一种从发酵液中提取分离β-丙氨酸的方法
阅读说明：本技术 一种从发酵液中提取分离β-丙氨酸的方法 (Method for extracting and separating beta-alanine from fermentation liquor ) 是由 冯志彬 张娟 程仕伟 张兴晓 刘冬冬 于 2021-01-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从发酵液中提取分离β-丙氨酸的方法,属于生物工程领域。所述方法为(1)发酵液除菌及大分子蛋白；(2)折波滤芯脱色(3)发酵清液经电去离子技术除去无机盐；(4)步骤(3)中清液除去小分子蛋白及部分色素物质；(5)真空浓缩；(6)向浓缩液加入乙醇并降温结晶,获得β-丙氨酸晶体。本发明方法采用折叠滤芯脱色,具有纳污能力强、再生能力强,可反复使用；采用电去离子技术兼具电渗析过程可持续性和离子交换过程脱盐彻底性,并伴随树脂电再生性；采用乙醇降温结晶,具有提取收率高,一次收率可达69％,通过母液回收处理,总收率高达91％以上,并且产品质量明显提高。(The invention discloses a method for extracting and separating beta-alanine from fermentation liquor, belonging to the field of bioengineering. The method comprises the steps of (1) degerming fermentation liquor and removing macromolecular protein; (2) decoloring by a folding filter element (3), and removing inorganic salt from the fermentation clear liquid by an electrodeionization technology; (4) removing small molecular proteins and part of pigment substances from the clear liquid in the step (3); (5) concentrating in vacuum; (6) adding ethanol into the concentrated solution, and cooling and crystallizing to obtain beta-alanine crystals. The method adopts the folding filter element for decolorization, has strong pollutant carrying capacity and regeneration capacity, and can be used repeatedly; the adoption of an electrodeionization technology has the sustainability of an electrodialysis process and the thoroughness of desalination of an ion exchange process, and is accompanied with the electrical regeneration of resin; the ethanol is adopted for cooling crystallization, the extraction yield is high, the primary yield can reach 69 percent, the total yield can reach more than 91 percent through the recovery treatment of the mother liquor, and the product quality is obviously improved.)
技术领域
