具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1化合物组合的萃取和分离

一种在哺乳动物血液中预防血栓形成，并能够溶解血液中已形成血栓的药物的制备方法，包括以下步骤：

1.将2020年9月份于贵州省黔西南布依族苗族自治州海拔1000-1400米处采集的蓝布正全草洗净、阴干、切成碎片。

2.将蓝布正干燥碎片(2公斤)用8倍的石油醚中回流提取8个h，将石油醚回收，提取物主要含有脂溶性的无预防血栓形成，也无在血液中溶解已形成血栓的活性，并且有肝毒性化合物，因此弃之；

3.将以上用石油醚提取过的蓝布正原料用10倍浓度为60％的乙醇回流提取8h，将乙醇的提取液浓缩并喷雾干燥成固体粉末，得到乙醇提取物；

4.将乙醇提取物溶混悬于10倍的水中，用等容积的乙酸乙酯进行充分萃取，进一步去除叶绿素，以及极性较小的化合物，将乙酸乙酯回收，其提取物还含有相对脂溶性的叶绿素和残留的肝毒性化合物，弃之；

5.将以上用乙酸乙酯提取过的，进一步去除肝毒性化合物的乙醇萃取液浓缩、低温(4℃)放置24h、过滤、浓缩、减压干燥得到蓝布正活性化合物组合。

6.获得的蓝布正化合物组合可以进一步通过反向柱层析的方法分离出单体多酚类化合物和五环三萜类化合物。经过质谱和核磁共振分析，其主要成分为，多酚类化合物：如Gemin A、鞣花酸(Ellagic acid)、没食子酸(Gallic acid)，和五环三萜类化合物：如苦莓苷F1(niga-ichigoside F1)及其甙元、翻白叶苷A(potengrtilloside A)、委陵菜酸(Tormentic acid)等。

以下实施例均使用该化合物组合作为实验药剂。

实施例2化合物组合对小鼠凝血时间(CT)的影响

选用基础生理凝血时间在40～160S的雄性实验小鼠用于实验，根据凝血时间均匀分布为基础进行分组。随机分为；

1组.(n＝15)正常组，0.5％羧甲基纤维素钠(CMC—Na)溶液；

2组.(n＝15)阳性对照组，20mg/kg阿司匹林；

3组.给药组分别给予200、400、600mg/kg体重活性组合。各组均口服给药，每日1次。给药组的三个剂量组的动物数均为15只。

三组动物均连续给予上述口服处理3天，于末次给予相应的口服处理后1h后，用内径1mm玻璃毛细管插入小鼠内眦球后静脉丛取血，自血液流入管中开始计时，血液注满后取出毛细管平放于干净消毒的皿中，每隔30S折断两端小段毛细管，并将折断的毛细管缓慢向左右拉开，观察折断处是否有血凝丝出现，直至在折断处出现血凝丝时停止计时，所得时间即为CT。

结果表明，正常组实验动物的凝血时间没有显著改变，而阳性药和化合物组合高、中、低剂量组实验动物的凝血时间显著延长。化合物组合低、中、高剂量组的凝血时间与正常组相比有显著延长(P<0.05、0.01、0.01)，提示化合物组合可能影响小鼠的凝血时间，结果见表1。

表1活性组合对小鼠凝血时间(CT)的影响

与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01

与本组给药前比较：++P<0.01

实施例3化合物组合对实验动物出血时间的影响

昆明种雄性小鼠，随机分为3组。

1组.(n＝8)正常组，0.5％羧甲基纤维素钠(CMC—Na)溶液；

2组.(n＝8)阳性对照组，20mg/kg阿司匹林；

3组.给药组分别给予200、400、600mg/kg活性组合。各组均口服给药，每日1次。给药组的三个剂量组的动物数均为8只。

各组实验动物均口服给药，每日1次，连给3天，末次给药后1h取小鼠置于固定器中，使其尾部垂直，距尾尖1.5mm处剪断，用滤纸吸血直至吸不出血为止。记录断尾尖至吸不出血的时间即为尾出血时间。.

