有机化合物功能性独立的标记
阅读说明：本技术 有机化合物功能性独立的标记 (Functionally independent labelling of organic compounds ) 是由 杨光 理查德·A·乐纳 姜标 马培翔 许红涛 于 2019-07-17 设计创作，主要内容包括：本文公开了不依赖于化合物的任何官能团来标记有机化合物的方法。在一些实施方案中,提供了可用于所述方法的双官能连接子。(Disclosed herein are methods for labeling organic compounds independent of any functional group of the compound. In some embodiments, bifunctional linkers useful in the methods are provided.)
具体实施方式
。本领域的技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表了在本公开的实践中能很好发挥作用的技术，因此可以被认为构成了其实践的特定模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应该理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方式进行许多改变，仍然能获得相似或类似的结果。
实施例1
将化合物1(200mg)溶解在10mL二氯甲烷中，然后在搅拌下与化合物2(200mg)、EDCI(416mg)和DMAP(10mg)混合。在室温下搅拌3小时后，混合物用二氯甲烷萃取，用盐水洗涤，浓缩并通过快速色谱法纯化，得连接子I(210mg，70.4％)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.82(d,J＝8.5Hz,2H),7.25(d,J＝8.2Hz,2H),6.63(s,1H),3.79–3.62(m,6H),3.45–3.36(m,2H)；HRMS-ESI(m/z)[M+H]+C13H9F3N6O2，计算，343.1130，实测，343.1133。
实施例2
将化合物3(200mg)溶解在10mL二氯甲烷中，然后在搅拌下与化合物2(513mg)、EDCI(405mg)和DMAP(10mg)混合。在室温下搅拌3小时后，混合物用二氯甲烷萃取，用盐水洗涤，浓缩并通过快速色谱法纯化，得连接子II(283mg，75.6％)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.93(s,1H),3.72–3.66(m,2H),3.57(t,J＝5.0Hz,2H),3.48(t,J＝5.1Hz,2H),3.41–3.35(m,2H),2.06-1.98(m,2H),1.82–1.67(m,2H),1.03(s,3H)；HRMS-ESI(m/z)[M+H]+C9H17N6O2，计算，241.1413，实测，241.1417。
实施例3
将化合物4(50mg)溶于5mL二氯甲烷中，然后与化合物5(25μL)、HATU(150mg)和DIPEA(138μL)混合，在室温下搅拌3小时后，混合物用二氯甲烷萃取，用盐水洗涤，浓缩并通过快速色谱法纯化，得连接子III(49mg，79.1％)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.81(d,J＝8.5Hz,2H),7.26(d,J＝8.5Hz,2H),6.23(s,1H),4.26(dd,J＝5.2,2.6Hz,2H),2.30(t,J＝2.6Hz,1H).HRMS-ESI(m/z)[M+H]+C12H9F3N3O，计算，268.0698，实测，268.0699。
实施例4
