一条结合猪瘟病毒e0蛋白的多肽序列及应用
阅读说明：本技术 一条结合猪瘟病毒e0蛋白的多肽序列及应用 (Polypeptide sequence combined with classical swine fever virus E0 protein and application thereof ) 是由 张改平 王爱萍 王方雨 刘东民 赵建国 陈玉梅 刘红亮 丁培杨 冯景 于 2020-12-25 设计创作，主要内容包括：本发明主要涉及猪瘟病毒E0蛋白亲和多肽及应用,该多肽利用计算机辅助由虚拟分子对接技术设计而成,序列为WRHDFQ(P-3)。本发明以牛病毒性腹泻病毒E0蛋白同源建模获得的猪瘟病毒E0蛋白晶体结构为模板,利用分子对接技术获得多肽序列P-3；合成多肽后,采用等离子共振试验和酶联免疫吸附测定试验,鉴定该序列与猪瘟E0蛋白相互作用的亲和力和特异性,结果表明P-3序列与猪瘟E0蛋白具有较高的亲和力和特异性；本发明可通过对多肽进行标记,从而对猪瘟抗原进行快速定性和定量检测,并可通过多肽对蛋白的结合能力,利用多肽对猪瘟E0蛋白进行富集,为蛋白纯化提供新思路。(The invention mainly relates to a classical swine fever virus E0 protein affinity polypeptide and application thereof, wherein the polypeptide is designed by a virtual molecule docking technology with the assistance of a computer, and the sequence is WRHDFQ (P) 3 ). The invention uses the classical swine fever virus E0 protein crystal structure obtained by bovine viral diarrhea virus E0 protein homologous modeling as a template, and utilizes a molecular docking technology to obtain a polypeptide sequence P 3 (ii) a After the polypeptide is synthesized, the affinity and the specificity of the interaction of the sequence and the hog cholera E0 protein are identified by adopting a plasma resonance test and an enzyme-linked immunosorbent assay test, and the result shows that P 3 The sequence has higher affinity and specificity with the hog cholera E0 protein; the invention can carry out rapid qualitative and quantitative detection on the swine fever antigen by marking the polypeptide, and can enrich the swine fever E0 protein by utilizing the polypeptide through the binding capacity of the polypeptide to the protein, thereby providing a new thought for protein purification.)
技术领域
本发明主要涉及猪瘟病毒E0蛋白亲和多肽的设计及其对E0结合能力的检测，属于猪瘟病毒检测应用。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever，CSF)为猪瘟病毒(Classical swine fevervirus，CSFV)引起的一种急性、热性及高度接触性传染病。猪瘟病毒E0蛋白又称为Erns蛋白，是CSFV的第一个囊膜糖蛋白，蛋白氨基酸序列中存在9个潜在的糖基化位点，在蛋白翻译加过程中，其分子量大小随着糖基化的不同而不同，E0蛋白，是猪瘟病毒所有结构蛋白中唯一能够分泌到细胞上清中的蛋白，能够刺激机体产生抵抗CSFV感染的中和保护抗体。E0蛋白对CSFV的增殖及感染有着重要影响，在介导病毒与宿主细胞相互作用中起重要作用。此外，E0蛋白还具有RNase活性，并在神经毒性、抗肿瘤及免疫调节方面发挥重要作用。
20世纪90年代后，生物信息学和计算机分子模拟技术的空前发展为蛋白质功能及高级结构的解析提供了更广阔的平台，使越来越多的研究者能够从分子水平上进一步认识多肽与蛋白之间的相互作用模式。与传统多肽筛选方法相比，计算机虚拟筛选技术具有节省生产成本、节省时间、不需要多肽的物理合成等优点，目前正广泛应用。分子对接技术即为常用的计算机模拟技术之一。
