一种Aureobasidin A的发酵制备方法及其培养基
阅读说明：本技术 一种Aureobasidin A的发酵制备方法及其培养基 (Fermentation preparation method and culture medium of Aureobasidin A ) 是由 朱进伟 彭湘屏 张敏 王雪峰 孙琼 石磊 汪超 陈世敏 高祥 于 2021-01-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及微生物制药技术领域,具体涉及一种Aureobasidin A的发酵制备方法及其培养基,特别是适用于Aureobasidin A高产菌株CGMCC NO.20887的发酵制备方法及其培养基。上述方法和培养基,通过对工艺路线、工艺条件、种子培养基、发酵培养基(尤其是添加碳源调节因子,例如异丙基氯化镁)等进行优化,可显著提高Aureobasidin A的合成效率,维持产率稳定,延长产物合成周期,使Aureobasidin A的产量显著提升,可达5.5g/L以上,有利于Aureobasidin A的工业化生产。(The invention relates to the technical field of microbial pharmacy, in particular to a fermentation preparation method of Aureobasidin A and a culture medium thereof, and particularly relates to a fermentation preparation method and a culture medium thereof suitable for Aureobasidin A high-yield strain CGMCC NO. 20887. According to the method and the culture medium, the process route, the process conditions, the seed culture medium, the fermentation culture medium (especially adding a carbon source regulating factor such as isopropyl magnesium chloride) and the like are optimized, so that the synthesis efficiency of Aureobasidin A can be obviously improved, the yield is stable, the product synthesis period is prolonged, the yield of Aureobasidin A is obviously improved and can reach more than 5.5g/L, and the method and the culture medium are favorable for industrial production of Aureobasidin A.)
技术领域
本发明涉及微生物制药技术领域，具体涉及一种Aureobasidin A的发酵制备方法及其培养基，特别是适用于Aureobasidin A高产菌株CGMCC NO.20887的发酵制备方法及其培养基。
背景技术
AureobasidinA是一种由9个氨基酸分子组成的环脂肽类抗生素，最早在1991年由日本Kazutoh Takesako团队从黑酵母Aureobasidiumpullulans的培养液中分离获得。后续研究证实AureobasidinA具有非常强的抗真菌能力，其在0.1～0.5μg/ml的低浓度下即可对酵母产生毒性。对其敏感的真菌种类包括：出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和黑曲霉(Aspergillus niger)。AureobasidinA的作用机制是抑制真菌生长所依赖的肌醇磷酰胺(inositol phosphorylceramide，IPC)合成酶的活性，干扰鞘脂合成，从而进一步杀死菌株。但是，AureobasidinA不会破坏DNA、RNA和蛋白质的合成。