根据梁等人(Angew Chem Int Ed Eng(2017)56(10):2744-2748)的方法，通过将乙腈替代溶剂N,N-二甲基甲酰胺，制备得3-(2-叠氮乙基)-3-甲基-3H-二嗪。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)＝1.05(s,3H),1.60(t,2H,J＝5.4Hz),3.18(t,2H,J＝5.4Hz)。
实施例5
将冬凌草甲素(2mg，0.0054mM)溶解在1mL二氯甲烷中，并与双官能连接子I(3.3mg，0.011mM)混合。混合物在室温下用紫外光(365nm)照射3小时，生成冬凌草甲素连接子I缀合物，其包含至少五种的异构产物，MS(ESI(m/z)[M+H]+)为679.27(图1)。
实施例6
在500μL管中，初始DNA7(50μL，1mM的硼酸盐缓冲液(pH 9.4))通过涡旋与化合物6(5μL，200mM的DMSO)混合，然后用旋转器旋转10小时。向混合物中加入5M氯化钠(5.5μL)，然后加入EtOH(160μL)。将内容物短暂涡旋，并在-20℃的冰箱中孵育20分钟。然后将悬浮液以10000×g离心5分钟，弃去上清液，并在真空下除去微量的EtOH。将沉淀溶解在H2O(50μL)中，制得1mM的化合物8溶液。(图2)。
实施例7
将化合物8(20μL，1mM在H2O中)与连接子I(4μL，100mM)、五水合硫酸铜(II)(4μL，100mM)、抗坏血酸钠(4μL，200mM)和四氢大麻酚(4μL，100mM)混合。混合物通过涡旋混合，然后在旋转器上旋转5小时。然后向混合物中加入5M氯化钠(3.6μL)，然后加入EtOH(100μL)。将内容物短暂涡旋并在-20℃孵育20分钟。然后将悬浮液以10000×g离心5分钟，弃去上清液，在真空下除去微量的乙醇，生成标记的化合物9(图3)。
实施例8
将化合物8(20μL，1mM在H2O中)与冬凌草甲素-连接子I缀合物(4μL，100mM)、五水合硫酸铜(II)(4μL，100mM)、抗坏血酸钠(4μL，200mM)和四氢大麻酚(4μL，100mM)混合。混合物通过涡旋混合，并在旋转器上旋转5小时。然后向混合物中加入5μL氯化钠(3.6μL)，然后加入EtOH(100μL)。混合物短暂涡旋，并在-20℃下孵育20分钟。然后将悬浮液以10000×g离心5分钟，弃去上清液，在真空下除去微量的EtOH，生成标记的化合物10(图4)。
实施例9
冬凌草甲素(2mg，0.0054mM)溶于1mL乙腈中，然后与双官能连接子II(2.6mg，0.011mM)混合。混合物在室温下用紫外光(365nm)照射3小时，产生冬凌草甲素-连接子II缀合物，其包含至少五种异构化合物，MS(ESI(m/z)[M+H]+)为577.3(图5和图6)。
实施例10
将雷公藤红素(2mg，0.0044mM)溶解在1mL乙腈中，然后与双官能连接子II(2.1mg，0.009mM)混合。混合物在室温下用紫外光(365nm)照射3小时，生成雷公藤红素-连接子II缀合物，其包含至少三种异构化合物，MS(ESI(m/z)[M+H]+)为663.38(图7和图8)。
实施例11
将紫杉醇(2mg，0.0047mM)溶解在1mL乙腈中，然后与双官能连接子II(2.3mg，0.0094mM)混合。混合物在室温下用紫外光(365nm)照射3小时，生成紫杉醇-连接子II缀合物，其包含至少三种异构化合物，MS(ESI(m/z)[M+H]+)为1066.46(图9和图10)。
实施例12
将雷酚内酯(2mg，0.0064mM)溶解在1mL乙腈中，然后与双官能连接子II(3.1mg，0.0128mM)混合。混合物在室温下用紫外光(365nm)照射3小时，生成雷酚内酯-连接子II缀合物(图11和图12)。
实施例13
将美登醇(4mg，0.0071mM)溶解在1mL乙腈中，然后与双官能连接子II(3.4mg，0.0142mM)混合。混合物在室温下用紫外光(365nm)照射3小时，生成美登醇-连接子II缀合物，其包含至少两种异构化合物，MS(ESI(m/z)[M+H]+)为777.3(图13和图14)。
