一株海洋假单胞菌产出高含量环二肽类化合物方法
阅读说明：本技术 一株海洋假单胞菌产出高含量环二肽类化合物方法 (Method for producing high-content cyclic dipeptide compound by using marine pseudomonas ) 是由 杜风强 邵海峰 于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：一株海洋假单胞菌产出高含量环二肽类化合物方法,其包括如下步骤,1)将一株海洋假单胞菌即F-Q127菌种从固体斜面培养基中取适量接种到内装100mL液体培养基的三角瓶中,在28℃、180r·min－1的条件下摇床培养48h,作为种子培养液；2)将该种子培养液按体积分数7%的接种量接种于含150mL液体培养基的三角瓶中,共接种15L,在28℃180r·min－1的条件下摇床培养5d,再对培养液进行萃取,得到菌种发酵液的氯仿萃取物和菌丝体的氯仿萃取物；经薄层检查,菌种发酵液的氯仿萃取物和菌丝体的氯仿萃取物主要斑点相似,将两部分的氯仿萃取物合并得氯仿萃取物；3)对氯仿萃取物采用流式细胞术测定化合物的细胞周期抑制活性,得到环二肽类化合物。(A method for producing high-content cyclic dipeptide compounds by using marine pseudomonas comprises the following steps of 1) taking a proper amount of marine pseudomonas, namely F-Q127 strain from a solid slant culture medium, inoculating the strain into a triangular flask filled with 100mL of liquid culture medium, and performing shake cultivation for 48 hours at 28 ℃ and 180 r.min < -1 > to obtain a seed culture solution; 2) inoculating the seed culture solution into a triangular flask containing 150mL of liquid culture medium according to the inoculation amount of 7% of volume fraction, inoculating 15L of the seed culture solution, performing shake culture at 28 ℃ for 5d under the condition of 180 r.min < -1 >, and extracting the culture solution to obtain a chloroform extract of strain fermentation liquor and a chloroform extract of mycelia; performing thin layer inspection to obtain chloroform extract of strain fermentation liquid and main spot of chloroform extract of mycelium similar, and mixing the two chloroform extracts to obtain chloroform extract; 3) and measuring the cell cycle inhibitory activity of the compound by adopting flow cytometry on the chloroform extract to obtain the cyclic dipeptide compound.)
技术领域
本发明涉及环二肽类化合物制备，具体为一株海洋假单胞菌产出高含量环二肽类化合物方法。
背景技术
蛋白质可由酸、碱或酶水解，在水解过程中蛋白质逐步降解成为蛋白胨、多肽、三肽和二肽等越来越小的蛋白质碎片，直到最后成为氨基酸混合物。
在体内二肽通常能被二肽酶所水解而成为两个游离氨基酸。在体内肠黏膜细胞上也存在着吸收二肽或三肽的耗能主动运转体系，故有二肽吸收入细胞先于游离氨基酸之说。
二肽是一种化合物，是天然氨基酸即阿尔法氨基酸(氨基连在连有羧基的碳上)中的氨基于羧基脱水缩合而成的。其中只含一个肽键即-CO-NH-。可水解。
环二肽本质---氨基酸肽键形成的化合物活性肽，与动物营养、荷尔蒙、酵素抑制、调节免疫、抗菌、抗病毒、抗氧化作用直接。
现在环二肽类化合物类化合物制备不便，产量难以提升，同时制备方法繁琐。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一株海洋假单胞菌产出高含量环二肽类化合物方法，有效的解决了现在环二肽类化合物类化合物制备不便，产量难以提升，同时制备方法繁琐的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明包括如下步骤，1）将一株海洋假单胞菌即F-Q127菌种从固体斜面培养基中取适量接种到内装100mL液体培养基的三角瓶中，在28℃、180r·min－1的条件下摇床培养48h，作为种子培养液；