目前，有关AureobasidinA生产技术的报道较少。1991年，KazutohTakesako团队最先从对马岛的叶子中分离到了Aureobasidiumpullulans菌种，经发酵培养后AureobasidinA的产量约为140μg/ml，通过培养基优化后(添加不同氨基酸)产量最高为312μg/ml(Kazutoh Takesako,Shigetoshi Mizutani,Hitoshi Sakakibara,et al.1996，Precursor Directed Biosynthesis ofAureobasidins)。2008年，Ahmed Abdel-Lateff等人从波塞多尼亚附近海域分离到一株海洋微生物Aureobasidium sp.，其发酵单位不超过300μg/ml。AureobasidinA因其较强的抗真菌活性，应用领域由潜在人用药逐步扩大到生物农药，因此，AureobasidinA高水平生产技术开发具有重要意义。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供一种Aureobasidin A的制备方法。
具体地，上述方法包括如下步骤：
(1)菌种活化；
(2)菌悬液制备；
(3)种子扩培；
(4)发酵。
具体地，上述步骤(1)包括：将Aureobasidin A生产菌株接种至固体培养基，培养，获得菌苔。
在本发明的一个实施例中，上述Aureobasidin A生产菌株为菌株CGMCCNO.20887。
具体地，上述固体培养基可以为任何适合真菌培养的培养基，例如，PDA培养基。
具体地，步骤(1)中的培养温度可以为20-30℃(例如21、22、23、24、25、26、27、28、29、30℃)，例如22-30℃，24-26℃，25℃。
具体地，步骤(1)中的培养湿度可以为40～70％相对湿度(例如40％、50％、60％、70％相对湿度)。
具体地，步骤(1)中的培养时间可以为1-10天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天)，例如3-6天，4天。
在本发明的一个实施例中，上述步骤(1)包括：取Aureobasidin A生产菌株的菌种甘油管，30℃水浴解冻，混匀后取菌悬液接种到PDA培养基平板，于22-30℃、40-70％相对湿度的培养箱内倒置培养3-6天，获得菌苔。
具体地，上述步骤(2)包括：将步骤(1)活化后所得菌种用溶剂稀释，分散，得到菌悬液。
具体地，上述溶剂可以为无菌生理盐水。
具体地，对于上述菌悬液的浓度，每板菌苔可以用10-20ml(例如10、12、14、16、18、20ml)溶剂稀释。
在本发明的一个实施例中，上述步骤(2)包括：取生长好且质量合格的平板菌苔(例如丰厚饱满的菌苔，呈奶油色或橄榄绿)，用无菌生理盐水洗下，转移至加有玻璃珠的三角瓶中，振荡，打散混匀后获得菌悬液。
具体地，上述步骤(3)包括：将步骤(2)所得菌悬液接种入一级种子培养基中，一级培养，然后取一级培养液接种入二级种子培养基中，二级培养。
具体地，上述一级培养中，接种量可以为0.05-1％(体积百分比，例如0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％)，例如0.1-1％，0.2-0.8％，0.4-0.6％，0.5％。
具体地，上述一级培养中，培养温度可以为20-30℃(例如21、22、23、24、25、26、27、28、29、30℃)，例如22-30℃，24-26℃，25℃。
具体地，上述一级培养中，培养时间可以为15-72h(例如16、18、20、22、24、26、28、30、32、36、42、48、54、60、66、72h)，例如15-30h。
具体地，上述一级培养中，培养pH可以为1.5-8.0(例如1.5、2、3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8)，特别是5.5-6.5。
具体地，上述一级培养可以在三角瓶中进行。
具体地，上述一级培养为振荡培养，振荡频率可以为100-300rpm(例如100、150、160、180、200、210、220、230、240、250、300rpm)，例如180-250rpm。
在本发明的一个实施例中，一级培养包括：将步骤(2)所得菌悬液接种入一级种子培养基中，摇瓶培养，接种量为0.1-1％，摇床转速为180-250rpm，种龄15-30h。
具体地，上述二级培养中，接种量可以为0.05-1％(体积百分比，例如0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％)，例如0.05-0.5％，0.06-0.4％，0.08-0.2％，0.1％。
具体地，上述二级培养中，培养温度可以为20-30℃(例如21、22、23、24、25、26、27、28、29、30℃)，例如22-30℃，24-26℃，25℃。
具体地，上述二级培养中，培养时间可以为8-60h(例如8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、36、42、48、54、60h)，例如15-30h。
