一种基于硅矿化微囊固定化多酶生产肌醇的方法
阅读说明：本技术 一种基于硅矿化微囊固定化多酶生产肌醇的方法 (Method for producing inositol based on silicon mineralized microcapsule immobilized multienzyme ) 是由 游淳 韩平平 于 2019-10-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于硅矿化微囊固定化多酶生产肌醇的方法,包括：硅矿化微囊固定化多酶以及制备得到的固定化多酶用于肌醇的生产。本发明提出的固定化多酶制备肌醇的方法过程简便,条件温和,其优点在于：微囊的空心内核不仅能够包埋大量的酶分子,而且能够赋予包埋至其中的酶分子良好的物理化学微环境,增强酶分子的稳定性；微囊的囊壁具有半渗透性,能够实现底物/产物的传递交换,有利于酶促反应的进行。特别地,固定化多酶制备肌醇,能够实现酶的回收利用。相比于纯酶的催化转化,固定化多酶的多次循环使用,大大降低多次肌醇制备所需投入的酶用量,降低生产成本。(The invention discloses a method for producing inositol based on silicon mineralized microcapsule immobilized multienzyme, which comprises the following steps: the silicon mineralized microcapsule immobilized multienzyme and the prepared immobilized multienzyme are used for producing inositol. The method for preparing inositol by immobilized multienzyme provided by the invention has the advantages of simple process, mild conditions and the following advantages: the hollow core of the microcapsule can embed a large number of enzyme molecules, can endow the embedded enzyme molecules with good physical and chemical microenvironments, and enhances the stability of the enzyme molecules; the microcapsule wall is semi-permeable, and can realize substrate/product transfer exchange, which is favorable for enzymatic reaction. In particular, the immobilized multienzyme is used for preparing inositol, and the recycling of the enzyme can be realized. Compared with the catalytic conversion of pure enzyme, the immobilized multi-enzyme can be recycled for multiple times, so that the enzyme dosage required by multiple inositol preparation is greatly reduced, and the production cost is reduced.)
技术领域
本发明涉及肌醇的生产领域，具体涉及一种基于硅矿化微囊固定化多酶生产肌醇的方法。
背景技术