结果表明，阿司匹林组和活性组合各剂量组的尾出血时间均明显长于正常组(P<0.01、0.05、0.01、0.01)(表2)。

表2活性组合对实验动物出血时间的影响

与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01

实施例4化合物组合对实验动物体外血栓形成的影响

SD大鼠(250克)，随机分为3组。

1组.(n＝8)正常组，0.5％羧甲基纤维素钠(CMC—Na)溶液；

2组.(n＝8)阳性对照组，10mg/kg阿司匹林；

3组.给药组分别给予200、400、600mg/kg活性组合，给药组的三个剂量组的动物数均为8只。各组均口服给药，每日1次，给药5天。末次给药1个h后，取已硅化的塑料管旋转环(直径4mm)，大鼠眼眶取血1mL，迅速注入血栓环内，将塑料管联结成圆环，迅速放入血栓仪金属转盘的凹糟中，立即计时。启动转盘，37℃下转动15min，转速为16r/min。完成后停止转动，取出血栓，以滤纸吸干血液，称量血栓的湿重后。将血栓置入60℃，烘24h，然后称血栓的干重。

结果表明，阿司匹林组和化合物组合各剂量组与正常组大鼠比较，血栓湿质量与干质量都显著较轻(P<0.05、0.01、0.01、0.01)(表3)。

表3化合物组合对实验动物体外血栓形成的影响

与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01

实施例5化合物组合对大鼠下腔静脉血栓形成的影响

SD大鼠(250克)，随机分为3组。

1组.(n＝8)正常组，0.5％羧甲基纤维素钠(CMC—Na)溶液；

2组.(n＝8)阳性对照组，10mg/kg阿司匹林；

3组.给药组分别给予200、400、600mg/kg活性组合，给药组的三个剂量组的动物数均为8只。各组均口服给药，每日1次，给药5天。末次给药1个h制作静脉血栓模型。用3％戊巴比妥钠0.1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠。待麻醉生效后，沿大鼠腹中线打开腹腔，分离下腔静脉，在左肾静脉下方水平处结扎下腔静脉，缝合腹壁。3h后重新打开腹腔，在原结扎处下方2cm处夹闭血管。然后纵向剪开两次结扎之间的下腔静脉管腔，用滤纸条吸去血管内血液并观察有无血栓形成。如果血栓已经形成，小心取出血栓，立即天平称重为血栓湿质量。然后于60℃干燥24h后称重为血栓干质量。然后计算血栓抑制率。

血栓抑制率＝(正常组血栓质量一给药组血栓质量)/正

常组血栓质量×100

结果表明，活性组合高、中、低剂量都能够显著抑制下腔静脉的血栓形成(P<0.01、0.01、0.01)(表4)。

表4活性组合对大鼠下腔静脉血栓形成的影响

与正常组比较：**P<0.01

实施例6化合物组合体外溶解全血血栓块的活性

取健康人静脉血于聚氯乙烯管中(直径0.34cm)，将管置于倾斜位置于室温下让其凝固，60分钟后用注射器推出血凝块，用10ml 0.9％的氯化钠生理盐水清洗血凝块去除残留的血清，然后并将血凝块切成0.15cm³大小24块备用。将备用的血凝块分装于24个试管中。分为如下组别:

1.对照(n＝6)，将三个试管中分别加入5ml 0.9％的氯化钠生理盐水；

2.高剂量(n＝6)，将三个试管中分别加入含有活性组合物(100mg)的5ml 0.9％的氯化钠的生理盐水；

3.中剂量(n＝6)，将三个试管中分别加入含有活性组合物(50mg)的5ml 0.9％的氯化钠生理盐水；

4.低剂量(n＝6)，将三个试管中分别加入含有活性组合物(25mg)的5ml 0.9％的氯化钠生理盐水。

以上样本均置于37℃水浴中。然后分别在培育24h后，将各试管中的血栓取出，称量其重量，然后算出各组不同处理的溶栓率：

[(血栓的起始湿重均值–各处理组培育24h后血栓的湿重均值)/血栓的起始湿重均值]×100％

然后，将血栓重新置入各自所属的试管中，每个试管加入1ml健康人血清，然后将这些试管均置于37℃水浴中，再培育24h。然后将各试管中的血栓(如果有)取出，称量其重量，然后除以各不同试管中血栓在加入血清前的起始湿重。

实验结果表明，在无血清加入的条件下，无论是高、中、或者低剂量化合物组合处理血栓，在培育24h后都未发现有溶栓作用，各组(1-4组)的血栓重量基本没有显著差别(图1)。值得兴奋的是，在试管内加入1ml血清后，高、中、或者低剂量活性组合处理血栓组，在培育24h后，与对照生理盐水组相比，都发现有显著的溶解血栓的作用(P<0.01、0.01、0.01)(图2)。其中高剂量溶栓率达到80％，中剂量组达到87％，低剂量组达到58％。这些结果提示，化合物组合本身没有完整的溶栓作用，因为在向试管中加入血清之前，并未发现化合物组合有任何明显的溶栓作用，而加入了血清之后，就表现了化合物组合剂量依赖性溶解血栓的作用。