具体地，上述二级培养中，培养pH可以为1.5-8.0(例如1.5、2、3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8)，特别是5.5-6.5。
具体地，上述二级培养可以在种子罐中进行。
具体地，上述二级培养为搅拌培养，搅拌速度可以为50-400rpm(例如50、100、150、200、250、300、350、400rpm)，例如150-300rpm。
具体地，上述二级培养中，溶氧值为5-60％(例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％)，特别是30-60％。
在本发明的一个实施例中，二级培养包括：将一级种子培养液接种入二级种子培养基中，在种子罐进行扩培，接种量为0.05-0.5％，搅拌转速为150-300rpm，溶氧值≥30％，种龄15-30h。
具体地，上述一级培养基与二级培养基可以相同或不同；在本发明的一个实施例中，上述一级培养基与二级培养基相同。
具体地，步骤(3)包括：将经过步骤(2)扩培的种子培养液，接种入发酵培养基，发酵培养。
具体地，上述发酵培养中，接种量可以为0.5-20％(体积百分比，例如0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％)，例如0.5-10％，0.5-5％，1％。
具体地，上述发酵培养中，培养温度可以为20-30℃(例如21、22、23、24、25、26、27、28、29、30℃)，例如22-30℃，24-26℃，25℃。
具体地，上述发酵培养中，培养时间可以为4天以上(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12天)，例如8-10天。
具体地，上述发酵培养中，培养pH可以为1.5-8.0(例如1.5、2、3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8)，特别是5.5-6.5；培养pH可通过氨水调节控制。
具体地，上述发酵培养中，溶氧值为5-50％(例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％)，例如10-40％，特别是10-15％。
具体地，上述发酵培养为搅拌培养，搅拌速度可以为100-500rpm(例如100、150、200、250、300、350、400、450、500rpm)，例如200-400rpm。
在本发明的一个实施例，上述发酵培养包括：将经过步骤(2)扩培的种子培养液，接种入发酵培养基，发酵培养4天以上，移种量为0.5-10％，搅拌转速200-400rpm、溶氧值10-40％。
在本发明的一个实施方式中，上述方法还包括步骤(5)：Aureobasidin A分离纯化。
具体地，上述步骤(5)包括：将步骤(4)的发酵液进行溶剂浸提。
具体地，上述步骤(5)中，提取溶剂可以为乙醇。
具体地，上述步骤(5)中，发酵液与溶剂的体积比可以为1:2-10(例如1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10)，例如1:4-8。
具体地，上述步骤(5)中，浸提时间可以为10-60min(例如10、20、30、40、50、60min)，例如20-40min。
本发明还提供一种种子培养基，其可用于Aureobasidin A生产菌株(例如菌株CGMCC NO.20887)的培养(例如上述一级培养和/或二级培养)。
具体地，上述种子培养基包含碳源和有机氮源。
具体地，上述种子培养基中，碳源的含量为1-10％(重量百分比，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％)，例如1-5％。
具体地，上述种子培养基中，碳源可以选自：葡萄糖、蔗糖、甘油、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、豆油中的一种或多种；更具体地，碳源可以包括葡萄糖，还包括选自：蔗糖、甘油、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、豆油中的一种或多种；在本发明的一个实施例中，碳源包含或由其组成：葡萄糖；在本发明的另一个实施例中，碳源包含或由其组成：葡萄糖和淀粉。
具体地，上述种子培养基中，有机氮源的含量为0.1-5％(重量百分比，例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％)，例如0.5-2％。