肌醇，又名环己六醇，是水溶性维生素B族中的一种。肌醇是人、动物及微生物生长的必需物质，广泛应用于医药、食品、饲料等行业。目前肌醇的全球需求量大概在每年10,000吨左右，而中国国内，甚至全世界的产量都远远不能满足需求。专利CN106148425A针对肌醇制备提供了一种酶催化转化的方法，通过体外多酶催化淀粉及淀粉衍生物生产肌醇。该方法原料转化率高，肌醇产率高，步骤简捷，对环境影响小，可实现肌醇的规模化生产。但该方法中多个酶分子需要经过繁琐的提取和纯化才能得到，代价昂贵；而且这些水溶性酶分子在催化结束后较难回收，造成浪费。而将酶固定化，利用固定化的酶进行催化反应，具有许多优点：产物的分离提取得到简化，提高产品质量；酶的稳定性得到提高，可长期使用和连续反应，实现酶的回收好多次重复利用，大大降低生产成本。
近年来，微囊作为一类新型的空心材料受到了越来越多的关注，并广泛应用于催化、传感及药物释放等领域。特别地，由于微囊具有类似于细胞的结构，其被广泛用于固定化酶领域。酶分子可以包埋到微囊的空心内核，半渗透的囊壁可实现底物/产物的交换传递。通过调控囊壁的组成及结构，可为酶分子提供适宜的微环境，提高酶的稳定性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于硅矿化微囊固定化多酶生产肌醇的方法，该方法采用硅矿化微囊作为固定化酶载体，将肌醇酶法催化转化的多酶进行固定化，获得固定化多酶，并利用该固定化多酶催化生产肌醇，可以实现酶的回收再利用。固定化多酶多次循环使用，大大降低肌醇制备所需投入的酶用量，降低生产成本。
具体而言，本发明提供了一种基于硅矿化微囊固定化多酶生产肌醇的方法，其是由硅矿化微囊固定化多酶而成。
本发明采用硅矿化微囊将肌醇制备所涉及的四种主要酶分子：葡聚糖磷酸化酶(aGP)，葡萄糖磷酸变位酶(PGM)，肌醇-3-磷酸合成酶(IPS)和肌醇单磷酸酶(IMP)进行共固定化。微囊的空心内核能够赋予包埋至其中的酶分子良好的物理化学微环境，增强酶分子的稳定性；微囊的囊壁具有半渗透性，能够实现底物/产物的传递交换，有利于酶促反应的进行。
所述的硅矿化微囊固定化多酶可以采用包括如下步骤的方法制备而成：
(1)将生产肌醇制备所涉及的四种主要酶分子：葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶进行预先混合，将上述酶溶液加入至氯化钙溶液中，然后将等摩尔浓度等体积的碳酸钠溶液倒入上述溶液中进行搅拌，固液分离后，收集固体产物，即包含多酶的碳酸钙微球。
(2)将所述包含多酶的碳酸钙微球与聚乙烯亚胺溶液混合，固液分离后，收集固体产物，即聚乙烯亚胺-碳酸钙微球。
(3)将所述聚乙烯亚胺-碳酸钙微球与硅酸盐溶液混合，固液分离后，收集固体产物，即硅矿化-碳酸钙微球。
(4)将所述硅矿化-碳酸钙微球与乙二胺四乙酸混合反应去除碳酸钙，固液分离后，收集固体产物，即硅矿化微囊固定化多酶。
本发明对制备硅矿化微囊固定化多酶的方法进行优化，从而改进硅矿化微囊的结构，进而提高固定化多酶的催化和回用性能。
制备硅矿化微囊固定化多酶的步骤(2)中，聚乙烯亚胺的分子量以及浓度决定了硅矿化微囊的囊壁厚度。本发明优选所述聚乙烯亚胺的分子量为600-70000Da，浓度为0.1-1.0g/L。
制备硅矿化微囊固定化多酶的步骤(3)中引入硅酸盐，能够为矿化的进行提供无机矿物质，促进硅矿化的完全进行。本发明通过实践发现，当硅酸盐的浓度为2-10g/L，硅酸盐优选为硅酸钠时，制备得到的硅矿化微囊有良好的催化活性，尤其可以提高固定化多酶体系的催化效果。
作为本发明的一种优选方案，所述硅矿化微囊固定化多酶采用包括如下步骤的方法制备而成：
(1)将肌醇制备所涉及的四种主要酶分子：葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶按照特定的酶用量进行预先混合，其中葡聚糖磷酸化酶的用量为0.1-1mg/ml，葡萄糖磷酸变位酶的用量为0.1-1
mg/ml，肌醇-3-磷酸合成酶的用量为0.1-5mg/ml，肌醇单磷酸酶的用量为0.1-1mg/ml。将上述酶溶液加入至浓度为0.2-0.4M的氯化钙溶液中，在600-1500r/min转速下，将等摩尔浓度等体积的碳酸钠溶液倒入氯化钙溶液中，反应20-30s，在3000r/min转速下离心分离，去除上清液后用去离子水洗涤至上清液不含钠离子和氯离子，得到包含酶的碳酸钙微球。
