具体实施方式

下面在具体实施例中，对本说明书提供的方案进行举例描述。

生长在特殊环境中的真菌往往具有特殊的生理和代谢特征，如内生真菌、海洋真菌和粪生真菌。一些报道表明，内生真菌能够生物合成重要的药用“植物化学物质”，并且从海洋真菌中也发现了许多新的具有生物活性的天然产物。如，来自内生真菌Taxomycesandreanae的紫杉醇和来自海洋真菌Beauveria felina的破坏素destruxin，它们在制药和农用化学品中发挥了重要作用。鉴于短命动物粪便中固有的微生物竞争，粪生真菌是丰富天然产物的来源。近年来，粪生真菌因广泛存在和研究方便而受到越来越多的关注。Amphichorda guana LC5815是寄生在蝙蝠粪便上的真菌，目前Amphichorda属仅有Amphichorda felina与Amphichorda guana两个物种，已有研究报道从Amphichordafelina中分离到了活性环缩肽免疫抑制剂环孢菌素，而我们首次研究了这个稀有真菌Amphichorda guana LC5815的化学成分，并从中挖掘到8个活性环缩肽化合物，包括一个新环缩肽和一个产量超过14％的具强杀虫活性的环缩肽iso-isariin B。因此这种活性环缩肽化合物高产菌株的发现，势必对农业及医药领域有着极其重要的作用。

本申请实施例提供了一种活性环缩肽高产菌株，其为蝙蝠粪便寄生真菌Amphichorda guana LC5815。该菌株分离自中国贵州绥阳，宽阔水国家自然保护区，无名洞穴。该菌株的营养菌丝透明，有隔，光滑，直径1.5-3.5μm，有时膨大至7.0μm。联丝体产生于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar(Medium)，PDA)平板上菌落中心，高度可达15mm，宽1-3mm，白色，圆柱形，被绒毛，顶端偶有分枝。分生孢子梗侧生于菌丝，直或略弯曲。产孢细胞多着生于分生孢子梗，偶尔轮生于菌丝，梭形或椭圆形，直或不规则弯曲，7-10x2-3μm。分生孢子外生芽殖型，单生或簇生，透明，光滑，宽椭球形到近球形，单细胞。

蝙蝠粪便寄生真菌Amphichorda guana LC5815已于2016年1月29日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC 3.17908。

在下文中，蝙蝠粪便寄生真菌Amphichorda guana LC5815可以简称为蝙蝠粪便寄生真菌A.guana，或，蝙蝠粪便寄生真菌，或，A.guana。

本申请实施例利用蝙蝠粪便寄生真菌Amphichorda guana LC5815进行发酵获得了结构式依次如式(1)-式(8)所示的8个环缩肽。

具体而言，式(1)所示的化合物称为isaridin H，式(2)所示的化合物称为desmethylisaridin E，式(3)所示的化合物称为isaridin E，式(4)所示的化合物称为isariin A，式(5)所示的化合物称为iso-isariin B，式(6)所示的化合物称为iso-isariinD，式(7)所示的化合物称为isariin E，式(8)所示的化合物称为nodupetide。

接下来，对环缩肽的生产过程以及特性进行介绍。

实施例1，液相色谱质谱联用(LC-MS)初步分析蝙蝠粪便寄生真菌Amphichordaguana LC5815固体发酵物

将蝙蝠粪便寄生真菌A.guana接种到葡萄糖琼脂培养基(PDA)上进行菌种活化，培养条件是28℃,5至7天。用0.1％(w/v)Tween-80收取所述活化菌株的孢子，接种适量种子液进行固体发酵，所述固体发酵采用的培养基由20g大米和30mL水组成，所述固体发酵的培养条件为28℃，避光静置培养7天。为方便描述，可以将每20g大米混合30mL水组成的培养基称为大米培养基。以上实验3个重复。用乙酸乙酯萃取发酵物(具体而言，每1kg发酵培养基用7.5L乙酸乙酯分三次萃取。发酵培养结束后，直接加入乙酸乙酯。在实验中采用250mL的三角瓶，每瓶20g大米，用50mL乙酸乙酯萃取，重复3次，共需150mL乙酸乙酯)，超声处理1个小时后，用玻璃漏斗过滤，收集滤液，用旋转真空浓缩仪进行干燥，用1.5mL甲醇溶解干燥物，取1mL于HPLC液相分析瓶，进行LC-MS液质分析。以乙腈和水的混合液为流动相，进行洗脱，具体分析方法如表1所示。其中，表1所示的为乙腈和水的体积比。