具体地，上述种子培养基中，有机氮源选自：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白、玉米浆、黄豆饼粉、玉米粉、玉米蛋白粉、棉籽饼粉、花生饼粉中的一种或多种；更具体地，有机氮源包括酵母提取物，还包括选自：蛋白胨、酪蛋白、玉米浆、黄豆饼粉、玉米粉、玉米蛋白粉、棉籽饼粉、花生饼粉中的一种或多种；在本发明的一个实施例中，有机氮源包含或由其组成：酵母提取物；在本发明另一个实施例中，有机氮源包含或由其组成：酵母提取物和玉米浆。
具体地，上述种子培养基还可以包含无机盐。
具体地，上述种子培养基中，无机盐的含量为0.01-1％(重量百分比，例如0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％)，例如0.05-0.5％。
具体地，上述种子培养基中，无机盐选自：镁盐、钾盐、钠盐、钙盐、铁盐、亚铁盐、锌盐、锰盐、铜盐、钴盐中的一种或多种；更具体地，无机盐包含或由其组成：镁盐、钾盐、钠盐；在本发明的一个实施例中，无机盐包含或由其组成：磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠。
在本发明的一个实施方式中，上述种子培养基包含或由其组成：葡萄糖1-10％(例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、6％、8％、10％)，酵母提取物0.1-5％(例如0.1％、0.2％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、1％、2％、3％、4％)。
在本发明的一个实施例中，上述种子培养基包含或由其组成：葡萄糖2％，酵母提取物0.67％。
在本发明另一实施方式中，上述种子培养基包含或由其组成：葡萄糖1-5％(例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％)，淀粉0.5-5％(例如0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.5％、2％、3％、4％、5％)，酵母提取物0.1-4％(例如0.1％、0.2％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1％、2％、3％、4％)，玉米浆0.1-1％(例如0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1％)，磷酸氢二钾0.05-0.5％(例如0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％)、硫酸镁0.01-0.1％(例如0.01％、0.02％、0.04％、0.05％、0.06％、0.08％、0.1％)、氯化钠0.05-0.5％(例如0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％)。
在本发明的一个实施例中，上述种子培养基包含或由其组成：葡萄糖2％，淀粉1％，酵母提取物0.5％，玉米浆0.2％，磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.1％。
本发明还提供一种发酵培养基，其可用于Aureobasidin A生产菌株(例如菌株CGMCC NO.20887)的发酵培养。
具体地，上述发酵培养基包含：碳源、有机氮源、无机氮源、无机盐。
具体地，上述发酵培养基中，碳源的含量为1-20％(重量百分比，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％)，例如5-15％。
具体地，上述发酵培养基中，碳源可以选自：葡萄糖、蔗糖、甘油、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、豆油中的一种或多种；更具体地，碳源可以包括葡萄糖，还包括选自：蔗糖、甘油、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、豆油中的一种或多种；在本发明的一个实施例中，碳源为葡萄糖；在本发明的另一个实施例中，碳源为葡萄糖、淀粉和糊精。
具体地，上述发酵培养基中，有机氮源的含量为1-20％(重量百分比，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％)，例如5-10％。
具体地，上述发酵培养基中，有机氮源选自：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白、玉米浆、黄豆饼粉、玉米粉、玉米蛋白粉、棉籽饼粉、花生饼粉中的一种或多种；在本发明的一个实施例中，有机氮源为蛋白胨；在本发明另一个实施例中，有机氮源为酵母提取物和黄豆饼粉。
