一种风湿性关节炎的诊断标志物
阅读说明：本技术 一种风湿性关节炎的诊断标志物 (Diagnosis marker for rheumatic arthritis ) 是由 卢华定 徐祥赫 陈宇峰 于 2020-12-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种风湿性关节炎的诊断标志物,所述标志物含有环状RNA hsa-circ-0140271,所述环状RNA hsa-circ-0140271靶向X染色体上的MED14基因。本发明解决了现有技术中,RA的诊断仅能够依靠临床症状、实验室指标和影像学检查等综合判断,无单一的指标可用于明确的诊断的技术缺陷,而且相对于现有的anti-CCP,特异性更高,尤其是对女性RA有很好的特异性,误诊率更低。本发明中的标志物还对RA相关的炎症因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的表达具有一定的影响。(The invention discloses a diagnostic marker for rheumatoid arthritis, which comprises circular RNA hsa _ circ _0140271, wherein the circular RNA hsa _ circ _0140271 targets MED14 gene on X chromosome. The invention overcomes the technical defect that RA diagnosis in the prior art can only depend on clinical symptoms, laboratory indexes, imaging examination and other comprehensive judgment, no single index can be used for definite diagnosis, and compared with the existing anti-CCP, the specificity is higher, especially good specificity is provided for female RA, and the misdiagnosis rate is lower. The markers of the invention also have some effect on the expression of the inflammatory factors associated with RA (IL-6, IL-8, TNF-. alpha.).)
技术领域
本发明属于疾病诊断标志物领域，具体涉及一种风湿性关节炎的诊断标志物。
背景技术
类风湿性关节炎(RA)是一种常见的慢性自身免疫性疾病，该疾病以侵蚀性关节炎为主要临床表现。RA的全球发病率为0.5-1％。RA早期诊断对于治疗和预后意义重大。据统计，RA患者从出现典型症状(晨僵)开始到确诊时的时间中位数为6个月，而25％患者是在患病一年以上才被确诊。目前，RA早期诊断是根据患者的临床表现，结合实验室检测及影像学检查结果综合判定，因此，尚无明确有效的单一指标以用于RA的早期诊断。
此外，RA在患病人群中表现有明显的性别差异性，女性患者占多数，男女患病比率为1:4，研究发现，X染色体上的某些基因在女性RA患者中会有高表达现象，但目前并无针对女性RA的特异性的诊断指标。
环状RNA(circRNA)因为具有对核酸酶不敏感相比线性RNA半衰期更长，更为稳定，且环状RNA在细胞内表达丰度高，具有较强的组织特异性，具有极高的研究价值。
因此，为了有效保障RA的早期检查率，开发一种针对女性RA患者的稳定的诊断标志物具有极高的医疗价值和研究价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种标志物；
本发明的另一目的在于提供特异性引物组；
本发明的另一目的在于提供一种检测试剂；
本发明的另一目的在于提供一种检测试剂盒；
本发明的另一目的在于提供检测上述标志物的试剂或材料在制备风湿性关节炎检测制剂中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种标志物，该标志物为靶向X染色体上的MED14基因的环状RNA。
人唾液中可以检测到400多个环状RNA(circRNA)的存在，血液中可以检测到上千种circRNA，说明circRNA可以在血液、唾液等临床标本中稳定存在，因此，circRNA可以成为一种理想的分子标志物类型。
进一步地，上述环状RNA为hsa_circ_0140271。