本发明涉及一种从发酵液中提取分离β-丙氨酸的方法，特别涉及一种利用电去离子技术除去β-丙氨酸发酵液中无机盐及乙醇结晶的提取分离方法，属于生物工程领域。
背景技术
β-丙氨酸是自然界中唯一存在的β型氨基酸，一种非蛋白氨基酸，在生物体内，β-丙氨酸不参与蛋白质和酶的合成，属于非蛋白氨基酸，但是一种潜在的功能性氨基酸。β-丙氨酸是多种物质的前体，在医药、食品、化工、饲料等方面有广泛应用，如在医药领域中，β-丙氨酸主要用于合成泛酸以及泛酸钙，是酰基载体蛋白(ACP)和辅酶A(CoA)的前体，而其在帮助细胞再生、协助中枢神经系统正常发育过程和参与蛋白质、脂肪、糖在体内的新陈代谢中起到重要的生理功能。它是12种最具潜力的三碳化工产品之一。
目前国内外生产β-丙氨酸的方法有化学法、酶转化法和发酵法。由于化学法工艺繁琐、能耗高及环境污染严重；酶转化法存在底物成本高且不可再生；由于近年来燃料消耗等造成的气候变化和环境问题日益严峻，探求清洁环保的生产方法如直接发酵法越来越引起人们的关注，目前β-丙氨酸发酵产量提高至65g/L左右，为满足中试和规模发酵生产，需要研究发酵液中提取精制β-丙氨酸生产工艺。
氨基酸发酵液中含有多种物质，如包括产物、副产物、培养基残留物质及菌体等，发酵产物的提取分离在生产中占有极为重要的位置，提取过程中需把发酵液中产物外的其它杂质去除，以期获得高质量的产物。目前β-丙氨酸生产方法主要为酶转化法，转化液中仅含有微量的无机盐，不需要除盐；而发酵液中含有多种无机盐且含量高，需要进行脱盐处理，单独使用离子交换树脂，树脂污染严重且引起树脂结构破坏而失去再生能力，同时高含量的离子物质会使树脂快速达到饱和，需再生后才能继续使用，提高了运行成本及污水排放量等问题。单独利用电渗析可以实现脱盐效果，但脱盐时间久，特别是后期脱盐速率十分缓慢。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种从发酵液中提取β-丙氨酸方法。
本发明是通过如下技术方案来实现的:
一种从发酵液中提取分离β-丙氨酸的方法，具体方法如下：
(1)发酵液除菌体：将含有β-丙氨酸发酵液通过截留分子量100nm的微滤膜，彻底除去发酵液中菌体及大分子蛋白，获得β-丙氨酸发酵清液；操作压力0.4MPa，操作温度为20-30℃，透析水量以体积百分比计占进料发酵液体积10％-80％；
(2)脱色：将步骤(1)得到的β-丙氨酸发酵清液，经折叠滤芯脱色，β-丙氨酸溶液温度40-80℃，压力0.05-0.4MPa，流出液即为脱色清液；
(3)电去离子技术脱盐：将步骤(2)得到的脱色清液，其电导率10-50mS/cm，调节至等电点pH5-7，经过电渗析与离子交换树脂耦合装置，也即是EDI装置，阴阳离子树脂按体积比1:2-2:1混合填充进EDI装置的淡室中，操作温度为10-50℃，浓室加水量为0.5-3倍体积的脱色清液，淡室电导率与浓室电导率比保持15倍以内，在20-60V电压下连续运行，淡室电导率达到1mS/cm以下时停止运行，得到除盐清夜，β-丙氨酸损失率5％以内；
(4)除盐清液中小分子蛋白及部分色素的去除：将步骤(3)得到的β-丙氨酸除盐清液，通过截流量为500-3000D的纳滤膜去除小分子蛋白及部分色素物质，得到透明无色的β-丙氨酸溶液，操作压力为0.5-3MPa，操作温度为10-60℃，透析水量以体积百分比计占进料发酵液体积10％-80％；
(5)发酵液浓缩：将步骤(4)中得到的β-丙氨酸溶液进行真空浓缩，真空度0.05-0.1MPa，β-丙氨酸溶液温度50-90℃，得到浓缩液固含物为60％-90％，馏出纯水用于生产工艺用水；
(6)乙醇降温结晶：向浓缩液中加入浓缩液体积50-90％的乙醇，随后温度冷却至5-30℃，使β-丙氨酸结晶析出，离心收集析出的晶体；(7)干燥：将离心后的β-丙氨酸进行干燥，得到成品。
进一步，步骤(1)所述的β-丙氨酸发酵液是在以下发酵生产β-丙氨酸的过程：
1)种子培养：无菌水洗涤大肠杆菌工程菌斜面，接入装有种子培养基的自控发酵罐，分别控制培养温度和pH为37℃和7.0，维持溶氧为18-22％，培养10h；