具体地，上述发酵培养基中，无机氮源的含量为0.1-5％(重量百分比，例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％)，例如0.1-1％。
具体地，上述发酵培养基中，无机氮源选自：硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钠、尿素；更具体地，无机氮源包含或由其组成：硫酸铵、硝酸钠。
具体地，上述发酵培养基中，无机盐的含量为0.01-1％(重量百分比，例如0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％)，例如0.05-0.5％。
具体地，上述发酵培养基中，无机盐选自：镁盐、钾盐、钠盐、钙盐、铁盐、亚铁盐、锌盐、锰盐、铜盐、钴盐中的一种或多种；更具体地，无机盐包含或由其组成：钾盐、钠盐；在本发明的一个实施例中，无机盐包含或由其组成：磷酸氢二钾、硝酸钠。
在本发明的一个实施方式中，上述发酵培养基包含或由其组成：葡萄糖1-5％(例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、5％)，糊精1-10％(例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％)，淀粉1-5％(例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、5％)，酵母提取物1-5％(例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、5％)，黄豆饼粉1-10％(例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％)，硫酸铵0.1-1％(例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％)，磷酸氢二钾0.05-0.5％(例如0.05％、0.1％、0.15％、2％、3％、4％、5％)，硝酸钠0.05-0.5％(例如0.05％、0.1％、0.15％、2％、3％、4％、5％)。
在本发明的一个实施例中，上述发酵培养基包含或由其组成：葡萄糖3％，糊精5％，淀粉3％，酵母提取物3％，黄豆饼粉4％，硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.1％，硝酸钠0.1％。
在本发明的一个实施方式中，上述发酵培养基还包含碳源调节因子。
具体地，上述发酵培养基中，碳源调节因子的含量为0.01-1％(重量百分比，例如0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％)，例如0.05-0.5％。
具体地，上述碳源调节因子为含有异丙基基团的化合物，例如，异丙基氯化镁。
在本发明的一个实施例中，上述发酵培养基包含或由其组成：葡萄糖3％，糊精5％，淀粉3％，酵母提取物3％，黄豆饼粉4％，硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.1％，硝酸钠0.1％，异丙基氯化镁0.1％。
本发明还提供上述种子培养基在Aureobasidin A生产菌株(例如菌株CGMCCNO.20887)的培养(特别是种子培养)中的应用。
本发明还提供上述发酵培养基在Aureobasidin A生产菌株(例如菌株CGMCCNO.20887)的培养(特别是发酵培养)中的应用。
本发明还提供上述方法、种子培养基、发酵培养基在Aureobasidin A的制备中的应用。
本发明还提供Aureobasidin A的发酵制备所用材料的组合，其包含本发明上述种子培养基、发酵培养基。
具体地，上述组合还可以包括菌种活化培养基，其可以为任何适合真菌培养的培养基，例如，PDA培养基。
具体地，上述组合还可以包括菌悬液制备用溶剂，例如无菌生理盐水。
本发明中所涉及的Aureobasidin A生产菌株CGMCC NO.20887，其为发明人经过筛选、突变得到的Aureobasidin A生产菌株，其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)，并已于2020年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为：CGMCC NO.20887，在本文中有时简称为菌株CGMCC NO.20887。