实施例14
将枞酸(2mg，0.0066mM)溶解在1mL乙腈中，然后与双官能连接子II(3.1mg，0.013mM)混合。混合物在室温下用紫外光(365nm)照射3小时。生成了两种类型的缀合物(脱氢枞酸连接子II缀合物(A)，MS(ESI(m/z)[M+H]+)为513.37，和氢化枞酸连接子II缀合物(B)，MS(ESI(m/z)[M+H]+)为517.40)。(图15和图16)。
实施例15
与寡核苷酸的反应：使用连接酶将化合物6和7与寡核苷酸连接。将头部-DNA缀合物4与光敏连接子2混合。混合物用紫外光(365nm)照射2小时。用寡核苷酸连接产物，涂抹条带，表明产生了多个连接产物(图17)。
实施例16
可用作标记的寡核苷酸包括单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、化学修饰的寡核苷酸和一些功能物种如反义RNA(asRNA)。
用于标记的几个寡核苷酸例子的序列列举如下：
ssDNA:5’-AAATAAATT，5’氨基修饰
ssRNA:5’-AUUUAUUUU，5’氨基修饰
ssDNA:5’-AAATAAATT，3’氨基修饰
ssRNA:5’-AUUUAUUUU，3’氨基修饰
ssDNA:5’-AAATAAATT，5’氨基用硫代磷酸酯键修饰(耐核酸酶降解)
ssDNA:5’-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG，5’氨基用硫代磷酸酯键修饰(耐核酸酶降解)
实施例17
DNA编码的化学库(DELs)通过组合优化将遗传学和化学合成的力量联系起来。通过组合化学，DELs可以发展为前所未有的数十亿到数万亿的规模，为生物和药物研究提供丰富的化学多样性。虽然在大多数情况下，在分子水平上，多样性仅限于DNA兼容化学反应的可用构件，但现代化学方法正被用来增加多样性。为了充分利用DEL方法，将遗传学的力量直接与化学结构联系起来，将在有限的化学世界中提供更大的多样性。随着生物进化，天然产物已经进化出令人难以置信的结构多样性。
以下提供了一个使用天然产品、FDA批准的药物、临床试验中的化合物和源自组合合成的化合物的示例性DNA编码化学库(DEL)，其根据本文所述的方法制备。在下面的例子中，挥发性双官能连接子(连接子IV)允许在自动并行合成器上进行“一锅”反应。
在一些实施方案中，本文描述的方法表现出以下标准：(1)位点非选择性，(2)化学非选择性，(3)生物相容性(例如，DNA相容)，和(4)与小反应规模相容(例如，微克)。传统的化学选择性反应是在一个特定的原子上修饰天然产物，由于空间屏蔽作用，可能会遗漏调节靶蛋白功能的潜在结合口袋。设计了一种后期修饰方法，利用化学反应和位点非选择性反应来靶向所有可接近的原子。这种后期修饰产生了一组具有独特DNA标签的异构体，为靶蛋白提供了多种空间可及性。
一般方法
除非另有说明，所有市售有机化合物和DNA头部(HP-NH2,5’-/5phos/GAGTCA/iSp9/iUniAmM/iSp9/TGACTCCC-3’)均从商业来源获得。除非另有说明，所有商业试剂和溶剂都是在没有额外纯化的情况下使用的。NMR光谱记录在Bruker AM-500NMR光谱仪上。化学位移报告为δ(ppm)，耦合常数报告为J(赫兹)。四甲基硅烷(TMS)用作1H NMR的内部参考，CDCl3用作13C NMR(δ77.0ppm)的内部参考。质谱记录在AB SCIEX 4600质谱仪或waters SQD2质谱仪上。连接子IV根据实施例4制备。
连接子筛选
对本文所述的各种双官能连接子进行了检测，以开发一种用于天然产物的高通量DNA注释策略。连接子上官能团的反应性是正交的，其中一个末端被设计成用于化学反应和位点非选择性反应，另一个被用于通过铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)缀合DNA标签，如本文所述。