表1

LC-MS分析结果图如图1所示。结果表明本申请实施例所用菌株Amphichordaguana LC5815可以产生丰富的大分子量次级代谢产物。采用高效液相色谱-串联质谱联用仪(high performance liquid chromatography-electrospray tandem massspectrometry，LC-MS-MS)对发酵培养产物分析，进一步证实了m/z 637.4[M+H]⁺和m/z596.4[M+H]⁺处有氨基酸的连续裂解。其中，通过氨基酸离子碎片指认，m/z 637.4[M+H]⁺为环缩肽isariin A的离子峰(图3所示)，m/z 596.4[M+H]⁺为环缩肽iso-isariinB的离子峰(图4所示)。

本申请的发明人进行了以PDA培养基为发酵培养基，使用Amphichorda guanaLC5815进行发酵，以及马铃薯葡萄糖肉汤(Potato Dextrose Broth，PDB)培养基为发酵培养基，使用Amphichorda guana LC5815进行发酵。发酵条件如上所述。

发酵结束后，进行高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析以PDA培养基、PDB培养基、大米培养基为发酵培养基的发酵产物，结果如图5所示。其中，LC5815-PDB-7d表示以PDB培养基为发酵培养基的发酵产物的分析结果，LC5815-PDB-7d表示以PDA培养基为发酵培养基的发酵产物的分析结果，LC5815-Rice-7d表示以大米培养基为发酵培养基的发酵产物的分析结果。如图5所示，以PDA培养基、PDB培养基为发酵培养基的发酵产物中没有检测到图1所示的大分子次级代谢产物。由此，证实了大米培养基是产生图1所示的大分子次级代谢产物的适用培养基。

实施例2，活性环缩肽成分分离和纯化

经实施例1的LC-MS初步分析A.guana LC5815的大米发酵产物，已表明其可产生丰富的大分子量化合物。将该菌培养在20kg大米培养基(20kg大米和30L水混合得到)中进行大规模发酵，28℃避光静置培养30天，得到大米发酵培养物。向所述大米发酵培养物中加入乙酸乙酯提取3次，每次浸泡过夜，得到浸提液。具体而言，按照每1kg大米用7.5L乙酸乙酯的比例，进行萃取，培养结束后，直接加入乙酸乙酯。在具体实验时，因为用的250mL的三角瓶，每瓶20g大米，每瓶用50mL乙酸乙酯萃取，重复3次，共需150mL乙酸乙酯。

将得到的浸提液在真空下蒸发干燥，得到约60g粗提物。

将得到的粗提物用200-300目硅胶柱进行层析分离，用二氯甲烷，乙酸乙酯，丙酮，甲醇4种不同极性的洗脱剂分别进行洗脱，得到4种流分。将得到的4种流分在真空下蒸发干燥，分别得到8g干物质A，21g干物质B，15g干物质C，10.2g干物质D。将丙酮流分中得到的干物质C经小孔树脂(MCI)进一步纯化,以甲醇和水混合液为洗脱剂，按照溶剂中甲醇和水的体积比依次是5：5、7：3、9：1、10：0的洗脱梯度进行洗脱，收集4个洗脱梯度的洗脱产物。

将上述70％甲醇及90％甲醇洗脱产物经制备HPLC柱分离纯化，以乙腈-水(体积比为85：15)为洗脱液，流速2mL/min,进行梯度洗脱。经85％乙腈进一步分离，从上述70％甲醇的洗脱产物中分离到5个环缩肽化合物。收集保留时间为11.9min的色谱峰，旋转蒸发后得到25mg环缩肽iso-isariin D；收集保留时间为13.1min的色谱峰，旋转蒸发后得到10mg环缩肽desmethylisaridin E；收集保留时间为17.5min的色谱峰，旋转蒸发后得到30mg环缩肽isariin E；收集保留时间为20.1min的色谱峰，，旋转蒸发后得到35mg环缩肽nodupetide；收集保留时间为26.7min的色谱峰，经甲醇中结晶得到8.5g环缩肽iso-isariin B。从上述90％甲醇的洗脱产物中分离到3个环缩肽化合物，其中包括一个出峰时间为17.5min的新环缩肽isaridin H 25mg；一个出峰时间为19.2min的环缩肽isaridin E10mg；一个出峰时间为25.6min的环缩肽isariin A。