本发明使用Aureobasidin A生产菌株(特别是菌株CGMCC NO.20887)作为生产菌种，通过对工艺路线、工艺条件、种子培养基、发酵培养基(尤其是添加碳源调节因子，例如异丙基氯化镁)等进行优化，可使Aureobasidin A的产量达到5.5g/L以上。其中，通过优化种子培养基，使其具备旺盛活力，迅速解除发酵营养的底物效应而加速产素启动；通过发酵配方优化，尤其是添加异丙基氯化镁可以有效调节该菌种的碳源代谢，从而显著提高Aureobasidin A的合成效率。此外，对Aureobasidin A发酵过程中溶氧这一关键工艺条件进行控制，可以维持产率稳定、延长产物合成周期。最终，使得Aureobasidin A的产量显著提升，有利于Aureobasidin A的工业化生产。
附图说明
图1所示为实施例1-6的发酵液中AureobasidinA的产量结果。
图2所示为种子活力对发酵菌种生长速率(a)、底物消耗速率(b)、AureobasidinA合成速率(c)的影响结果。
图3所示为实施例3、4、5中AureobasidinA合成曲线对比。
图4所示为发酵培养基中添加异丙基氯化镁对Aureobasidin A合成和碳源转化率的影响。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
“菌苔”是指在菌种在固体培养基上由母细胞繁殖长成的一片密集的、具有一定形态结构特征的菌落，一般为大批菌落聚集而成。
“接种量”是指加入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。
“发酵液”是指液体培养基接入微生物菌种，经过一段时间培养后所得混合物，其中包含微生物菌体及其代谢产物、未利用的培养基成分(可能的话)等。
本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.AureobasidinA发酵制备
取菌株CGMCC NO.20887的工作菌种甘油管，解冻后取两环菌悬液接种固体培养基，25℃培养72h，取一环菌苔接种种子培养基，25℃培养48h，然后按照1％接种量接种到发酵培养基中，发酵温度25℃，空气流量1vvm，搅拌100rpm，培养56h后补入初始投料体积1/5的新鲜补料培养基，继续在25℃，空气流量1vvm，搅拌100rpm，培养至8天结束，获得含AureobasidinA的发酵液。取该发酵液1ml，用5倍体积无水乙醇浸泡半小时以上，离心取上清液，用0.45μm膜过滤后采用HPLC进行分析检测，该发酵液AureobasidinA含量为0.98g/L。
种子培养基：葡萄糖2％，酵母基础氮源0.67％。消前pH6.5，121℃消毒30min。
发酵培养基：葡萄糖2％，(NH4)2SO40.5％，KH2PO40.15％，MgSO4*7H2O0.05％，CaCl2*2H2O 0.01％，NaCl 0.01％，FeCl3*6H2O 0.5μg/ml，ZnSO4*7H2O0.5μg/ml。消前pH6.5，121℃消毒30min。
补料培养基：葡萄糖10％，(NH4)2SO42.5％，聚胨5％，KH2PO40.75％，MgSO4*7H2O0.25％，CaCl2*2H2O 0.05％，NaCl 0.05％，FeCl3*6H2O 2.5μg/ml，ZnSO4*7H2O 2.5μg/ml。消前pH6.5，121℃消毒30min。
实施例2.AureobasidinA发酵制备方法优化
菌种活化：取工作菌种甘油管，30℃水浴解冻，混匀后取0.1ml菌悬液接种到PDA培养基平板，用涂布棒涂布均匀包扎好，倒扣于22～30℃、40～70％相对湿度的培养箱内活化培养4天，菌苔丰厚饱满，呈奶油色或橄榄绿。
菌悬液制备：取生长好且质量合格的平板菌苔，每片平板用15ml无菌生理盐水洗下，转移至加有两勺玻璃珠的三角瓶中，振荡30min，打散混匀后获得菌悬液。
种子扩培：取制备好的菌悬液，以0.5％的接种量接种到摇瓶种子培养基中，于25℃、220rpm的摇床上振荡培养24h。然后将摇瓶种子培养液以0.1％的接种量接种到种子罐进行二级扩培，控制罐温25℃、搅拌150～300rpm、溶氧≥30％，培养18h。
发酵控制培养：将扩培好的种子培养液，以1％的移种量移种到发酵培养基中，控制发酵温度25℃、搅拌150～500rpm、溶氧30～40％、pH 5.5～6.5，培养8天结束，获得含AureobasidinA的发酵液。
产量检测：取发酵液1ml，用5倍体积无水乙醇浸泡半小时以上，离心取上清液，用0.45μm膜过滤后采用HPLC进行分析检测，该发酵液Aureobasidin A含量为1.73g/L。
种子培养基：葡萄糖2％，酵母基础氮源0.67％。消前pH6.5，121℃消毒30min。
发酵培养基：葡萄糖3.67％，(NH4)2SO40.92％，聚胨0.83％，KH2PO40.275％，MgSO4*7H2O 0.092％，CaCl2*2H2O 0.018％，NaCl 0.018％，FeCl3*6H2O0.92μg/ml，ZnSO4*7H2O0.92μg/ml。消前pH6.5，121℃消毒30min。
