一种改善肿瘤微环境的钌基抗肿瘤纳米药物的制备方法
阅读说明：本技术 一种改善肿瘤微环境的钌基抗肿瘤纳米药物的制备方法 (Preparation method of ruthenium-based anti-tumor nano-drug for improving tumor microenvironment ) 是由 高大威 李春慧 丛聪 张旭武 刘志伟 李晓玲 于 2021-01-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种改善肿瘤微环境的钌基抗肿瘤纳米药物的制备方法,属于纳米药物技术领域,称取大豆卵磷脂、胆固醇和阿托伐醌,加无水乙醇溶解制得含阿托伐醌的脂质体脂相混合液,然后将其旋蒸使脂相成膜；将钌纳米颗粒用水重悬并向其中加入磷酸缓冲液,混匀后加入吐温80得到含钌的水相混合液；将水相混合液加至脂相膜中,混匀后超声。本发明可以阻断线粒体的呼吸链,缓解肿瘤组织的缺氧情况；释放的纳米酶能够利用增加的氧气消耗肿瘤部位的葡萄糖,减少ATP的产生,在对肿瘤部位进行饥饿治疗同时产生过氧化氢,同时利用肿瘤微环境的过氧化氢进行类芬顿反应产羟基自由基,从而实现良好的抗肿瘤效果；本发明制备方法简便易行,可以规模化生产。(The invention relates to a preparation method of a ruthenium-based anti-tumor nano-drug for improving a tumor microenvironment, which belongs to the technical field of nano-drugs, and comprises the steps of weighing soybean lecithin, cholesterol and atovaquone, adding absolute ethyl alcohol to dissolve the soybean lecithin, the cholesterol and the atovaquone to prepare a liposome lipid phase mixed solution containing the atovaquone, and then carrying out rotary evaporation on the liposome lipid phase mixed solution to form a membrane; re-suspending the ruthenium nanoparticles with water, adding a phosphate buffer solution into the re-suspended ruthenium nanoparticles, uniformly mixing, and adding tween 80 to obtain a ruthenium-containing water-phase mixed solution; adding the water phase mixed solution into the lipid phase membrane, mixing uniformly and performing ultrasonic treatment. The invention can block the respiratory chain of mitochondria and relieve the hypoxia condition of tumor tissues; the released nano enzyme can consume glucose at the tumor part by using increased oxygen, reduce the generation of ATP, generate hydrogen peroxide while performing starvation treatment on the tumor part, and generate hydroxyl free radicals by using the hydrogen peroxide in a tumor microenvironment to perform Fenton-like reaction, so that a good anti-tumor effect is realized; the preparation method is simple and easy to implement, and can be used for large-scale production.)
技术领域
本发明涉及一种改善肿瘤微环境的钌基抗肿瘤纳米药物的制备方法，属于纳米药物技术领域。
背景技术
我国每年新发的恶性肿瘤约有380万人，死亡约30万人。虽然癌症的研究取得了一定的进展，但目前癌症仍然是发病率较高的疾病之一。目前常用的治疗方式有手术治疗、化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫疗法、基因治疗和光疗等。这些治疗方法虽然都能起到一定的效果，但都有其局限性或者存在一定的毒副作用。
纳米酶作为一种很有前途的天然酶替代品，既具有酶的活性，又具有纳米材料的特性。钌（Ru）是铂族金属中的一员，但其成本较低；钌基纳米酶是最近新兴的纳米酶，肿瘤细胞内的糖酵解活跃，能利用葡萄糖在短时间内产生较多能量及代谢产物，而钌基纳米酶能够催化葡萄糖和O2反应，消耗肿瘤细胞的能量来源。但这一反应过程需要氧气的参与，然而，研究发现，肿瘤组织及周边是一种极度缺氧的环境，氧含量的不足极大地限制了纳米酶治疗的效果。