特别是，从60g的粗提物中，可分离得到8.5g环缩肽iso-isariin B。也就是说，采用本申请实施例提供的方案，环缩肽iso-isariin B的产率超过14％，实现了环缩肽iso-isariin B的高效制备。

实施例3，验证实施例2制备的环缩肽的生物活性

3.1，验证抗植物病原真菌活性

用含10mL PDA培养基的90mm培养皿测定其抗真菌活性，以如下3种植物病原真菌Alternaria solani,Botrytis cinerea，Fusarium oxysporum为指示菌，用PDA培养基培养植物病原真菌，当其直径生长约2cm后，将相同大小(直径0.625cm)的无菌空白滤纸片放置在距离菌丝菌落边缘1cm处。分布用二甲基亚砜(DMSO)溶解实施例2制备的isaridin H、desmethylisaridin E、isaridin E，各自得到终浓度为1mg/mL的样品，分别取10uL加至滤纸片上。其中，图6中纸片1加isaridin H，纸片2加desmethylisaridin E，纸片3加isaridinE。将培养皿放置于28℃，避光培养，3天后测量菌丝直径，按下述计算公式计算菌丝抑制率。计算结果如表2所示。

表2.Isaridin H(1)的抗真菌活性

表2和图6展示的结果表明，实施例2制备的新环缩肽化合物isaridin H(1)对Alternaria solani和Botrytis cinerea有明显抑制能力。

3.2，采用滤纸片扩散法验证抗细菌活性

3.2.1，采用滤纸片

用直径90mm含溶菌肉汤Luria-Bertani(LB)固体培养基的平板活化测试细菌(枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)，37℃过夜培养，取活化好的测试细菌单菌落接种于含5mL LB液体培养基的试管中，37℃，200rpm，摇床过夜培养。分别往20mL温度为55℃的LB培养基中加入10μL测试细菌悬浮液(10¹⁰cfu mL^-1),混合均匀后，将含有细菌的培养基倒入直径90mm的培养皿中。4个无菌滤纸片(直径0.625cm)放在含上述混合物的培养皿上，用移液枪分别向滤纸片添加10μL浓度为1mg mL^-1的从该菌中分离到的isaridins环缩肽(isaridin H(图7中纸片1),desmethylisaridin E(图7中纸片2),isaridin E(图7中纸片3))，以10uL二甲基亚砜作为阴性对照(图7中“-”指示的纸片)，10uL浓度为1mg mL^-1的氨苄霉素作为阳性对照(图7中“+”指示的纸片)，37℃过夜培养，记录抑菌圈大小。每个实验3个重复，结果表明，新环缩肽化合物isaridin H对枯草芽孢杆菌有抗细菌活性(图7)。

3.2.2，MIC值测定——倍比稀释法

用96孔板进行最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)测试，采用倍比稀释法，以枯草芽孢杆菌为指示菌株，以氨苄霉素为阳性对照,二甲基亚砜作为阴性对照。将用于测试的环缩肽化合物isaridn H配成下列浓度的母液10.24mg mL^-1，5.12mgmL^-1，2.56mg mL^-1，1.28mg mL^-1，0.64mg mL^-1，0.32mg mL^-1，0.16mg mL^-1，0.08mg mL^-1，各取5uL于含95uL LB液体培养基的96孔板中。于37℃培养，分别在培养12h和24h时用酶标仪检测吸光值。每个实验3个重复，数据如表3所示。

表3.环缩肽isaridin H的抗细菌作用

结果表明，当isaridin H的浓度≥8μg/mL时，对枯草芽孢杆菌有抑菌作用。

本申请实施例采用蝙蝠粪便寄生真菌Amphichorda guana LC5815为发酵菌株，大米培养基为发酵培养基，进行发酵，可以生产多种环缩肽，特别是环缩肽iso-isariin B的产率超过14％；并且可以生产具有真菌和细菌抑制能力的新的环缩肽isaridin H。

以上所述的具体实施方式，对本申请的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本申请的具体实施方式而已，并不用于限定本申请的保护范围，凡在本申请的技术方案的基础之上，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本申请的保护范围之内。