实施例3.AureobasidinA种子配方优化
菌种活化：取工作菌种甘油管，30℃水浴解冻，混匀后取0.1ml菌悬液接种到PDA培养基平板，用涂布棒涂布均匀包扎好，倒扣于22～30℃、40～70％相对湿度的培养箱内活化培养4天，菌苔丰厚饱满，呈奶油色或橄榄绿。
菌悬液制备：取生长好且质量合格的平板菌苔，每片平板用15ml无菌生理盐水洗下，转移至加有两勺玻璃珠的三角瓶中，振荡30min，打散混匀后获得菌悬液。
种子扩培：取制备好的菌悬液，以0.5％的接种量接种到优化的摇瓶种子培养基中，于25℃、220rpm的摇床上振荡培养24h。然后将摇瓶种子培养液以0.1％的接种量接种到种子罐进行二级扩培，控制罐温25℃、搅拌150～300rpm、溶氧≥30％，培养18h。
发酵控制培养：将扩培好的种子培养液，以1％的移种量移种到发酵培养基中，控制发酵温度25℃、搅拌150～500rpm、溶氧30～40％、pH 5.5～6.5，培养8天结束，获得含AureobasidinA的发酵液。
产量检测：取发酵液1ml，用5倍体积无水乙醇浸泡半小时以上，离心取上清液，用0.45μm膜过滤后采用HPLC进行分析检测，该发酵液Aureobasidin A含量为1.96g/L。
优化种子培养基：葡萄糖2％，淀粉1％，酵母抽提粉0.5％，玉米浆干粉0.2％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.1％。消前pH6.5，121℃消毒30min。
发酵培养基：葡萄糖3.67％，(NH4)2SO40.92％，聚胨0.83％，KH2PO40.275％，MgSO4*7H2O 0.092％，CaCl2*2H2O 0.018％，NaCl 0.018％，FeCl3*6H2O0.92μg/ml，ZnSO4*7H2O0.92μg/ml。消前pH6.5，121℃消毒30min。
实施例4.AureobasidinA发酵培养基优化
菌种活化：取工作菌种甘油管，30℃水浴解冻，混匀后取0.1ml菌悬液接种到PDA培养基平板，用涂布棒涂布均匀包扎好，倒扣于22～30℃、40～70％相对湿度的培养箱内活化培养4天，菌苔丰厚饱满，呈奶油色或橄榄绿。
菌悬液制备：取生长好且质量合格的平板菌苔，每片平板用15ml无菌生理盐水洗下，转移至加有两勺玻璃珠的三角瓶中，振荡30min，打散混匀后获得菌悬液。
种子扩培：取制备好的菌悬液，以0.5％的接种量接种到优化的摇瓶种子培养基中，于25℃、220rpm的摇床上振荡培养24h。然后将摇瓶种子培养液以0.1％的接种量接种到种子罐进行二级扩培，控制罐温25℃、搅拌150～300rpm、溶氧≥30％，培养18h。
发酵控制培养：将扩培好的种子培养液，以1％的移种量移种到发酵培养基中，控制发酵温度25℃、搅拌150～500rpm、溶氧30～40％、pH 5.5～6.5，培养8天结束，获得含AureobasidinA的发酵液。
产量检测：取发酵液1ml，用5倍体积无水乙醇浸泡半小时以上，离心取上清液，用0.45μm膜过滤后采用HPLC进行分析检测，该发酵液Aureobasidin A含量为3.01g/L。
优化种子培养基：葡萄糖2％，淀粉1％，酵母抽提粉0.5％，玉米浆干粉0.2％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.1％。消前pH6.5，121℃消毒30min。
优化发酵培养基：葡萄糖3％，糊精5％，淀粉3％，酵母抽提粉3％，黄豆饼粉4％，硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.1％，硝酸钠0.1％。消前pH6.5，121℃消毒30min。
实施例5.AureobasidinA发酵关键工艺参数优化
菌种活化：取工作菌种甘油管，30℃水浴解冻，混匀后取0.1ml菌悬液接种到PDA培养基平板，用涂布棒涂布均匀包扎好，倒扣于22～30℃、40～70％相对湿度的培养箱内活化培养4天，菌苔丰厚饱满，呈奶油色或橄榄绿。
菌悬液制备：取生长好且质量合格的平板菌苔，每片平板用15ml无菌生理盐水洗下，转移至加有两勺玻璃珠的三角瓶中，振荡30min，打散混匀后获得菌悬液。
种子扩培：取制备好的菌悬液，以0.5％的接种量接种到优化的摇瓶种子培养基中，于25℃、220rpm的摇床上振荡培养24h。然后将摇瓶种子培养液以0.1％的接种量接种到种子罐进行二级扩培，控制罐温25℃、搅拌150～300rpm、溶氧≥30％，培养18h。
发酵控制培养：将扩培好的种子培养液，以1％的移种量移种到发酵培养基中，控制发酵温度25℃、搅拌150～500rpm、溶氧10～15％、pH 5.5～6.5，培养10天结束，获得含AureobasidinA的发酵液。
