一种可用于亚铁离子高选择性检测的新型荧光探针制备和应用
阅读说明：本技术 一种可用于亚铁离子高选择性检测的新型荧光探针制备和应用 (Preparation and application of novel fluorescent probe for high-selectivity detection of ferrous ions ) 是由 不公告发明人 于 2019-11-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种可用于亚铁离子高选择性检测的新型荧光探针制备和应用,属于分析化学技术领域。本发明的荧光探针是包含N-O功能团的香豆素衍生物,其化学结构如式(I)所示。该荧光探针经2步即可合成,与亚铁离子作用后,在PBS缓冲溶液(10 mM,pH=7.4)中生成具有红色荧光发射能力的产物,从而实现对亚铁离子高选择性检测。此外,本发明的荧光探针还可用于环境和活细胞等不同体系中的亚铁离子的快速检测,具有很好的应用前景。式(I)。(The invention relates to preparation and application of a novel fluorescent probe for high-selectivity detection of ferrous ions, and belongs to the technical field of analytical chemistry. The fluorescent probe is a coumarin derivative containing an N-O functional group, and the chemical structure of the coumarin derivative is shown as a formula (I). The fluorescent probe can be synthesized by 2 steps, and after the fluorescent probe reacts with ferrous ions, a product with red fluorescence emission capability is generated in a PBS (10 mM, pH = 7.4) buffer solution, so that the high selectivity detection of the ferrous ions is realized. In addition, the fluorescent probe can be used for rapidly detecting ferrous ions in different systems such as environment, living cells and the like, and has good application prospect.)
技术领域
本发明涉及荧光探针，特别涉及一种可用于亚铁离子的高选择性检测的新型荧光探针的制备方法，特别还涉及该荧光分子探针在环境和生物体内的亚铁离子检测方面的应用，属于化学分析、生物分析检测技术领域。
背景技术
铁（iron，Fe）是生物体中必须的微量元素之一，也是人体中含量最丰富的过渡金属元素。铁在人体内有两种形式，一类为功能性铁，占总铁的60%以上，主要以血红蛋白的活性中心形式存在于的红细胞内；另一类为储存铁，以铁蛋白等形式存在于肝脏、网状内皮细胞和骨髓内。铁具有氧化还原活性，在球蛋白氧气运输、细胞色素电子转移、细胞色素P450氧化酶和核糖核苷酸还原酶合成、以及非血红素同源物的C–H功能化等生命体内生理活动中扮演者重要角色。但同时，其高反应性也带来了潜在的危险，如当铁含量过高时，会通过Fenton化学反应异常产生高活性氧。实际上，已有研究表明人体中过量的铁与多种严重疾病发展有关，如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病等神经退行性疾病、肝炎和间皮瘤，甚至癌症。而当铁含量过低时，会导致免疫力低下、智力降低、神经机能紊 乱等疾病，其中最常见的是缺铁性贫血。因此，开发可在生理水平条件下实现铁离子浓度检测的分析方法，对于深入了解其生理和病理功能是非常重要且有意义的。