发明人通过对RA患者的外周血单个核细胞(PBMC)中的RNA进行高通量测序发现，由X染色体的MED14基因产生的hsa_circ_0140271特异性高表达于RA女性患者中(特异性优于目前现有的RA诊断指标——抗环瓜氨酸多肽抗体(anti-CCP))，并且通过ROC曲线分析发现，与正常女性组、骨性关节炎女性组以及强直性脊柱炎女性组的比较中，本发明中的标志物特异性均为1，说明本发明中的标志物可作为潜在的诊断女性RA的特异性指标。
进一步地，上述环状RNAhsa_circ_0140271的核苷酸序列为：
5’-AGAACAACTTTATGAGATTGGGAATCATGATCACCTCCATTTTACAGTTGAAAAAAGCTGAGGCACAAAGAGGTTAAGTTACTTGCCCAAGGTTACAAGACTGGTAAGTAGCAGAGTTAAAATGGAGAACAAGGCAGTCTAGGTCTAGGAGTCCATGCTTTTAACTCCTTCATTACCAACCAACTCTGGAAGTCTGTAAGAGGAAAAAACCATTTTATTCTACTTATTTTTCCTAACTTTGATATTATGTGTGTGTAATGTTAAGGATGGAGAAATGAATTAGAAAGCTTTTACTTAAAGTGACAGAAAATTATTGCTCTTAATATCAAATACTAGTGTATTAAATATTTCTTCTTCAAGTTACTGGAGAATATTTGAAGAACTACTTTGAAATATGGAAAACTGATACTAATTCCCCTTGAAGTTTACTTTGGAATGATTTAACAATATTTAGTGTGAAAAGGAGATAGTTTTCAGGGATGCTTAATACATTTACCCTTTACTTTAAAGATGATTTCAAGCTTTTTAGATCAGCAAGCCATCCTGTTTGTGGACACTGCTGATCGCCTGGCCTCGTTAGCTAGAGATGCTCTGGTCCATGCACGCCTGCCTAGTTTTGCCATCCCATATGCCATTGATGTACTAACTACTGGATCTTACCCACGGCTGCCAACCTGCATTAGGGACAAAATTATTCCTCCAGACCCAATTACCAAAATTGAAAAACAAGCCACACTCCATCAGCTGAATCAGATTCTTAGACATCGGCTTGTAACCACAGATCTTCCTCCTCAGTTAGCAAATCTTACAGTTGCAAATGGCCGGGTGAAGTTTCGTGTTGAAGGAGAATTTGAAGCCACCTTGACTGTGATGGGAGATGACCCTGATGTTCCATGGCGTCTTCTCAAGCTAGAAATTCTAGTTGAGGATAAGGAAACAGGAG-3’(SEQ ID NO.1)。
发明人通过circBANK和circinteractome数据库分别预测到hsa_circ_0140271针对的mi RNA为74个和50个，其中，circBANK和circinteractome数据库预测得到的相同miRNA为8个，说明这8个miRNA是hsa_circ_0140271最有可能靶向的位点。
本发明的第二个方面，提供：
特异性引物组，该特异性引物组特异性扩增靶向X染色体上的MED14基因的环状RNA。
进一步地，上述环状RNA为hsa_circ_0140271。
该特异性引物组是基于上述的标志物核苷酸序列设计得到，用于靶向扩增上述的标志物。
进一步地，上述特异性引物组核苷酸序列为：
上游引物：5'-ATCGGCTTGTAACCACAGAT-3'(SEQ ID NO.2)；
下游引物：5'-CTCATAAAGTTGTTCTCTCCTG-3'(SEQ ID NO.3)。
该标志物的检测方法，包括以下步骤：
(1)从待测样品中提取RNA，反转录得到cDNA；
(2)使用引物组扩增步骤(1)得到的cDNA，计算Ct值；
(3)设置内参基因，检测内参基因的表达量，计算Ct值；
(4)使用2–ΔCT法分析步骤(2)和(3)得到的Ct值，判断待测样品中是否含有上述的标志物。
进一步地，步骤(2)中上述引物组包括上述的引物组。
进一步地，上述步骤(4)中判断待测样品的标准为：
若2–ΔCT法分析得到的2–ΔCT值大于0.110，则上述待测样品中含有上述的标志物，上述待测样品为风湿性关节炎样品。
进一步地，步骤(3)上述内参基因包括GAPDH。
进一步地，提取待测样品中的RNA时使用Omega Bio-tek的Total RNAkit。当然，也可以根据实际使用需求，采用本领域其他常规方式进行提取。
更进一步地，检测上述内参基因GAPDH的表达量和扩增步骤(1)得到的RNA时，采用Sybr Green法；
其中，内参基因GAPDH的特异性引物组为：
GAPDH-F：5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'(SEQ ID NO.4)；