2)发酵培养：按5％种量将步骤1)培养成熟的种子接入装有6L发酵培养基的10L自控发酵罐，初始发酵温度为37℃，pH为7.0，通过调节通气量、转速和罐压维持溶氧在20％左右，待菌体光密度值OD600达到10时，停止通气，搅拌转速固定为200r/min，在厌氧条件下继续培养，利用pH调节剂控制pH在7.0；待初糖浓度降低至5g/L时，流加500g/L的葡萄糖维持葡萄糖浓度在5g/L左右，42h结束发酵获得β-丙氨酸发酵液；发酵培养基的成分及终浓度为葡萄糖30-80g/L、氯化铵5-10g/L、甘蔗糖蜜5-20g/L、KH2PO4 1-5 g/L、MgSO4 1-3g/L、酵母浸粉0-10g/L、麸皮水解液0-10g/L、玉米浆0-10g/L、菌体水解液0-20g/L、生物素50-200μg/L、DL-蛋氨酸0.1-2g/L、L-苏氨酸0.1-2g/L、烟酰胺1-10mg/L、维生素B1 1-10mg/L、ZnSO4 1-10mg/L和CoCl2 1-10mg/L；
所述的菌体水解液的制作方法为：收集大肠埃希氏菌ZF009，80℃烘干至恒重，按100g/L的浓度配制菌悬液，并用NaOH调节pH至10.0，在120℃条件下水解5h，大肠埃希氏菌ZF009于2019年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，生物保藏号为CGMCC NO：17830。(大肠埃希氏菌ZF009首次公开的日期2019年9月24，专利号2019104747539，专利名称为β-丙氨酸生产菌及其制备方法和用途)。
进一步，上述步骤(1)所述的超滤膜截留分子量100nm，操作压力优选0.2-0.5MPa，操作温度优选20-30℃，透析水量以体积百分比计占进料发酵液体积10％-80％。
进一步，上述步骤(2)β-丙氨酸发酵清液，经折波滤芯脱色，β-丙氨酸溶液温度优选60-80℃，压力优选0.1-0.3MPa，流出液即为脱色清液；进一步，上述步骤(3)EDI装置，阴阳离子树脂体积比例1:1，β-丙氨酸原液电导率10-50mS/cm，pH 5.5-6.5，通过EDI装置，操作温度优选20-30℃，浓室加水量为0.5-2倍体积发酵脱色清液，淡室电导率于浓室电导率比保持15倍以内，在30-40V电压下连续运行，淡室电导率达到1mS/cm以下时停止运行，β-丙氨酸损失率5％以内。上述步骤(4)所述的纳滤膜截留分子量500-1000D，操作压力优选0.5-2MPa，操作温度优选20-30℃，透析水量以体积百分比计占进料发酵液体积10％-80％。
上述步骤(5)步骤中得到的β-丙氨酸溶液进行真空浓缩(真空度0.05-0.1MPa，β-丙氨酸溶液温度50-90℃)、得到浓缩液固含物为60％-90％，馏出纯水用于生产工艺用水。上述步骤(6)所述向浓缩液中加入浓缩液体积60-80％的乙醇，并冷却温度至10-20℃。
本发明与现有技术相比的有益效果：
(1)本发明涉及的利用折波滤芯对发酵液进行脱色，从发酵液中除盐提取分离β-丙氨酸的方法，可以反复使用，再生能力强，无需人工投活性炭，环境清洁。
(2)本发明首次将电去离子技术引入至发酵液中分离提取β-丙氨酸，代替电渗析技术，并结合乙醇降温结晶方法获得β-丙氨酸。克服了现有技术回收率低、污水排放量大、生产强度高等缺陷。两种技术的脱盐时间及脱盐率比较：相同脱盐时间下，脱盐去除率分别为98.9％、96.4％；当相同脱盐率(98.9％)时，脱盐时间分别为106min、132min，使β-丙氨酸的收率和产品质量得以提高。
(3)本发明采用微滤除菌及大分子物质，再通过折波滤芯脱色除去色素，继而通过电去离子技术除盐，并用双效浓缩对解析液进行浓缩，最后通过冷却结晶工艺得到β-丙氨酸。本发明方法发酵液脱盐效果显著，提取收率高，一次收率可达69％，母液通过回收处理，总提取率可达92％。本发明方法较易于实现工业化，提取成本相对较低，产品质量高，可以进行大批量处理。
(4)电去离子技术代替离子交换的传统技术：前者用水量最多为发酵液体积的4倍，而离子交换由于树脂需再生和洗脱，不仅用水量增加至发酵液体积的10倍，同时也产生了大量的污水，造成污水处理成本的增加。
(5)采用乙醇降温代替传统降温结晶β-丙氨酸，一次提取率提高了15％，总提取率提高了20％。
具体实施方式