发明内容
本发明在同源建模的猪瘟病毒E0蛋白结构基础上，通过计算机模拟的虚拟分子对接技术，在计算机上模拟多肽与靶标猪瘟E0蛋白结合，获得了一条亲和力最佳的多肽，其序列为 WRHDFQ，命名为P3。合成P3后，通过局域表面等离子体共振试验(LSPR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)及检测，鉴定该多肽与靶标蛋白之间的亲和力及特异性。结果表明，P3与猪瘟病毒E0蛋白具有较强的亲和力和较好的特异性。由此可见，由本发明设计获得的多肽序列能够用于以与猪瘟E0蛋白结合为基础的相关研究，如病毒检测、蛋白纯化等。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案：
一条可与猪瘟E0蛋白结合的多肽序列为线性多肽，其序列为P3：WRHDFQ。
所述的多肽序列，包括以P3序列为核心，任何对P3序列所进行的相应调整或修饰，修饰材料包括但不限制在生物素、亲和素、磁珠、纳米材料、荧光材料、酶类及特定的蛋白质上。
将所述P3序列用于任何猪瘟病毒相关的快速定性或定量检测、鉴定，其中包括但不局限于酶联免疫吸附试验检测、等离子共振试验检测、聚丙烯酰胺凝胶电泳。
所述的多肽序列在制备猪瘟病毒快速检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明的积极有益效果：
(1)本发明以由牛病毒性腹泻病毒E0蛋白(BVDV-E0)同源建模的猪瘟病毒E0蛋白(CSFV-E0)为基础，利用虚拟分子对接技术，获得一条能够与猪瘟病毒E0蛋白结合的多肽序列P3，该多肽与猪瘟病毒E0蛋白的亲和力较高，二者之间相互作用的平衡解离常数KD为2.86×10-7M，即286nM。
(2)本发明的P3多肽性质稳定、结构简单、无免疫原性，易于合成及修饰，且易溶于水等优点。
(3)本发明的P3序列与人工表达的猪瘟病毒E0蛋白及人工接种CSFV均能够结合。
(4)本发明的P3序列具有良好的特异性，除与牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的交叉反应较高外，与其他蛋白的交叉反应均较低。
(5)本发明与传统噬菌体多肽筛选相比，具有操作简单、筛选强度低、研发周期短、生产成本低等优势，并可通过计算机模拟实施虚拟分子对接，实现猪瘟E0蛋白特定位点的靶向结合，为实现对猪瘟E0蛋白进行结构功能解析提供更好的理论支持，通过对P3序列进行标记，可实现对猪瘟病毒E0蛋白进行定性和定量快速检测。
附图说明
图1为猪瘟病毒E0蛋白同源建模活性口袋结构展示图。
图2为P3序列与猪瘟病毒E0蛋白的对接结果展示图。
图3为P3序列与人工表达纯化的猪瘟病毒E0蛋白的SPR亲和力鉴定结果。
其中，纵坐标代表传感器所检测到的信号值；横坐标代表样品在传感器中相互作用的时间。图中，从上到下各曲线对应的P3溶液浓度逐渐降低；各曲线对应浓度分别为：2.5μM、1.25μM、 625nM、312.5nM、156.25nM、78nM。
图4为P3序列与人工表达猪瘟病毒E0蛋白及其他病毒蛋白结合的ELISA鉴定结果。
图5为P3序列与人工接种猪瘟病毒及病毒结合的ELISA鉴定结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1分子对接及虚拟肽库的筛选
1、E0蛋白的准备
根据PDB数据库中的牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的晶体结构(PDB ID：4DWC)进行同源建模，借助计算机程序对晶体结构进行分析，选出对接特定区域(见图1)，进行分子对接。
2、虚拟多肽库的设计
采用逐个氨基酸延长的方式，借助计算机辅助技术，先选出对接情况最佳的氨基酸残基，再以此氨基酸残基为核心，逐个依次增加氨基酸的数量，直到模拟出最佳的对接结果。虚拟多肽均以直链的形式生成，不对多肽序列侧链及两端进行修饰，虚拟多肽库生成的多肽以2-9 个氨基酸残基为宜。
3、对接结果的评断
利用分子对接软件中的MOLCAD模块，分别计算多肽与蛋白结合的范德华力、氢链、疏水作用力、静电作用力等力学参数，以此来判定筛选结果，并筛选得到P3，其多肽序列为WRHDFQ(SEQ ID NO.1)，P3与猪瘟E0蛋白对接的相互作用位置结果见图2。
实施例2 P3序列与人工表达E0蛋白的亲和力鉴定
1、采用EDC/NHS活泼酯法，先用激活缓冲液溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，分装100μL/管。使用前将EDC和NHS各一管混匀(EDC/NHS，体积比1:1)，注入装有羧基芯片的SPR检测仪中，相互作用5min，将芯片上的羧基完全展示在表面，并活化芯片上的羧基基团。
2、将人工表达的猪瘟E0蛋白用PBS液稀释为1mg/mL(蛋白量计)，再在200μL体系中，用PBS将蛋白稀释为150μg/mL，并加入50μL芯片激活缓冲液，再将猪瘟E0蛋白注入SPR检测仪中，保证蛋白与羧基芯片相互作用5min，将猪瘟E0蛋白偶联到羧基芯片上，再注入200μL芯片配套封闭液进行封闭。偶联完成后，该传感芯片用于测量猪瘟E0蛋白与 P3序列之间的相互作用。