因此，探索一种能够基于阻断肿瘤细胞内的糖酵解反应进而切断肿瘤能量供应，并且能够同时改善肿瘤缺氧环境的抗肿瘤作用的纳米药物，可以实现很好的抗肿瘤作用，具有重要的社会意义。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种改善肿瘤微环境的钌基抗肿瘤纳米药物的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种改善肿瘤微环境的钌基抗肿瘤纳米药物的制备方法，所述钌基抗肿瘤纳米药物为澄清透明的钌/阿托伐醌脂质体，其制备方法包括以下步骤：
(1)分别称取一定量的大豆卵磷脂、胆固醇和阿托伐醌，加入无水乙醇溶解，制得含阿托伐醌的脂质体脂相混合液；
(2)将步骤（1）制备的含阿托伐醌的脂质体脂相混合液置于旋转蒸发仪上旋蒸，使脂相成膜；
(3)将钌纳米颗粒用一定量的水重悬后，向其中加入一定比例的磷酸缓冲液，混合均匀后加入一定量的吐温80，混合均匀，得到含钌的水相混合液；
(4)将步骤（3）得到的含钌的水相混合液加至步骤（2）制得的膜中；
(5)将步骤（4）得到的液体混匀后超声得到澄清透明的钌/阿托伐醌脂质体。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤（1）中脂相混合液的大豆卵磷脂、胆固醇、阿托伐醌和无水乙醇的配比为40-70 mg：4-7 mg：0.85-1.5 mg：8-12 mL。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤（2）中旋转蒸发仪的旋蒸温度为40-50℃，旋蒸时间为0.5-4 h。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤（3）中含钌的水相混合液的磷酸缓冲液、水和吐温80的体积比为400-500：9500-9600：5-15。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤（3）中的钌纳米颗粒是经硼氢化钠还原三氯化钌得到的钌纳米颗粒，所述钌纳米颗粒的大小为5-20 nm。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤（5）中的超声功率为200-800 W，超声时间为5-20 min。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述钌基抗肿瘤纳米药物的平均粒径为150-250 nm。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
本发明可以阻断线粒体的呼吸链，进而缓解肿瘤组织的缺氧情况；释放的纳米酶能够利用增加的氧气消耗肿瘤部位的葡萄糖，减少ATP的产生，在对肿瘤部位进行饥饿治疗同时产生过氧化氢，同时利用肿瘤微环境的过氧化氢进行类芬顿反应产羟基自由基，从而实现良好的抗肿瘤效果。
本发明具有良好的生物相容性，可以通过脂质体实现药物的缓慢释放，释放的阿托伐醌还可以影响二氢乳酸脱氢酶的活性，阻止嘧啶合成，进一步给肿瘤细胞造成致死作用。
本发明钌/阿托伐醌脂质体中的Ru NPs是经过简单的一步还原方法获得，并被包裹在脂质体的水相中，制备方法简便易行，可以规模化生产。
附图说明
图1是本发明实施例1获得的钌基抗肿瘤纳米药物的TEM图；
图2是本发明实施例1获得的钌基抗肿瘤纳米药物的粒径分布图；
图3是本发明实施例1获得的钌基抗肿瘤纳米药物的zeta电位图；
图4是本发明实施例2获得的钌基抗肿瘤纳米药物在酸性条件下钌纳米粒子及阿托伐醌释放的TEM图；
图5是Hela细胞与培养基以及本发明实施例3获得的钌基抗肿瘤纳米药物共孵育后的细胞存活率图；
图6是本发明实施例2获得的钌基抗肿瘤纳米药物治疗后小鼠体重变化；
图7是本发明实施例3获得的钌基抗肿瘤纳米药物治疗后肿瘤重量变化。
具体实施方式
下面将结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行详细描述，以便于本领域技术人员理解，但不以任何方式限制本发明。实施案例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
称量大豆卵磷脂40 mg、胆固醇4 mg、阿托伐醌0.85 g，加入8mL无水乙醇溶解得到含阿托伐醌的脂质体脂相混合液，然后将其置于旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）上，50℃旋蒸0.5 h，脂相在瓶底成膜；将400 μL pH为6.5的磷酸缓冲液和9.6 mL的超纯水重悬的钌纳米颗粒混合均匀，再加入5 μL的吐温80，混匀后加入脂相膜中，再旋转混合30 min，所得溶液用细胞破碎仪在800 W条件下超声5 min，即得到负载钌纳米颗粒和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip。
应用透射电子显微镜对负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip进行形貌表征，如图1所示，钌纳米粒子包载在脂质体内，纳米脂质体[email protected]@Lip的粒径大概在140 nm左右。应用激光粒度仪对负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip进行表征，如图2所示，负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip的平均粒径是150 nm左右，与透射电镜结果相符。如图3所示，钌纳米粒子的zeta电位是18 mV，而[email protected]@Lip的zeta电位是- 7.5mV。从电位的变化情况可以确定钌纳米颗粒被包覆在脂质体内。
实施例2