使用冬凌草甲素作为模型底物检测示例性双功能连接子(表1A)，将冬凌草甲素(1当量)和双官能连接子(2当量)溶解在乙腈中，并在室温下经紫外线照射。
如表1A中所示，含3-(三氟甲基)-3H-二氮杂茚-3-基的连接子III生成了三种异构体，产率为20％(基于冬凌草甲素的浓度)。含3-甲基-3H-二氮杂茚-3-基的连接子II生成了6种标记的冬凌草甲素异构体，标记效率为69％，其中两种异构体具有一种用两个连接子II分子标记的冬凌草甲素。含3-甲基-3H-重氮甲烷-3-基的连接子3-(2-叠氮基乙基)-3-甲基-3H-重氮甲烷(连接子IV)产生一种异构体。如1H-NMR所示，在连接子IV和冬凌草甲素之间的反应完成后，通过真空除去未反应的连接子IV和/或连接子IV的副产物。
表1A.不同卡宾或自由基生成系统的标记效率
a向0.5mL(0.1mM)冬凌草甲素在无水乙腈中的溶液中加入1mL(0.1mM)对应的双官能连接子，所得混合物用365nm灯照射30分钟，然后用LC-MS分析混合物。
b用一个连接子标记的冬凌草甲素。
c用两个连接子标记的冬凌草甲素。
d未反应。
如表1B所示，通过连接子IV与浓度高达5当量的2,4-二羟基苯乙酮的反应，连接子IV不与叠氮化物官能团反应。如图18所示，反应完成后，如1H-NMR所示，未反应的连接子IV和/或连接子IV的副产物很容易通过真空除去(连接子IV-2,4-二羟基苯乙酮缀合物用箭头表示)。结果表明，微量的剩余连接子IV对基于CuAAC的点击化学和酶促DNA连接的后续DNA连接没有干扰。
表1B.连接子IV的标记效率
a向0.5mL(0.1mM)2，4-二羟基苯乙酮在无水乙腈中的溶液中加入对应的双官能连接剂IV，所得混合物用365nm紫外灯照射30分钟，然后用LC-MS和1H NMR分析混合物。
b用一个连接子IV标记的2,4-二羟基苯乙酮。
c用两个连接子IV标记的2,4-二羟基苯乙酮。
使用连接子IV制备表2所示的连接子缀合物。
表2
a由LC测定的产率。
b由LC和MS-MS测定的标记异构体。
方案2显示了通过由DMTMM促进的用于与药物和天然产物反应的酰胺偶联化学，由丙炔-(PEG)5-CH2CH2COOH制备丙炔-HP-DNA。
方案2：丙炔-HP-DNA
在方案2中，在pH 9.5的硼酸钠缓冲液(250mM)中加入HP-DNA(1mM)，加入40当量的丙炔-(PEG)5-CH2CH2COOH(200mM，在DMF中)，然后加入50当量的二甲基甲酰胺(200mM，在水中)。在室温下搅拌18小时后，向反应混合物中加入5mL氯化钠溶液(10％体积)和冷乙醇(2.5倍体积，乙醇储存在-20℃)。混合物在-80℃下储存30分钟以上。之后，混合物在微型离心机中以12000转/分钟的速度在4℃下离心15分钟。除去上清液，将沉淀溶解在水中至最终浓度为1mM，无需进一步纯化即可直接用于点击偶联反应的下一步。计算的精确质量：5267.07。实测质量：5266.46。
使用双官能连接子IV标记各种药物的一般程序如下方案3所示。在方案3中，NP是药物或天然产物，丙炔-HP-DNA如上所述。表3和表4中的化合物是使用这些方法制备的。
方案3：连接子-IV缀合物和标记化合物的合成
简而言之，将CH3CN(100μL)加入到96孔板的每个孔中，每个孔中含有化合物(1μmol)和连接子IV(5μmol)。将该板在室温下于UV下以365nm的波长照射30分钟。通过LC-MS测定产物和收率。将CH3CN在真空中蒸发过夜，生成对应的NP-N3。然后，将化合物(NP-N3)溶于DMSO(30μL)，并与丙炔-HP-DNA(10μL，1mM在水中)、THPTA(10μL，80mM在DMSO中)、CuSO4·5H2O(10μL，80mM在水中)和抗坏血酸钠(20μL，80mM在水中)混合。将所得混合物在室温下振荡过夜，反应结束后，通过LC-MS测定产物和产率进行。之后，加入清除剂二乙基二硫代氨基甲酸钠(12L，160mM在水中)。然后收集所有的HP-DNA缀合化合物(NP-HP-DNA)，并加入5M氯化钠溶液(10％体积)和冷乙醇(2.5倍体积，乙醇储存在-20℃)。混合物在-80℃的冰箱中储存30分钟以上。混合物在微型离心机中以12000转/分钟的速度在4℃下离心15分钟。除去上清液，将沉淀溶解在水中。