GAPDH-R：5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'(SEQ ID NO.5)；
Sybr Green法的反应体系为：
cDNA(1:20稀释)
5.0μL
10μM对应的上游引物
0.5μL
10μM对应的下游引物
0.5μL
2x SYBR Green PCR Master Mix
10μL
dH<sub>2</sub>O
4.0μL
总体积
20μL
反应条件为：
95℃，5min；95℃，15s；60℃，15s；72℃，32s；循环40次。
在72℃时收集荧光信号，绘制融解曲线(温度范围60℃-95℃)。
更进一步地，上述2–ΔCT的计算方法，具体步骤为：
计算–ΔCT值:hsa_circ_0140271的Ct值减去相对应样品的GAPDH的Ct值，再取其负数值为–ΔCT值。然后以–ΔCT值为幂值，计算2–ΔCT值。
更进一步地，上述待测样品源自雌性动物。
本发明的第三个方面，提供：
一种检测试剂，该检测试剂中含有上述引物组。
本发明的第四个方面，提供：
一种检测试剂盒，该检测试剂盒含有上述检测试剂。
进一步地，上述检测试剂盒还含有RT-PCR反应试剂、酶。
本发明的第五个方面，提供：
检测上述标志物的试剂或材料在制备风湿性关节炎检测制剂中的应用。
本发明的有益效果是：
1.本发明解决了现有技术中，RA的诊断仅能够依靠临床症状、实验室指标和影像学检查等综合判断，无单一的指标可用于明确的诊断的技术缺陷，提供了一种有效的单一RA早期诊断标志物。
2.本发明中的标志物相对于现有的anti-CCP，特异性更高，尤其是对女性RA有很好的特异性，而且本发明中的标志物的敏感性是低于anti-CCP，即根据本发明中的标志物诊断女性RA时误诊的几率比anti-CCP低，说明本发明中的标志物是一种RA早期诊断的更优标志物。
3.本发明中的标志物对RA相关的炎症因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的表达都具有影响，IL-6、IL-8、TNF-α在本发明中的标志物的界值正负组(大于界值可诊断为RA大于界值为正组，小于为负组)中有差异表达。
附图说明
图1为hsa_circ_0140271在不同人群中的表达差异图，其中，A为正常(HC)和RA组中hsa_circ_0140271表达差异；B为正常男性组(HC-M)、正常女性组(HC-F)、RA男性组(RA-M)和RA女性组(RA-F)中hsa_circ_0140271表达差异；
图2为hsa_circ_0140271通过circBANK和circinteractome数据库分别预测的miRNA靶序列数量示意图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
标志物的设计
通过对RA患者的PBMC中的RNA进行高通量测序，发现由X染色体的MED14基因产生的hsa_circ_0140271特异性高表达于RA女性患者中，对hsa_circ_0140271进行测序，发现其核苷酸序列为：
5’-AGAACAACTTTATGAGATTGGGAATCATGATCACCTCCATTTTACAGTTGAAAAAAGCTGAGGCACAAAGAGGTTAAGTTACTTGCCCAAGGTTACAAGACTGGTAAGTAGCAGAGTTAAAATGGAGAACAAGGCAGTCTAGGTCTAGGAGTCCATGCTTTTAACTCCTTCATTACCAACCAACTCTGGAAGTCTGTAAGAGGAAAAAACCATTTTATTCTACTTATTTTTCCTAACTTTGATATTATGTGTGTGTAATGTTAAGGATGGAGAAATGAATTAGAAAGCTTTTACTTAAAGTGACAGAAAATTATTGCTCTTAATATCAAATACTAGTGTATTAAATATTTCTTCTTCAAGTTACTGGAGAATATTTGAAGAACTACTTTGAAATATGGAAAACTGATACTAATTCCCCTTGAAGTTTACTTTGGAATGATTTAACAATATTTAGTGTGAAAAGGAGATAGTTTTCAGGGATGCTTAATACATTTACCCTTTACTTTAAAGATGATTTCAAGCTTTTTAGATCAGCAAGCCATCCTGTTTGTGGACACTGCTGATCGCCTGGCCTCGTTAGCTAGAGATGCTCTGGTCCATGCACGCCTGCCTAGTTTTGCCATCCCATATGCCATTGATGTACTAACTACTGGATCTTACCCACGGCTGCCAACCTGCATTAGGGACAAAATTATTCCTCCAGACCCAATTACCAAAATTGAAAAACAAGCCACACTCCATCAGCTGAATCAGATTCTTAGACATCGGCTTGTAACCACAGATCTTCCTCCTCAGTTAGCAAATCTTACAGTTGCAAATGGCCGGGTGAAGTTTCGTGTTGAAGGAGAATTTGAAGCCACCTTGACTGTGATGGGAGATGACCCTGATGTTCCATGGCGTCTTCTCAAGCTAGAAATTCTAGTTGAGGATAAGGAAACAGGAG-3’(SEQ ID NO.1)。