荧光检测法因具有灵敏度高，特异性强、对生物样品损伤小、可用于实时监测等优点，成为Fe2+定量检测的研究热点。目前，已有传统的基于螯合剂的荧光探针被开发出来，然而由于Fe2+的荧光猝灭性和弱结合性，这些探针呈现出“Turn-Off”的荧光变化，且特异性较差，由于环境或其他原因也可能造成荧光淬灭，因此这类荧光淬灭型探针不适合用于Fe2+的分析检测。反之，基于特异性化学反应的荧光分子探针则可有效克服上述缺陷，从而有着更广泛的应用前景。其中，基于N-氧化物还原反应的荧光探针因具有高选择性而点而成为研究人员关注的焦点。如CN 105985299 B报道了一个含有N-O功能团的苯并噻唑乙烯类荧光探针，分别与Fe3+、钾离子、钙离子、镁离子、钠离子、铝离子以及人体内的其他离子进行作用均不能导致荧光光谱的明显改变，从而实现了对Fe2+的选择性识别，具有高特异性，针可在生理水平条件下进行Fe2+的测定。CN 109776564 A也报道了一个基于氧杂蒽结构的荧光探针，亚铁离子可以将N-氧化合物还原为羟基，并通过细胞内酯酶的水解生成具有高荧光发射能力的荧光物质，630 nm处荧光发射显著增强，通过检测响应前和响应后的荧光强度可测定细胞中亚铁离子的浓度。然而，上述荧光分子探针均存在水溶性差的问题，不适合用于生物体内的Fe2+检测。因此，开发长波长、高选择性、水溶性好的荧光探针，使其更适用于环境中和生物体内的Fe2+检测，已成为今后该类探针发展的一个重要方向。
发明内容
针对现有检测的Fe2+荧光探针存在的不足，本发明的第一个目的是在于提供一种水溶性好，且能够实现Fe2+的高特异性检测的荧光分子探针。
本发明的第二个目的是在于提供一种操作简单、原料易得的制备所述荧光分子探针的方法。
本发明的第三个目的在于提供上述荧光分子探针在水溶液和生物体内Fe2+的检测应用。
为了实现以上技术目的，本发明提供了一种荧光探针，该荧光探针的结构如式I所示：
式I
所述荧光探针的制备方法优选为：
将香豆素类衍生物（化合物1）溶解于无水乙醇中，加入2-甲基吡啶盐和哌啶，40℃水浴反应至完全。将体系减压蒸干，硅胶柱层析纯化，减压蒸干溶剂，得到紫红色固体粉末。将纯化后的产物溶于乙酸乙酯中，0 oC下添加m-CPBA，室温下反应至完全，过滤、浓缩滤液并硅胶柱层析纯化，旋蒸除去溶剂后得到目标分子探针。
本发明的合成如下所示：
本发明提供了一种所述荧光探针的应用，可应用于Fe2+的检测。该探针的检测原理为：Fe2+可将探针中的N-氧化物还原，生成具有强荧光发射的荧光物质，可通过加入Fe2+前后的的荧光强度变化实现Fe2+的检测。检测机理如图所示：
本发明提供了一种所述荧光探针测定Fe2+方法。测定方法是：在室温条件下，所述荧光探针溶解于PBS缓冲溶液，乙腈、二氯甲烷或二甲基亚砜与PBS缓冲溶液按照一定比例配置的溶液中，将其浓度配置成10 μM-40 μM。将不同浓度的Fe2+水溶液加入到探针体系中，测定溶液的荧光强度，通过荧光强度与Fe2+浓度的线性关系是实现对Fe2+的定量检测。
上述检测方法，优选的，溶剂体系为PBS缓冲溶液。
上述检测方法，优选的，pH为7.4。
上述检测方法，优选的，荧光探针浓度为10 μM。
相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：
（1）本发明的荧光探针具有选择性好的优点，NaCl，KCl，MgCl2，CaCl2，MnCl2，ZnCl2，Pb(NO3)2，CuCl2，AgNO3和FeCl3等对Fe2+的检测均没有干扰。
（1）该探针具有较强的红光发射，能有效避免生物自发荧光的干扰，细胞膜渗透性好，细胞毒性小，能够用于Fe2+的生物成像，在生命科学领域具有较强的实际应用价值。
（2）本发明的荧光探针制备方法简单、成本低廉、无需复杂仪器，有利于规模化生产，使得其适合推广运用。
附图说明
【图1】本发明实施中荧光探针的荧光强度随Fe2+浓度变化的发射光谱图；
【图2】本发明实施中荧光探针对Fe2+的选择性图；
【图3】本发明实施中荧光探针在HepG2细胞内荧光共聚焦成像图。
具体实施方式
以下实施方式旨在进一步阐释说明本发明而不是对本发明的限定。
实施例1
化合物2的合成
称取化合物1（538.60 mg，2 mmol），2-甲基吡啶盐（470.12 mg, 2.4 mmol）溶于无水乙醇中，并加入1滴哌啶，40℃水浴反应至完全。将体系减压蒸干，硅胶柱层析纯化，减压蒸干溶剂，得到紫红色固体粉末770.36 mg，产率79.2 %。1H NMR (CDC13, 400 MHz) δ 1.97-1.99 (m, 4H), 2.76-2.79 (t, 2H, J=6.4 Hz), 2.88-2.90 (t, 2 H, J= 6.4 Hz),3.35-3.39 (m, 4H), 4.38 (s, 3H), 6.64(d, 1H, J=8.2 Hz), 6.85(d, 1H, J=8.2Hz), 6.98 (s, 1H), 7.29 (d, 1H, J=7.8 Hz), 7.66 (t, 1H, J=7.9 Hz), 7.83 (s,1H), 8.10 (t, 1H, J=8.1 Hz), 8.93 (d, 1H, J=8.2 Hz)。