如本文所述，在96孔板中使用“一锅法”逐步合成进行DNA编码。表3和表4中所示的药物-连接子ⅳ缀合物和标记化合物是根据上述程序制备的。总共获得了110个DNA编码的终产物(表4)。对于具有多个官能团(包括羟基、羧基、胺基等中的一个或多个)的化合物(如编号为17、25、74、82、108、91、99和114的化合物)，如在不同保留时间下显示相同分子量的HPLC馏分所示，DNA缀合容易发生在多个位点，而对于具有单个官能团的化合物，通常在单个位点观察到DNA缀合。
表3
表4
实施例18：组合合成结构
为了利用DNA编码的化学库(DEL)可以在单个试管中筛选的事实，将通过后期修饰反应合成的选定DELs整合到DEL库格式中进行筛选。为此，准备了后期注释的DEL(包括中药天然产物(TCMs)、FDA批准的药物和临床试验中的对照化合物)和大小为104的小型组合DEL库，然后以1:10的比例(单一化合物浓度)进行组合。使用两种已知的碳酸酐酶II(CAII)抑制剂，卡西尼特和布林佐胺，测试了不同混合比例对后期标记DELs富集的影响。首先对这两种CAII抑制剂进行DNA编码，并以0.05pM、0.5pM和5pM的最终浓度加入到104组合DEL(0.5pM/分子)中。标记为DELs(1:10的比例)的后期0.05pM浓度的混合显示布林佐胺和卡西尼特的最高富集度分别为300倍和410倍(表5)。
表5：碳酸酐酶结合物选择的富集倍数
通过定量聚合酶链式反应(qPCR)对加标的天然产物-DNA缀合物的量进行定量，然后以指定的比例与DEL库混合。先导DEL库包含12696个化合物，由6个胺-(PEG)n-酸(构件1)、46个氨基酸(构件2)和46个羧酸(构件3)偶联而成。
DNA编码框架是根据文献中的头部和其他条形码的结构设计的。头部是DNA头部(5’-/5phos/GATCCA/ISp9/iUniAmm/ISp9/TGACCCC-3’)。在连接缓冲液和T4 DNA连接酶(NEB,Cat.#Z1811S)中酶促连接DNA酸寡核苷酸-条形码。将反应混合物在16℃孵育16小时，并通过LCMS和凝胶分析。测序引物为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACG和5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGTGATGTGACTGGAGTTC，总体方案如图19所示。
His-标签融合重组人PARP-1(Sino Biological,Cat.#11040-H08B)和人HSP70(Sino Biological,Cat.#11660-H07H)从商业来源获得。这两种可溶性蛋白的淘选过程相同。将5μg靶蛋白与镍磁珠(GenScript,Cat.#L00295)，5nM DEL库和10μg/mL鲑鱼精DNA进行混合。最终体积调整至100μL。混合物在室温下旋转1.5小时。用含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲盐水(PBST)洗涤5次后，在50μL洗脱缓冲液(20mM Tris,pH 7.4,100mM NaCl)中，在95℃加热10min，洗脱靶蛋白结合化学-DNA缀合物。用Takara PrimerSTAR Max DNA聚合酶(Takara,Cat.#R045A)通过PCR扩增洗脱的DEL化合物。然后用Hieff NGSTM smarter DNA清洁珠(Yeasen,Cat.#12600ES03)去除多余的引物，并在4％DNA琼脂糖凝胶上进行评估。使用Illumina HiSeq X10分析仪对扩增产物进行高通量测序。表6总结了不同靶的寡核苷酸标签的亲和选择和PCR扩增。
表6.