标志物的检测
检测hsa_circ_0140271表达的具体步骤为：
以患者外周静脉血为检测样品。
1.提取PBMC及其中的RNA。
抽取患者外周静脉血10mL，放入预先盛有等体积的单核淋巴细胞分离液(SigmaHitopaque 1077)的离心管中。
在室温中400g离心30分钟后，提取中层的PBMC放入新的离心管中。加入10mL 1×PBS，在室温中250g离心10分钟。倒出上层PBS后，再加入5mL 1×PBS，在室温中250g离心5分钟，重复2次。倒出上层PBS后，加入RNA提取裂解液，根据试剂盒(Total RNA kit，Omega Bio-tek)操作说明，提取RNA后放入-80℃环境中保存或进行RT-qPCR(需对提取的RNA进行反转录或按照RT-qPCR试剂盒说明书操作)。
2.对提取的RNA进行RT-qPCR扩增。
circRNAhsa_circ_0140271的特异性引物组核苷酸序列为：
上游引物：5'-ATCGGCTTGTAACCACAGAT-3'(SEQ ID NO.2)；
下游引物：5'-CTCATAAAGTTGTTCTCTCCTG-3'(SEQ ID NO.3)。
内参基因为GAPDH，内参基因GAPDH的特异性引物组为：
GAPDH-F：5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'(SEQ ID NO.4)；
GAPDH-R：5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'(SEQ ID NO.5)。
采用Sybr Green法进行检测，Real-time PCR的仪器为7500Sequence Detection System。
Sybr Green法的反应体系为：
表1Sybr Green法的反应体系
cDNA(1:20稀释)
5.0μL
10μM对应的上游引物
0.5μL
10μM对应的下游引物
0.5μL
2x SYBR Green PCR Master Mix
10μL
dH<sub>2</sub>O
4.0μL
总体积
20μL
反应条件为：
95℃，5min；95℃，15s；60℃，15s；72℃，32s；循环40次。
在72℃时收集荧光信号，绘制融解曲线(温度范围60℃-95℃)。
更进一步地，上述2–ΔCT的计算方法，具体步骤为：
计算–ΔCT值:hsa_circ_0140271的Ct值减去相对应样品的GAPDH的Ct值，再取其负数值为–ΔCT值。然后以–ΔCT值为幂值，计算2–ΔCT值。
3.样品判定。
根据2–ΔCT值进行判定，若2–ΔCT值大于0.110，则认定样品中含有circRNAhsa_circ_0140271，可以认定该样品为RA样品。
标志物的验证
收集正常(HC)和RA组各41例PBMC样品，其中每组男性为10例，女性31例。采用上述标志物的检测方法进行检测，以验证该标志物准确性。
结果如图1所示，对比hsa_circ_0140271在正常男性组(HC-M)、正常女性组(HC-F)、RA男性组(RA-M)和RA女性组(RA-F)中的实际表达量，可以发现hsa_circ_0140271在女性RA中特异性高表达，说明hsa_circ_0140271可以作为女性RA患者的有效检测标志物。
本发明标志物与现有RA标志物的效果对比
收集女性RA患者和正常女性的PBMC样品，采用上述标志物的检测方法进行检测，以anti-CCP作为对照，anti-CCP检测方法采用本领域常规的anti-CCP检测法。
将女性RA患者和正常女性的hsa_circ_0140271和anti-CCP的表达值输入到SPSS软件进行ROC曲线分析。。
结果如表2所示。
表2上述标志物和anti-CCP检测的差异性
结果发现，anti-CCP特异性低于hsa_circ_0140271的特异性，而且在实际使用过程中，anti-CCP特异性还会更低，仅为0.4-0.89。而hsa_circ_0140271的特异性为1，说明对诊断RA，尤其是对女性RA有很好的特异性。而且hsa_circ_0140271的敏感性是低于anti-ccp，即根据hsa_circ_0140271的值可诊断女性RA时误诊的几率比anti-ccp低。
进一步分析hsa_circ_0140271的界值对RA相关的炎症因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等)的影响时，还发现IL-6、IL-8、TNF-α在本发明中的标志物的界值正负组(大于界值可诊断为RA大于界值为正组，小于为负组)中有差异表达。