产量检测：取发酵液1ml，用5倍体积无水乙醇浸泡半小时以上，离心取上清液，用0.45μm膜过滤后采用HPLC进行分析检测，该发酵液Aureobasidin A含量为3.67g/L。
优化种子培养基：葡萄糖2％，淀粉1％，酵母抽提粉0.5％，玉米浆干粉0.2％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.1％。消前pH6.5，121℃消毒30min。
优化发酵培养基：葡萄糖3％，糊精5％，淀粉3％，酵母抽提粉3％，黄豆饼粉4％，硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.1％，硝酸钠0.1％。消前pH6.5，121℃消毒30min。
实施例6.AureobasidinA发酵培养基添加异丙基氯化镁的影响
菌种活化：取工作菌种甘油管，30℃水浴解冻，混匀后取0.1ml菌悬液接种到PDA培养基平板，用涂布棒涂布均匀包扎好，倒扣于22～30℃、40～70％相对湿度的培养箱内活化培养4天，菌苔丰厚饱满，呈奶油色或橄榄绿。
菌悬液制备：取生长好且质量合格的平板菌苔，每片平板用15ml无菌生理盐水洗下，转移至加有两勺玻璃珠的三角瓶中，振荡30min，打散混匀后获得菌悬液。
种子扩培：取制备好的菌悬液，以0.5％的接种量接种到优化的摇瓶种子培养基中，于25℃、220rpm的摇床上振荡培养24h。然后将摇瓶种子培养液以0.1％的接种量接种到种子罐进行二级扩培，控制罐温25℃、搅拌150～300rpm、溶氧≥30％，培养18h。
发酵控制培养：将扩培好的种子培养液，以1％的移种量移种到发酵培养基中，控制发酵温度25℃、搅拌150～500rpm、溶氧10～15％、pH 5.5～6.5，培养10天结束，获得含AureobasidinA的发酵液。
产量检测：取发酵液1ml，用5倍体积无水乙醇浸泡半小时以上，离心取上清液，用0.45μm膜过滤后采用HPLC进行分析检测，该发酵液Aureobasidin A含量为5.52g/L。
优化种子培养基：葡萄糖2％，淀粉1％，酵母抽提粉0.5％，玉米浆干粉0.2％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.1％。消前pH6.5，121℃消毒30min。
优化且添加0.1％异丙基氯化镁发酵培养基：葡萄糖3％，糊精5％，淀粉3％，酵母抽提粉3％，黄豆饼粉4％，硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.1％，异丙基氯化镁0.1％，硝酸钠0.1％。消前pH6.5，121℃消毒30min。
各实施例的发酵液中AureobasidinA的产量结果如图1所示。
种子活力对发酵菌种生长速率(a)、底物消耗速率(b)、AureobasidinA合成速率(c)的影响如图2所示。
实施例3、4、5中AureobasidinA合成曲线对比如图3所示。
发酵培养基中添加异丙基氯化镁对AureobasidinA合成和碳源转化率的影响如图4所示。
通过实施例1、实施例2可以看出，在AureobasidinA发酵制备过程中，增加菌悬液制备、增加二级种子扩培、控制发酵pH后明显提高了AureobasidinA的产量，提升幅度为76.5％。
通过实施例2、实施例3可以看出，对种子培养基优化后，使得发酵阶段前期，菌种生长速率、底物消耗速率、AureobasidinA合成速率明显加快，最终AureobasidinA的产量增加了13.3％。
通过实施例3、实施例4、实施例5可以看出，通过发酵配方优化和溶氧控制，使AureobasidinA的产量分别提升了53.6％和22％，说明发酵培养基和溶氧对AureobasidinA的产量有显著影响。
通过实施例5、实施例6可以看出，发酵培养基中添加异丙基氯化镁后，碳源到产物的转化率明显变高，最终使得AureobasidinA的产量明显提升，提升率达到50.4％。
综上所述，本发明使用Aureobasidin A高产菌株CGMCC NO.20887作为生产菌种，进一步通过优化种子培养基，使其具备旺盛活力，迅速解除发酵营养的底物效应而加速产素启动。通过发酵配方优化，尤其是添加异丙基氯化镁可以有效调节该菌种的碳源代谢，从而显著提高Aureobasidin A的合成效率。此外，对Aureobasidin A发酵过程中溶氧这一关键工艺条件进行控制，可以维持产率稳定、延长产物合成周期。最终，使得Aureobasidin A的产量显著提升，降低其生产成本，从而有利于实现商业化生产。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。
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