA-6和PIL-OHA-8上的BSA吸附量分别为161.73±14.21mg/g，268.45±7.96mg/g，318.29±18.09mg/g和365.11±19.08mg/g。显然，PIL-OHA-8显示出最佳的吸收能力。吸收能力不仅与多孔结构有关，带正电的PIL和BSA之间的静电相互作用也可以帮助提高其吸附能力。
图11a是本发明制得的PIL-OHA-x(x＝2、4、6、8)水凝胶和成纤维细胞L929共培养48h后的活死细胞染色图。使用CCK-F与PI双荧光染色法来进行细胞活死染色，以未加PIL-OHA-x水凝胶的L929细胞作为空白对照组(Control)。
图11b是成纤维细胞(L929细胞)与本发明制得的PIL-OHA-x(x＝2、4、6、8)水凝胶直接接触共培养48h后的细胞存活数目统计图。每孔5×103个L929细胞(100μL)被接种到96孔板中，在细胞充分附着到孔板后，将在改良的DMEM培养基(添加了10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素)的DMEM培养基)中达到溶胀平衡的10mg的PIL-OHA水凝胶放入其中，并在孔板中培养48h，以培养基为阴性对照组，以不含细胞的培养基为空白组。随后，将20μL的CCK-8溶液加到每个孔中，并将孔板在37℃、5％CO2的培养箱中培养1.5h。然后，在450nm下测量每个孔的光密度(OD)值。细胞的相对生长率公式为：RGR(％)＝(ODT-ODblank)/(ODneg-ODblank)，式中：ODT、ODblank、ODneg分别为实验组、空白组和阴性对照组的光密度。结果表明随着聚PBAimBF4离子液体含量增加，细胞存活率逐渐下降，且PIL-OHA-8水凝胶的细胞存活率低于75％，这种现象与活死细胞染色图11a的结果一致。推测为离子液体或其他化学物质具有一定的毒性，从而使L929细胞死亡。
图12是通过体外溶血实验评估了PIL-OHA-x(x＝2、4、6、8)水凝胶的血液相容性。使用负压采血管收集新鲜的小鼠血液，以1000rpm离心10min收集红细胞，并用生理盐水洗涤，直至上清液中红色消失为止。然后，将纯化的红细胞进一步稀释至2％(V/V)。对于实验组，将尺寸为直径5mm，厚1mm的圆柱形水凝胶(已成型)放入上述红细胞溶液中，分别加入生理盐水和去离子水代替PIL-OHA，作为阴性和阳性对照。在37℃下孵育3h，将红细胞悬液以1000rpm离心15min。每个样品中取100μL的上清液，并通过紫外可见分光光度计在545nm波长处测量吸光度。将PIL-OHA水凝胶与红细胞共同孵育1h后，拍摄了四个水凝胶组和阳性对照组(去离子水)的颜色。所有水凝胶组为浅黄色，而阳性对照组为鲜红色。定量分析得到PIL-OHA-2水凝胶，PIL-OHA-4水凝胶，PIL-OHA-6水凝胶，PIL-OHA-8水凝胶的溶血率分别为2.25±0.17％，3.06±0.14％，3.67±0.56％，5.58±0.72％。溶血率随离子液体含量的增加而略有增加，除了PIL-OHA-8外，其余水凝胶组均表现出良好的血液相容性。结合细胞毒性和血液相容性实验，在水凝胶的机械性能、电导率满足等性能达到最优的条件下，选择可注射PIL-OHA-6水凝胶用于后续实验以减少实验成本。
图13是利用猪皮进行了剪接搭切实验，以评估PIL-OHA-x(x＝2、4、6、8)水凝胶对皮肤组织的粘附能力。猪皮肤组织去除多余的油脂后，被切割成10mm×30mm的矩形。然后，将50μL PIL-OHA-x(x＝2、4、6、8)水凝胶的前体溶液(即注射前将6wt％的OHA溶液分别与浓度为2wt％，4wt％，6wt％，8wt％的聚PBAimBF4离子液体等体积混合后的溶液，注射前才将两种溶液混合，不能提前混合备用)注射到猪皮肤组织表面，并将另一皮肤组织放置在水凝胶的顶部，两个皮肤组织的接触面积保持在10mm×10mm内。样品完成从溶胶到凝胶的改变后，在室温下，使用电子万能试验机以5mm/min的速率进行搭接剪切测试。所有水凝胶组显示出3.36±0.89kPa至6.45±0.43kPa的粘合强度，与商业敷料(约5kPa)相似甚至更好。至于水凝胶粘附的机理，主要是因为OHA中的醛基可与组织中的氨基反应，形成化学键交联粘合；其次是由于水凝胶组含正电荷的咪唑基与黏液膜上带负电荷的唾液酸基团以及细胞膜的磷脂之间的静电相互作用。
图14是建立小鼠肝出血模型以确认PIL-OHA-6水凝胶的止血能力。将小鼠麻醉后，固定在手术软木板上。通过腹部切口暴露其肝脏，仔细去除肝脏周围的浆液，将放在石蜡膜上预称重过的滤纸放在肝脏下，用20G针诱导肝脏出血，用注射器注射50μL PIL-OHA-6水凝胶的前体溶液到出血部位。3min后，对吸收血液的滤纸称重，并与对照组(刺肝后无治疗)进行比较。图14a是空白对照组和本发明制得的PIL-OHA-6水凝胶的止血能力对比图，图14b是空白对照组和本发明制得的PIL-OHA-6水凝胶的止血能力统计图。用针头诱导小鼠肝脏出血后，对照组的血流量约为313.50±9.53mg，在滤纸上有明显的血流痕迹。而在PIL-OHA-6水凝胶组仅出现42±6.28mg的血流量，且在滤纸上没有明显的血迹，表明该水凝胶在体内具有良好的止血能力。