(2)配制浓度为2-10g/L的硅酸盐溶液，配制分子量为600-70000的聚乙烯亚胺溶液，其浓度为0.1-1.0g/L。按照质量比为20～50：1，将聚乙烯亚胺溶液与包含酶的碳酸钙微球均匀混合10-20min；在3000r/min的转速下离心分离，去除上清液后用去离子水洗涤至清液中不含聚乙烯亚胺；按照质量比为20～50:1，将硅酸盐溶液加入至上述微球中均匀混合10-20min；在3000r/min的转速下离心分离，去除上清液后用去离子水洗涤至清液中不含硅酸跟离子。
(3)配制浓度为0.03-0.05M乙二胺四乙酸溶液，调节其pH为5.0-6.0；按照质量比为20～50：1将乙二胺四乙酸溶液与上述得到微球均匀混合，摇晃10-20min，在3000r/min转速下离心分离，去除上清液；重复用乙二胺四乙酸清洗3-4次；用去离子水洗涤至上清液中不含乙二胺四乙酸，得到硅矿化微囊固定化多酶。
本发明涉及的用于肌醇生产的多酶包括葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶。当将上述四种酶共同固定化于所述的硅矿化微囊中，可以在确保酶本身催化效率的基础上，实现酶的反复利用，从而显著降低生产成本。本发明优选酶比例为葡聚糖磷酸化酶的用量为0.1-1mg/ml，葡萄糖磷酸变位酶的用量为0.1-1mg/ml，肌醇-3-磷酸合成酶的用量为0.1-5mg/ml，肌醇单磷酸酶的用量为0.1-1mg/ml，从而确保在实际生产肌醇时，固定化多酶在投料量合理的情况下可以实现良好的催化效率以及多次回收使用。
本发明进一步保护利用所述固定化多酶生产肌醇的方法，该方法是以淀粉或其衍生物为原料，利用所述固定化多酶，通过酶催化转化法制备肌醇。
作为本发明的一种优选方案，所述方法具体为：取淀粉或淀粉衍生物10-100g/L，pH值为7-7.5的HEPES缓冲液80-120mM，无机磷酸根10-50mM，二价镁离子3-7mM，锌离子或锰离子0.3-0.7mM，异淀粉酶0.8-1.2U/ml，固定化多酶1-10mg/ml反应液，在65-75℃进行酶催化转化反应。
上述反应结束后，进行固液分离，收集所述固定化多酶，可以循环利用于制备肌醇。所述固定化多酶循环利用1-6次，优选循环利用1-4次时能够保持较高的催化活性。
与现有技术相比，本发明提出的一种硅矿化微囊固定化多酶生产肌醇的方法，过程简便，条件温和。特别地，通过固定化多酶制备肌醇，能够实现酶的回收利用。酶的多次循环使用，大大降低多次肌醇制备所需投入的酶用量，降低生产成本。
附图说明
图1所示为实施例1提供的硅矿化层数为1层的固定化多酶制备肌醇的转化曲线及透射电镜图片。
图2所示为实施例2提供的硅矿化层数为2层的固定化多酶制备肌醇的转化曲线及透射电镜图片。
图3所示为实施例3提供的硅矿化层数为2层的固定化多酶制备肌醇的转化曲线及透射电镜图片。
图4所示为实施例6提供的硅矿化层数为2层，聚乙烯亚胺分子量为600的固定化多酶制备肌醇的转化曲线。
图5所示为实施例7提供的硅矿化层数为2层，聚乙烯亚胺分子量为600的固定化多酶制备肌醇的循环使用柱状图。
具体实施方式
本发明公开了一种固定化多酶生产肌醇的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1
本实施例提供了一种硅矿化微囊固定化多酶，所述硅矿化微囊固定化多酶采用如下方法制备而成：
(1)将专利CN106148425A中肌醇制备所涉及的四种主要酶分子：葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶按照特定的酶用量进行预先混合，其中葡聚糖磷酸化酶的用量为0.5mg/ml，葡萄糖磷酸变位酶的用量为0.5mg/ml，肌醇-3-磷酸合成酶的用量为3.0mg/ml，肌醇单磷酸酶的用量为0.4mg/ml。将上述酶溶液加入至浓度为0.33M的氯化钙溶液中，在700r/min转速下，将等摩尔浓度等体积的碳酸钠溶液倒入氯化钙溶液中，反应20-30s，在3000r/min转速下离心分离，去除上清液后用去离子水洗涤至上清液不含钠离子和氯离子，得到包含酶的碳酸钙微球。