目标分子探针的合成
将化合物2（486.35 mg，1 mmol）溶于10 mL乙酸乙酯中，然后在0 oC下添加m-CPBA（172.57 mg，1 mmol）,室温下反应至完全，过滤并浓缩滤液。硅胶柱层析纯化，减压蒸干溶剂，得到固体粉末681.17 mg，产率为67.8 %。1H NMR (CDC13, 400 MHz) δ 2.34-2.36 (m,4H), 2.76-2.78 (m, 4H), 3.32-3.35 (m, 4H), 4.39 (s, 3H), 6.64(d, 1H, J=8.2Hz), 6.85(d, 1H, J=8.2 Hz), 7.29 (d, 1H, J=7.8 Hz), 7.56 (s, 1H), 7.65 (t,1H, J=8.0 Hz), 7.81 (s, 1H) 8.11 (t, 1H, J=8.3 Hz), 8.91 (d, 1H, J=8.3 Hz)。HRMS-ESI (C23H23IN2O3) m/z: calc. for [M-I]+: 375.4398; found：375.3812。
实施例2
荧光探针母液的制备
将上述分离得到的纯度在99 %以上的产物，准确称量5.02 mg并小心转移于50 mL的容量瓶中，室温下加入CH3CN溶液并使之完全溶解，定容至刻度线，得浓度为1 mM的探针母液。在测试过程中，每次用微量进样器量取20 μL的上述溶液，将其溶于测试体系中，使得每次测试总体积为2 mL，此时荧光探针的浓度为10 μM。
实施例3
Fe2+母液的制备
Fe2+用PBS缓冲溶液配制成5 mL不同的浓度梯度（0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.5 mM、1mM、1.5 mM、2.0 mM、3.0 mM）的母液。其余测试需要使用的金属离子则分别用PBS缓冲溶液配制成浓度为3 mM的母液。
实施例4
荧光探针荧光强度与Fe2+浓度的关系
量取4.900 mL PBS缓冲溶液，将50 μL浓度为1 mM的探针母液溶解其中，再移取50 μL不同浓度的Fe2+母液中，使得最终整个检测体系探针的浓度为10 μM，而Fe2+的浓度则分别为1 μM、2 μM、3 μM、5 μM、10 μM、15 μM、20 μM、30 μM。室温孵育20 min后，分别在10 mm的比色皿中测试不同体系的荧光光谱（附图1）。结果表明，随着Fe2+浓度逐渐增加，体系在597nm处的荧光发射强度逐渐增强。
实施例5
荧光探针对Fe2+检测的选择性
将浓度为1 mM探针母液50 μL溶解于4.900 mL PBS缓冲溶液，再移取50 μL浓度为3 mM的NaCl，KCl，MgCl2，CaCl2，MnCl2，ZnCl2，Pb(NO3)2，CuCl2，AgNO3和FeCl3母液分别加入体系中，室温孵育20 min，分别测定其荧光光谱，记录597 nm的荧光强度值，结果如附图2所示。结果表明只有加入Fe2+时，荧光探针的荧光明显加强，而加入其它测试金属离子时，均没有或只有微弱的荧光变化。表明该荧光探针具有良好的选择性。
实施例6
荧光探针对细胞中Fe2+的响应
在HepG2培养基中加入10 μM的荧光探针溶液，置于 37 oC，5 %的CO2下在培养箱中孵育30分钟后，用0.1 M的PBS 缓冲液（10 mM，pH=7.4）洗涤三次，除去未进入细胞的探针分子，然后更换培养基，再由FeCl2缓冲溶液（50 μM）培养30分钟，用0.1 M的PBS 缓冲液（10mM，pH=7.4）洗涤三次，置于荧光显微镜下观察其荧光变化，结果如附图3所示。实验表明进入细胞体内的探针分子和Fe2+反应，发出强烈的红色荧光，因此该荧光探针对细胞中的Fe2+有良好的成像作用，可用于检测生物体内的Fe2+。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明范围的限制，本领域的相关技术人员能从发明公开的内容不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。