1.Sino Biological,Cat.#11660-H07H
2.Sino Biological,Cat.#11040-H08B
3.GenScript,Cat.#L00295
4.Takara,Cat.#R045A
组合化学文库由三个构件子库构建而成，其中第一、第二和第三个构件子库分别包含6个、46个和46个化学构件。每个构件都由10个碱基对(bp)的DNA序列编码。天然产物由30-bp的DNA序列编码，长度与组合化学库的DNA编码相同。这三个子库之间所有可能的组合(组合化合物)都是由一个内部java程序生成的，该程序生成了一个包含12696个DNA编码序列的参考DNA编码库。测序后，使用CLC基因组工作台版本12(Qiagen)修剪DNA编码序列周围的Illumina衔接子。在3轮“裂池”迭代中，左侧的DNA编码序列与构件的3个DNA序列相对应，长度为30bp。对于每个样本，DNA编码序列被映射到参考DNA编码化合物库。映射中不允许错配。计算不同样品中所有化合物的编码序列。计算给定样品中所有化合物的总读数。每个单独化合物的读数除以总读数，再乘以常数100000。
归一化计数化合物M，样品A＝次数化合物M，样品A/(总数样品A)*100000
计算选择后库中每种化合物与参考库相比的倍数变化。例如，如果将样品A和参考库进行比较，对于化合物M的倍数变化，计算如下：
倍数变化化合物M＝归一化计数化合物M，样品A/归一化计数化合物M，参考
nDEL筛选的命中标准考虑了标准化富集倍数值(y轴)和深度测序读数计数(x轴)。读取计数小于10的化合物被认为是不可靠的，因此在目标筛选前，应立即将其从DEL中清除。对于每个DEL库，在不存在靶蛋白的情况下记录基线富集倍数，并且可以计算库中每个DEL化合物的归一化富集倍数值。命中鉴定的临界值是基于对高度多样化的数据总体的简化统计分析，这是整个库的富集倍数平均值(μ)加3倍标准偏差(σ)的总和。富集倍数大于μ+3σ的任何DEL化合物均视为命中。
PARP-1酶分析
按照提供的方案进行基于PARP-1自动糖基化的分析(BPS,Cat.#80580)。化合物溶解在DMSO中。通过将蛋白质与取决于不同化合物(DMSO在所有样品中的最终浓度为1％)的不同范围的化合物在室温下预孵育15分钟，以建立一式三份的实验反应。然后通过二倍稀释到底物包被的检测板中，并在室温下孵育1小时，来进行ADP-核糖基化反应。使用酶标仪(EnVision，PerkinElmer)检测化学发光。所得数据用GraphPad拟合到单部位剂量反应模型，提取实验IC50值。报告的误差代表每个实验的拟合参数的标准误差。
分子建模
使用计算机上的分子对接来研究木犀草素在PARP1的催化结构域(残基660至1011)上的可能结合模式。AutoDock工具(4.2.6版)用于PARP1(PDB 4pjt)和配体准备，以生成pdbqt文件。从PARP1 PDB文件中删除水分子和抑制剂，加入极性氢和Gasteiger部分电荷。x、y、z轴上60×60×40个点的网格和的空间位于抑制剂结合位点的中心。总共进行了200次运行，最多进行了2500000次能量评估。选择结合自由能最低的木犀草素结合模式进行进一步的分子动力学模拟。
木犀草素分子动力学模拟的参数和拓扑结构通过ANTECHAMBER软件和ACPYPE脚本使用半经验量子化学程序(SQM)和广义琥珀力场(GAFF)导出。对木犀草素-PARP1复合物进行短暂的能量最小化，然后进行100-ns分子动力学模拟，以放松相互作用并稳定复合物的结构。使用Gromacs4.6.7软件包和Amber14ffSB力场进行模拟。该体系用含有Cl-和K+的全原子TIP3P水溶解，浓度为0.13M，以模拟生理离子强度。温度T和压力P分别在300K和1个大气压下保持恒定，使用Berendsen恒温器和恒压器。对于长程静电相互作用，使用快速平滑的Particle-Mesh Ewald求和，直接相互作用的截止值为1.0nm。据认为，如果在分子动力学轨迹上，PARP-1残基与亮托林的距离在90％以上的时间内低于3.0埃的截止值，则它们会稳定地相互作用。这些残基列于表7中。