(2)配制浓度为8.5g/L的硅酸钠溶液，配制分子量为1800的聚乙烯亚胺溶液，其浓度为0.5g/L。按照质量比为30：1，将聚乙烯亚胺溶液与包含酶的碳酸钙微球均匀混合10-20min；在3000r/min的转速下离心分离，去除上清液后用去离子水洗涤至清液中不含聚乙烯亚胺；按照质量比为30:1，将硅酸钠溶液加入至上述微球中均匀混合10-20min；在3000r/min的转速下离心分离，去除上清液后用去离子水洗涤至清液中不含硅酸跟离子。
(3)配制浓度为0.05M乙二胺四乙酸溶液，调节其pH为5.8；按照质量比为30：1将乙二胺四乙酸溶液与上述得到微球均匀混合，摇晃10-20min，在3000r/min转速下离心分离，去除上清液；重复用乙二胺四乙酸清洗3-4次；用去离子水洗涤至上清液中不含乙二胺四乙酸，得到硅矿化微囊固定化多酶。
实施例2
本实施例提供了一种硅矿化微囊固定化多酶，与实施例1相比，区别仅在于：硅矿化微囊的囊壁层数从1层变成2层。
实施例3
本实施例提供了一种硅矿化微囊固定化多酶，与实施例1相比，区别仅在于：硅矿化微囊的囊壁层数从1层变成3层。
实施例4
本实施例提供了一种硅矿化微囊固定化多酶，与实施例1相比，区别仅在于：聚乙烯亚胺的分子量由1800变为600。
实施例5
本实施例提供了一种硅矿化微囊固定化多酶，与实施例1相比，区别仅在于：聚乙烯亚胺的分子量由1800变为70000。
实施例6
本实施例提供了一种硅矿化微囊固定化多酶，与实施例1相比，区别仅在于：聚乙烯亚胺的分子量由1800变为600；硅矿化微囊的囊壁层数从1层变成2层。
对比例
本对比例提供了一种用于生产肌醇的未固定化多酶混合物，其与实施例1中的多酶混合物组成相同。
实施例7
分别采用实施例1-6提供的固定化多酶、或对比例提供的多酶混合物，通过如下方法制备肌醇：
取淀粉或淀粉衍生物50g/L，pH值为7.2的HEPES缓冲液100mM，无机磷酸根20mM，二价镁离子5mM，锌离子或锰离子0.5mM，异淀粉酶1U/ml，以上各实施例或对比例提供的固定化多酶(或多酶混合物)5mg/ml，在70℃进行酶催化转化反应，通过高效液相色谱对肌醇的浓度进行检测。
采用实施例1提供的固定化多酶进行制备，反应37小时接近反应平衡，肌醇产生浓度为18.5g/L，转化率为37％。
采用实施例2提供的固定化多酶进行制备，反应37小时接近反应平衡，肌醇产生浓度为28g/L，转化率为54％。
采用实施例3提供的固定化多酶进行制备，反应37小时后接近反应平衡，肌醇产生浓度为3g/L，转化率为6％。
采用实施例4提供的固定化多酶进行制备，反应21小时后接近反应平衡，肌醇产生浓度为35g/L，转化率为70％。
采用实施例5提供的固定化多酶进行制备，反应21小时后接近反应平衡，肌醇产生浓度为17.2g/L，转化率为34.4％。
采用实施例6提供的固定化多酶进行制备，反应20小时后接近反应平衡，肌醇产生浓度为37g/L，转化率为74％。
采用对比例提供的多酶混合物进行制备，反应10小时后接近反应平衡，肌醇产生浓度为38g/L，转化率为76％。
实施例8
通过实施例7提供的方法制备肌醇后，进行固液分离，收集固定化多酶，循环利用于制备肌醇。通过高效液相色谱对每次循环过程中产生的肌醇的浓度进行检测，结果以相对肌醇生产浓度表示，将第一次循环反应产生的肌醇浓度设定为100％。
采用实施例6提供的固定化多酶进行制备，经过4次循环使用后，固定化多酶维持了34％的相对肌醇生产浓度，结果如图5所示。
实施例9
通过对比例提供的方法制备肌醇后，进行超滤，回收多酶，循环利用于制备肌醇。经过2次循环后，超滤回收多酶维持了20％的相对肌醇生产浓度。
通过实施例8和实施例9的循环效果比较，发现固定化多酶制备肌醇，能够实现酶的重复回收利用。相比于纯酶的催化转化，固定化多酶的多次循环使用，大大降低多次肌醇制备所需投入的酶用量，降低生产成本。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。