为了在实验中获得最佳的交流电刺激参数，通过CCK-8法研究在PIL-OHA-6水凝胶敷料上的细胞存活率，所选参数为0-7V、25-100Hz。结果表明，每个参数电刺激下的细胞活力均高于空白对照组(100％)，且细胞活力最大时的ES参数为：3V，25Hz和0.5h。图15a是我们在细胞单层中创建了“伤口”，在细胞迁移的过程中定期拍摄图像，来确定细胞迁移速率。图15b是经空白对照组、ES组、PIL-OHA-6水凝胶组以及ES+PIL-OHA-6水凝胶组治疗6h前后的体外细胞划痕面积的量化统计图。与对照组相比，PIL-OHA-6水凝胶增强了细胞的迁移。当ES单独作用时，在ES停止后，细胞迁移也随之停止。当ES作用在PIL-OHA水凝胶上0.5h时，剩余的划痕区域明显减少，随着电场的消失，细胞的迁移还在继续，孵育6h后，划痕面积减少到36.25±4.76％。该实验中的ES参数为最优参数：3v，25Hz和0.5h。接下来的实验过程中，采用的ES均采用本实验中的最优ES参数。
图16a为评估PIL-OHA水凝胶耦合ES对糖尿病伤口愈合的功效并使用商业TegadermTM薄膜作为对照组(Contro1)。随机选择了成功建模的糖尿病小鼠腹腔注射10％的水合氯醛来实现全身麻醉。随后，使用无刺激性的脱毛膏脱去小鼠背部的毛发，用酒精棉消毒后，使用剪刀和镊子在其背部创建一个8mm×8mm的方形全厚度皮肤缺损(深度到达肌膜)，并采用不同的方法对其进行治疗。随着术后时间增加，所有组的伤口面积都逐渐减小。治疗14天后，经ES+PIL-OHA-6水凝胶组处理后的伤口基本闭合，并长出了毛发。图16a是第0、3、7和14天用不同方案治疗糖尿病皮肤伤口的图像，图16b是第0、3、7和14天用不同方案治疗糖尿病皮肤伤口后愈合程度的折线图。在整个修复过程中(14天)伤口面积的定量分析中：ES+PIL-OHA-6水凝胶组的伤口愈合率(97.66％)远远大于商业TegadermTM薄膜组(84.52％)和ES组(62.31％)。
图17a-g是经不同方案治疗糖尿病模型小鼠后背创建全厚度皮肤切口后伤口组织的H&E染色图。在治疗后的第14天，收集完整的伤口和伤口周围2mm内的正常皮肤组织。使用4％的多聚甲醛将样品固定过夜，然后通过固定脱水器脱水，包埋在石蜡中后，将样品切成4μn切片，以进行苏木精和曙红(H&E)染色，图17a是经商业TegadermTM薄膜治疗糖尿病伤口14天后的H&E染色图，图17b是经PIL-OHA-2水凝胶治疗糖尿病伤口14天后的H&E染色图，图17c是经PIL-OHA-4水凝胶治疗糖尿病伤口14天后的H&E染色图，图17d是经PIL-OHA-6水凝胶治疗糖尿病伤口14天后的H&E染色图，图17e是经PIL-OHA-8水凝胶治疗糖尿病伤口14天后的H&E染色图，图17f是经ES治疗糖尿病伤口14天后的H&E染色图，图17g是经ES+PIL-OHA-6水凝胶治疗糖尿病伤口14天后的H&E染色图。由图可知，ES+PIL-OHA-6水凝胶组表现出较厚的表皮和更规则的结缔组织。
图18是用不同方案治疗糖尿病模型小鼠后背创建全厚度皮肤伤口14天后，创面组织的肿瘤坏死因子TNF-α的免疫荧光染色图，从左至右，依次为DAPI染色的细胞核图，TNF-α的荧光图，二者的叠加图；从上至下，依次是商业TegadermTM、PIL-OHA-2、PIL-OHA-4、PIL-OHA-6、PIL-OHA-8、ES、ES+PIL-OHA-6的免疫荧光染色图。在治疗后的第14天收集组织切片用5μg/mLTNFA抗体染色，切片甩干后滴加与一抗相应的二抗覆盖组织，避光孵育50min后，将切片用PBST冲洗并用DAPI染液复染细胞核，在倒置荧光显微镜下观察并采集图像。在伤口的整个愈合过程中，TNF-α的表达随着聚PBAimBF4离子液体含量的增加而逐渐降低，这是因为水凝胶中含有的正电荷基团杀死了伤口部位的病原体，从而降低了伤口感染的风险。
图19是用不同方案治疗糖尿病模型小鼠后背创建全厚度皮肤伤口14天后，创面组织的生长因子VEGF的免疫荧光染色图，从左至右，依次为DAPI染色的细胞核图，VEGF的荧光图，二者的叠加图；从上至下，依次是商业TegadermTM、PIL-OHA-2、PIL-OHA-4、PIL-OHA-6、PIL-OHA-8、ES、ES+PIL-OHA-6的免疫荧光染色图。在手术后的第14天收集组织切片用5μg/mL VEGFA抗体染色，切片甩干后滴加与一抗相应的二抗覆盖组织，避光孵育50min后，将切片用PBST冲洗并用DAPI染液复染细胞核，在倒置荧光显微镜下观察并采集图像。由图19可知，ES+PIL-OHA-6水凝胶组的表达最高。