称量大豆卵磷脂52 mg、胆固醇5.6 mg、阿托伐醌1.0 mg，加入10mL无水乙醇溶解得到含阿托伐醌的脂质体脂相混合液，然后将其置于旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）上，45 ℃旋蒸2.5 h，脂相在瓶底成膜；450 μL pH 6.5的磷酸缓冲液和9.55 mL的超纯水重悬的钌纳米颗粒混合均匀，加入10 μL的吐温80，混匀后加入脂相中，旋转混合35 min，所得溶液用细胞破碎仪在500 W条件下处理10 min，即得到负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip。
应用透射电子显微镜对负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip进行初步形貌表征，可以得出，钌纳米粒子包载在脂质体内，纳米脂质体[email protected]@Lip的粒径大概在140nm左右。应用激光粒度仪对负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip进行表征，可以看出，负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip的平均粒径是150 nm左右，与透射电镜结果相符。应用激光粒度仪对负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip进行表征，钌纳米粒子的zeta电位是18 mV，[email protected]@Lip的zeta电位是-7.5 mV。从电位的变化情况可以得出钌纳米颗粒包覆在脂质体内。
为了证明钌粒子可以在酸性条件下发生类芬顿反应，从而使脂质体结构破坏以达到药物释放的目的，采用透射电子显微镜对酸性条件处理的负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip进行形貌表征，如图4所示，可以看到酸性条件下纳米脂质体[email protected]@Lip结构的破坏及其内部药物的释放。
研究负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip对宫颈癌U14荷瘤小鼠的抗肿瘤效果，尾静脉方式给药14天，每天给药量200 μL，给药期间记录小鼠的体重变化，结果如图6，从小鼠的体重变化曲线可以看出，注射负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip的小鼠跟生理盐水组相比体重没有明显差别，说明纳米脂质体[email protected]@Lip不会损伤小鼠的身体，生物安全性高。
实施例3
称量大豆卵磷脂74 mg、胆固醇7.0 mg、阿托伐醌1.5 mg，加入12 mL无水乙醇溶解得到含阿托伐醌的脂质体脂相混合液，然后将其置于旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）上，40℃旋蒸4 h，脂相在瓶底成膜；500 μL pH6.5的磷酸缓冲液和9.5 mL的超纯水重悬的钌纳米颗粒混合均匀，再加入15 μL的吐温80，混匀加入脂相中，再旋转混合30 min，所得溶液用细胞破碎仪在200 W条件下处理20 min，即得到负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip。
应用透射电子显微镜对负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体药物进行初步形貌表征，从透射电镜结果图可以看出，钌纳米粒子包载在脂质体，纳米脂质体[email protected]@Lip的粒径大概在140 nm左右。应用激光粒度仪对负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip进行表征，可以看出，负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip药物的平均粒径是150 nm左右，与透射电镜结果相符。应用激光粒度仪对负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip进行表征，钌纳米粒子的zeta电位是18 mV，[email protected]@Lip的zeta电位是- 7.5 mV.从电位的变化情况可以得出钌纳米颗粒包覆在脂质体内。
为证明钌粒子可以在酸性条件下发生类芬顿反应导致使脂质体结构破坏，进而达到药物释放的目的，采用透射电子显微镜对酸性条件处理的负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip进行形貌表征，从电镜结果图中可以看出，纳米脂质体结构的破坏，内部药物的释放。
通过将HeLa细胞与培养基以及不同组药物共孵育（负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip、负载钌的纳米脂质体[email protected]、负载阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]、钌、阿托伐醌），分别对细胞存活能力进行表征，如图5所示，可以看出单独的钌、单独的阿托伐醌组都对细胞有一定程度的杀伤作用，但包载于脂质体内之后，其生物安全性提高了，表明脂质体的包覆能减少药物对正常细胞的毒副作用；而脂质体包载钌和阿托伐醌并与细胞膜杂化之后，细胞存活率明显降低，表明二者有相互促进的杀伤癌细胞能力。
为表征药物在体内的肿瘤治疗效果，分别给宫颈癌U14荷瘤小鼠注射制得的纳米药物、生理盐水、[email protected]和[email protected]，给药14天，每天给药量200 μL，如图7所示，注射负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip的小鼠的肿瘤重量明显小于生理盐水组相的肿瘤重量，说明负载钌和阿托伐醌的纳米脂质体[email protected]@Lip具有很好的肿瘤抑制效果。