3、以150μL/min的流速运行缓冲液，并向传感器中注入200μL PBS溶液(pH 7.4)，达到信号基线后，将缓冲液的运行流速降至20μL/min，以获得较为稳定的基线。
4、将合成的P3粉末用超纯水稀释为10mg/mL，再用PBS缓冲液依次稀释成2.5μM、1.25μM、625nM、312.5nM、156.25nM、78nM不同浓度的P3溶液，
依次由低到高浓度向传感器中注入200μL多肽溶液，注入样品运行流速均采用20μL/min，并与传感器相互作用5min，再以缓冲液冲洗芯片5min解离多肽。每一浓度样品注入循环结束后，以250μL 0.25％SDS溶液彻底解离结合在蛋白上剩余的多肽P3。最终以得到的不同浓度的多肽与蛋白结合与解离曲线为依据，对P3序列和E0蛋白进行亲和力分析。
结果表明，P3序列与人工表达的猪瘟E0蛋白具有较好的亲和性结合，两者之间相互作用的平衡解离常数KD值为2.86×10-7M即286nM(见图3)。
实施例3 P3序列与人工表达E0蛋白的ELISA鉴定
1、将人工表达的猪瘟E0蛋白以10μg/mL(蛋白量计)的浓度用包被液稀释，每孔加入 50μL进行酶标板包被，37℃条件下孵育2h，PBST洗板四次后，用5％脱脂奶PBST溶液封闭2h，再以PBST洗板4次待用；以同样方式将不同病毒表达纯化的蛋白进行包被，即牛病毒性腹泻病毒E0蛋白(BVDV-E0)、伪狂犬病毒gD蛋白(PRV-gD)、猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白(PRRSV-M)、圆环病毒Cap蛋白(PCV-Cap)、乙脑病毒E蛋白(JEV-E)，并以2％的牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照，PBS作为空白对照。
2、将人工合成并在氨基端生物素化修饰的P3干粉，用超纯水稀释成10mg/mL的浓度，再用PBS缓冲液(pH 7.4)将多肽溶液稀释至500μg/mL，以50μL/孔的体积加入到包被好的酶标板中，混匀后置于37℃条件下孵育1h，用PBST洗板4次，并甩干酶标板孔中的液体。
3、加入以PBST缓冲液稀释1000倍的辣根过氧化物酶-亲和素二抗，以50μL/孔的体积加入酶标板中，混匀后置于37℃条件下孵育30min，PBST洗板4次。
4、将TMB显色液以100μL/孔的体积，加入上述酶标板中，室温条件下，充分混匀30s之后，避光显色10min。
5、将2M的硫酸液终止液以50μL/孔的体积加入上述酶标板中，充分混匀30s后，将酶标板置于酶标仪上读取各孔在450nm处的吸光值，分析结果。
结果表明，P3序列与人工表达纯化的猪瘟E0蛋白具有较好的亲和性与特异性，除与牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的交叉反应较高外，与其它病毒蛋白均不发生反应(见图4)。
实施例4 P3序列与人工接种CSFV的ELISA鉴定
1、以包被缓冲液为抗原包被液，将感染CSFV的PK-15细胞培养液进行超声破碎，然后以200TCID50(病毒含量计)包被酶标版；以同样方式将不同病毒培养液，即猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和未感染的PK-15细胞培养液进行酶标板包被，作为对照。同样以50μL/孔的体积加入酶标板中，置于37℃条件下孵育2h，PBST洗板4次。
2、5％的脱脂奶PBST溶液封闭，置于37℃条件下孵育2h，PBST洗板4次。
3、将人工合成并在氨基端生物素化修饰的P3干粉，用超纯水稀释成10mg/mL的浓度，再用PBS缓冲液(pH 7.4)将多肽溶液稀释至500μg/mL，以50μL/孔的体积加入到包被好的酶标板中，混匀后置于37℃条件下孵育1h，PBST洗板4次。
4、加入以PBST稀释1000倍的辣根过氧化物酶-亲和素二抗，以50μL/孔的体积加入酶标板中，置于37℃条件下孵育30min，PBST洗板4次。
5、将TMB显色液以100μL/孔的体积，加入上述酶标板中，混匀30s后室温条件下，避光显色10min。
6、将2M的硫酸液终止液以50μL/孔的体积，加入酶标板中，充分混匀30s后，将酶标板置于酶标仪上读取各孔在450nm处的吸光值，分析结果。
结果表明，P3序列与人工接种的CSFV细胞培养液具有较好的亲和性与特异性，除与同源性较高的BVDV细胞培养液发生交叉反应外，与其它病毒培养液不发生反应(见图5)。
序列表
<110> 河南中泽生物工程有限公司
<120> 一条结合猪瘟病毒E0蛋白多肽序列及应用
<130> 虚拟分子对接技术
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 1
Trp Arg His Asp Phe Gln
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