实施例7活性组合溶解人类血液中微血栓形成的作用

在河北医科大学第一附属医院心血管病科来四个在外周血液涂片中发现大量的微血栓(透明血栓)的患者。检查还发现这些患者血液中的血细胞也互相凝集粘连成团状、串状、或树枝状形态。然而用化合物组合(1g每次，一天2次)口服治疗患者一周后，所有四个患者外周血涂片中治疗前曾经发现的大量微血栓都消失了，并且严重凝集的血细胞也显著好转。治疗两周后，所有四个患者的外周血涂片不仅未发现任何微血栓，并且血细胞的凝集状态也完全恢复到正常，血细胞的形态也恢复正常，互相很好的互相分离。

实施例8化合物组合溶解动脉血栓和静脉血栓的作用

一位在河北医科大学第一附属医院住院男性患者(65岁)，于就诊2个月前发生急性心脏前壁心肌梗塞，心脏B型超声心动图检查发现左室前壁透壁梗死部位内侧有一个直径约1.5cm的血栓。

该患者饭前口服化合物组合(1g/次，每天2次)。连续服用化合物组合一周后，用超声心动图复查心脏发现血栓的体积明显变小，再连续服用化合物组合一周后，用超声心动图复查心脏发现血栓的体积进一步显著变小。连续服用化合物组合一个月后，用超声心动图复查心脏发现左室前壁透壁梗死部位内侧的血栓完全消失。

采用下腔静脉结扎法建立大鼠深静脉血栓模型。实验分为三组：治疗组(n＝6，400毫克化合物组合/公斤体重，溶解水中灌胃，每天一次)；对照组(n＝6，等量生理盐水灌胃，每天一次)。于造模后第七天处死老鼠，下腔静脉血栓形成段将静脉壁与血栓分离，血栓称重。每只老鼠处死前抽取外周静脉血，用于凝血四项检查。

结果表明，第七天时，和对照组平均血栓重量相比较，经灌胃化合物组合的大鼠深静脉血栓的重量(0.008±0.002g vs 0.065±0.017g)明显低(P<0.01)。然而连续七天的化合物组合灌胃却未对实验动物的凝血酶时间、凝血酶原时间以及活化部分凝血酶时间产生统计学差异的影响。

由此表明，化合物组合不但可以显著加强大鼠深静脉血栓的溶解，并且不会增加出血的倾向。化合物组合这种溶解已形成血栓的特性可能需要与血液中的纤容系统中的活性因子共同作用，因为在体外去除血清，该化合物组合就失去了溶解血栓的作用。

患者男单右下肢深静脉血栓(2例)，女单左右下肢深静脉血栓(2例)，患者有下肢肿胀、疼痛、及局部肌肉压痛，病程大于一个月。血管B超声检查发现深静脉管腔内有低回声充填，致管腔完全或不完全闭塞。给予4位患者口服化合物组合(1.5g/次，2次/每天)，口服一个月。服用2周左右时，复查患者发现所有四位病例的患肢肿胀及疼痛症状都显著减轻或完全消失，局部肌肉压痛也显著减轻。服药四周后，患肢肿胀，疼痛和肌肉局部压痛的症状全部消失。经多普勒超声检查显示，静脉血栓影像消失，血流通畅，也未发现附壁血栓征象。

综上所述，本发明提供了一种在哺乳动物血液中预防血栓形成，或溶解已形成的静脉血栓、动脉血栓、微血栓的药物及其制备方法。其中预防血栓形成、溶解已形成血栓的药物包括从蓝布正萃取分离的化合物组合；所述化合物组合主要包括多酚类化合物：如Gemin A、鞣花酸(Ellagic acid)、没食子酸(Gallic acid)，和五环三萜类化合物：如苦莓苷F1(niga-ichigoside F1)及其甙元，翻白叶苷A(potengrtilloside A)、委陵菜酸(Tormentic acid)，或者至少其中的一种。本发明的药物包括从蓝布正萃取分离的化合物组合，将该药物给予人体，可以实现预防个体的血栓形成，甚或溶解已形成的血栓。该化合物组合主要通过与血液中的凝血因子/纤溶因子协同作用来抑制血液中的血栓形成和溶解已经形成的血栓，从而达到预防和治疗在不同组织或器官内血栓形成和血栓栓塞导致的不同疾病或疾病状态。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。