本发明标志物的靶序列(miRNA)预测
利用circBank database数据库(http://www.circbank.cn/)和circular RNAInteractomedatabase数据库(https://circinteractome.nia.nih.gov/)预测与hsa_circ_0140271相关的miRNA，进一步通过对两个数据库预测的miRNA取交集，选出两个数据库共同的miRNA。
结果如图2和表3所示。
表3本发明标志物的靶序列(miRNA)预测靶序列miRNA
由结果可知，通过circBANK和circinteractome数据库分别预测到hsa_circ_0140271针对的miRNA为74个和50个。再对预测的miRNA进行交集分析，得到与hsa_circ_0140271相关性最为密切的8个miRNA。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学附属第五医院
中山大学
<120> 一种风湿性关节炎的诊断标志物
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 943
<212> DNA
<213> hsa_circ_0140271
<400> 1
agaacaactt tatgagattg ggaatcatga tcacctccat tttacagttg aaaaaagctg 60
aggcacaaag aggttaagtt acttgcccaa ggttacaaga ctggtaagta gcagagttaa 120
aatggagaac aaggcagtct aggtctagga gtccatgctt ttaactcctt cattaccaac 180
caactctgga agtctgtaag aggaaaaaac cattttattc tacttatttt tcctaacttt 240
gatattatgt gtgtgtaatg ttaaggatgg agaaatgaat tagaaagctt ttacttaaag 300
tgacagaaaa ttattgctct taatatcaaa tactagtgta ttaaatattt cttcttcaag 360
ttactggaga atatttgaag aactactttg aaatatggaa aactgatact aattcccctt 420
gaagtttact ttggaatgat ttaacaatat ttagtgtgaa aaggagatag ttttcaggga 480
tgcttaatac atttaccctt tactttaaag atgatttcaa gctttttaga tcagcaagcc 540
atcctgtttg tggacactgc tgatcgcctg gcctcgttag ctagagatgc tctggtccat 600
gcacgcctgc ctagttttgc catcccatat gccattgatg tactaactac tggatcttac 660
ccacggctgc caacctgcat tagggacaaa attattcctc cagacccaat taccaaaatt 720
gaaaaacaag ccacactcca tcagctgaat cagattctta gacatcggct tgtaaccaca 780
gatcttcctc ctcagttagc aaatcttaca gttgcaaatg gccgggtgaa gtttcgtgtt 840
gaaggagaat ttgaagccac cttgactgtg atgggagatg accctgatgt tccatggcgt 900
cttctcaagc tagaaattct agttgaggat aaggaaacag gag 943
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atcggcttgt aaccacagat 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctcataaagt tgttctctcc tg 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agccacatcg ctcagacac 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcccaatacg accaaatcc 19
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