以下实施例是从含有β-丙氨酸的大肠埃希氏菌ZF009发酵液中提取分离β-丙氨酸的方法，在以发酵菌种获得的发酵液中提取β-丙氨酸。
实施例1
β-丙氨酸发酵液生产β-丙氨酸的方法如下:
麸皮水解液和玉米浆购买于山东阳成生物科技有限公司。
菌体水解液的制作方法为：所述的菌体水解液的制作方法为：收集大肠埃希氏菌ZF009，80℃烘干至恒重，按100g/L的浓度配制菌悬液，并用NaOH调节pH至10.0，在120℃条件下水解5h，大肠埃希氏菌ZF009于2019年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，生物保藏号为CGMCC NO：17830。(大肠埃希氏菌ZF009首次公开的日期2019年9月24，专利号2019104747539，专利名称为β-丙氨酸生产菌及其制备方法和用途)。
其它试剂均为市售商品。
1)种子培养：无菌水洗涤大肠杆菌工程菌斜面，接入装有3L种子培养基的5L自控发酵罐，分别控制培养温度和pH为37℃和7.0，维持溶氧为20％左右，培养10h。
2)发酵培养：按5％种量将步骤1)培养成熟的种子接入装有6L发酵培养基的10L自控发酵罐，初始发酵温度为37℃，pH为7.0，通过调节通气量、转速和罐压维持溶氧在20％左右，待菌体光密度值OD600达到10时，停止通气，搅拌转速固定为200r/min，在厌氧条件下继续培养，利用pH调节剂控制pH在7.0；待初糖浓度降低至5g/L时，流加500g/L的葡萄糖维持葡萄糖浓度在5g/L左右，42h结束发酵，β-丙氨酸浓度为75.6g/L，糖酸转化率66.2％。其中发酵培养基为：葡萄糖80g/L，甘蔗糖蜜10g/L、氯化铵10g/L、KH2PO4 3g/L、MgSO4 1g/L、菌体 水解液20g/L、玉米浆3g/L、生物素100μg/L、DL-蛋氨酸0.1g/L、L-苏氨酸0.1g/L、烟酰胺5mg/L、维生素B1 5mg/L、ZnSO4 2mg/L、CoCl2 2mg/L。
从上述β-丙氨酸发酵液中提取β-丙氨酸的方法如下:
(1)发酵液除菌体：将含有β-丙氨酸发酵液通过截留分子量100nm的微滤膜，彻底除去发酵液中菌体及大分子蛋白，获得β-丙氨酸发酵清液。操作压力0.4MPa，操作温度为20-30℃，透析水量以体积百分比计占进料发酵液体积10％-80％。
(2)脱色：除菌后得到的β-丙氨酸发酵清液，经折叠滤芯脱色，β-丙氨酸溶液温度60℃，压力0.3MPa，流出液即为脱色清液。
(3)电去离子技术脱盐：经折叠滤芯得到的β-丙氨酸发酵脱色清液，调节至等电点pH 6，经过电渗析与离子交换树脂耦合装置(EDI装置，阴阳离子树脂按体积比1:1混合填充进EDI装置的淡室中)，操作温度为30℃，浓室加水量为0.5-3倍体积发酵脱色清液，淡室电导率于浓室电导率比保持15倍以内，在30V电压下连续运行，淡室电导率达到1mS/cm以下时停止运行，损失率5％以内。
(4)除盐清液中小分子蛋白及部分色素的去除：得到的β-丙氨酸除盐清液，通过截流量为500D的纳滤膜去除小分子蛋白及部分色素物质，得到透明无色的β-丙氨酸溶液，操作压力为1.2MPa，操作温度为30℃，透析水量以体积百分比计占进料发酵液体积10％-80％。
(5)发酵液浓缩：将步骤(4)中得到的的β-丙氨酸溶液进行真空浓缩(真空度-0.1MPa，β-丙氨酸溶液温度65℃)、得到浓缩液固含物为65％，馏出纯水用于生产工艺用水。
(6)乙醇降温结晶：向浓缩液中加入浓缩液体积的60％乙醇，随后温度冷却至10℃，使β-丙氨酸结晶析出，离心收集析出的晶体。
(7)干燥：将离心后的β-丙氨酸进行干燥，得到成品结果如表1。
表1
实施例2
在实施例1基础上，步骤(2)中β-丙氨酸溶液进液温度设置为80℃，结果如表2：
表2
实施例3
在实施例2基础上，步骤(3)阴阳离子树脂按体积比2:1混合填充进EDI装置的淡室中，结果如表3：
表3
实施例4
在实施例2基础上，步骤(6)向浓缩液中加入浓缩液体积的80％乙醇，结果如表4：
表4
实施例5
在实施例4基础上，步骤(2)中折叠滤芯重复使用17次后，结果如表5：
表5
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