2）将该种子培养液按体积分数7%的接种量接种于含150mL液体培养基的三角瓶中，共接种15L，在28℃180r·min－1的条件下摇床培养5d，再对培养液进行萃取，得到菌种发酵液的氯仿萃取物和菌丝体的氯仿萃取物；经薄层检查，菌种发酵液的氯仿萃取物和菌丝体的氯仿萃取物主要斑点相似，将两部分的氯仿萃取物合并得氯仿萃取物；
3）对氯仿萃取物采用流式细胞术测定化合物的细胞周期抑制活性，得到环二肽类化合物。
有益效果：通过本发明的制备方法，由一株海洋假单胞菌可产出高含量的环二肽类化合物，分别鉴定为环(丙-亮)［cyclo(Ala-Leu)，1］、环(丙-异亮)［cyclo(Ala-Ile)，2］、环(丙-缬)［cyclo(Ala-Val)，3］、环(苯丙-亮)［cyclo(Phe-Leu)，4］、环(丙-脯)［cyclo(Ala-Pro)，5］和环(苯丙-缬)［cyclo(Phe-Val)，通过不同诱导时机目的蛋白的表达实验方法得到：海洋假单胞菌F-Q127生长5h时加入终浓度0.3mmol/L的诱导剂IPTG诱导4h,为目的蛋白表达的最优条件。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式做进一步详细说明。
实施例，本发明提供一株海洋假单胞菌产出高含量环二肽类化合物方法，包括如下步骤，1）将一株海洋假单胞菌即F-Q127菌种从固体斜面培养基中取适量接种到内装100mL液体培养基的三角瓶中，在28℃、180r·min－1的条件下摇床培养48h，作为种子培养液；
2）将该种子培养液按体积分数7%的接种量接种于含150mL液体培养基的三角瓶中，共接种15L，在28℃180r·min－1的条件下摇床培养5d，再对培养液进行萃取，得到菌种发酵液的氯仿萃取物和菌丝体的氯仿萃取物；经薄层检查，菌种发酵液的氯仿萃取物和菌丝体的氯仿萃取物主要斑点相似，将两部分的氯仿萃取物合并得氯仿萃取物。
3）对氯仿萃取物采用流式细胞术测定化合物的细胞周期抑制活性，得到环二肽类化合物，即从氯仿提取物中分离得到6个环二肽类化合物，分别鉴定为环(丙-亮)［cyclo(Ala-Leu)，1］、环(丙-异亮)［cyclo(Ala-Ile)，2］、环(丙-缬)［cyclo(Ala-Val)，3］、环(苯丙-亮)［cyclo(Phe-Leu)，4］、环(丙-脯)［cyclo(Ala-Pro)，5］和环(苯丙-缬)［cyclo(Phe-Val)。
对一株海洋假单胞菌培养的代谢物进行鉴定：得到化合物1：白色无定型粉末，正离子TOF-MS在m/z185处给出伪分子离子峰［M+H］+峰，与分子式C9H16O2N2相符，红外光谱在3193cm－1(m)和1689cm－1(s)处有吸收峰，示有酰亚胺基团，1H-NMＲ(600MHz，CD3OD)谱给出δ:3.99(1H，qd，J=6.2、0.8Hz，H-6)、3.93(1H，ddd，J=8.5、4.8、0.8Hz，H-3)、1.84(1H，m，H-8)、1.72(1H，m，H-7)、1.63(1H，m，H-7)、1.44(3H，d，J=7.0Hz，H-11)、0.97(3H，d，J=6.6Hz，H-9)和0.95(3H，d，J=6.6Hz，H-10)质子信号，鉴定为环(丙-亮)化合物；
还可采用如下方法制备：取活化的种子菌,以1:100的接种量分别接种于10只5ml含氨苄青霉素LB液体培养基的试管中,37℃、200r/min摇床培养,每隔1h取出一只试管,紫外分光光度计测定OD590值，同时以同样的方法培养E.coliTB1和pMAL-c2X-TB1菌株做对照，即可得到环二肽类化合物。
实验例
海洋假单胞菌F-Q127目的蛋白表达条件的优化生长的实验方法，海洋假单胞菌F-Q127在不同的培养基中生长速率不同,将鉴定正确的转化菌分别接种于TB、GS选择培养基中(均含有100ug/ml氨苄青霉素,0.2%(w/v)葡萄糖),通过紫外分光光度计测定该菌在相同的时间内,在不同的培养基中的生长情况(以OD表示),绘制生长曲线，不同诱导时机目的蛋白的表达，根据结果,分别取活化的种子菌以1:100的接种量接种于5只5ml含氨苄青霉素LB液体培养基的试管中,37℃、200r/min摇床培养,分别在工程菌延迟期(0.5h)、对数期(2h、3h、4h、5h)加入诱导剂IPTG(终浓度为0.3mmol/L),继续震荡4h,取1ml菌液,SDS-PAGE电泳；
结果显示：海洋假单胞菌F-Q127生长5h时加入终浓度0.3mmol/L的诱导剂IPTG诱导4h,为目的蛋白表达的最优条件。
有益效果：通过本发明的制备方法，由一株海洋假单胞菌可产出高含量的环二肽类化合物，分别鉴定为环(丙-亮)［cyclo(Ala-Leu)，1］、环(丙-异亮)［cyclo(Ala-Ile)，2］、环(丙-缬)［cyclo(Ala-Val)，3］、环(苯丙-亮)［cyclo(Phe-Leu)，4］、环(丙-脯)［cyclo(Ala-Pro)，5］和环(苯丙-缬)［cyclo(Phe-Val)，通过不同诱导时机目的蛋白的表达实验方法得到：海洋假单胞菌F-Q127生长5h时加入终浓度0.3mmol/L的诱导剂IPTG诱导4h,为目的蛋白表达的最优条件。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种鸡血白蛋白低聚肽及其制备方法和应用