表7.在分子动力学模拟轨迹中与木犀草素相互作用的PARP-1残基。
抗热休克蛋白70kDa(HSP70)和聚[ADP-核糖]聚合酶1(PARP1)的nDEL的筛选
在nDEL筛选中使用了两种具有不同细胞位置和生物物理特性的靶蛋白。这些包括细胞质中的HSP70和细胞核中的PARP1，它们各自对小分子配体具有不同的亲和力。这些靶点的已知功能性结合物作为内部阳性对照包含在nDEL中，例如，用于HSP70的冬凌草甲素和用于PARP-1的奥拉帕尼的衍生物(F001、F002、F003和F006)。为了解决nDEL中DNA条形码的不均匀分布，首先在不存在靶蛋白但存在固定基质珠的情况下进行nDEL的空白筛选，然后进行深度测序以建立库中条形码的基线分布。使用Decurtins等人(Nat Protoc.2016；11(4):764-80)描述的方法分析所有筛选数据。根据每种nDEL化合物的测序计数，对它们的相应DNA序列进行计数。富集倍数计算为靶蛋白存在和不存在时归一化测序计数的比率。下表显示了富集倍数。
表8A：HSP70结合物选择的富集倍数
表8B：PARP-1结合剂选择的富集倍数
药物(NP)
倍数变化
F001
4.38
F002
3.69
冬凌草甲素-A1
3.28
F006
3.21
白花丹素
2.97
东莨菪素
2.82
(-)-表儿茶素没食子酸酯
2.81
甘草黄苷
2.66
表没食子儿茶素
2.53
可可碱
2.42
F003
2.34
金丝桃苷
2.25
盐酸药根碱
2.23
龙胆酸
2.21
柚皮苷
2.17
木犀草素
2.17
瑞香素
2.17
辛弗林
2.17
盐酸小檗胺
2.15
噻氨酯哒唑
2.06
药根碱
2.04
茜素
2.02
秦皮素
2.01
如图20所示，将nDEL的筛选指纹图谱绘制为富集倍数与归一化测序计数的关系。使用已知的结合物作为内部参考，基于阳性对照化合物的富集倍数，鉴定出nDEL筛选的命中率。
针对纯化的人HSP70和PARP-1蛋白进行nDEL筛选。对亲和力捕获的nDEL进行深度测序和解码分析。结果总结在表9中。所有对照化合物都在nDEL筛选中富集，命中率在0.15％至0.47％之间(图20)。HSP70的高命中率可能与HSP70蛋白的粘性有关。收集前两个部分并用两个独特的DNA序列N055和N056编码。值得注意的是，ordorion标记的化合物N055和N056的两种立体异构体分别富集了5.3倍和2.3倍(图20(a)和表8A)，表明HSP70对不同立体异构体的结构偏好。
表9.DEL筛选总结
靶点名称
命中(数量)
命中率
HSP70
60
0.47％
PARP1
34
0.27％
在PARP-1筛选中，富集了34种nDELs(图20(b))，其中4种被证实包括阳性对照化合物(图21)。使用nDEL中已知化合物的内部对照似乎大大有助于选择真正的阳性命中。有趣的是，在富集的化学物质中聚集了结构相似的黄酮类化合物，特别是中药化合物、木犀草素及其糖基化类似物柚皮苷和金丝桃苷。
nDEL命中PARP-1酶抑制作用的生化特征
PARP-1是癌症治疗中的一个有效靶点，可催化ADP-核糖片段从NAD+迅速转移至受体蛋白，其本身导致蛋白质结合的线性和分支的同型ADP-核糖聚合物的形成，以响应DNA损伤和修复的细胞信号。在剪切的DNA存在下，基于PARP-1的自动核糖基化来测量酶活性。
富集的nDELs的抑制活性通过PARP-1自动核糖基化分析来表征。阳性对照奥拉帕尼的衍生物F003显示出对PARP-1的有效抑制作用，IC50值为2.5nM(图22(b))。中药nDEL木犀草素可抑制PARP-1的酶活性，IC50值为7.5μM(图22(a))。为了理解PARP-1和木犀草素之间的相互作用，进行了一系列基于分子模拟的计算机分析。通过分子对接发现，在最低自由能结合模式下，木犀草素占据了PARP-1的催化域。为了进一步评估这种模式的稳定性和理解相互作用的分子细节，从预测的对接模型开始，进行了100ns的分子动力学模拟。该复合物在模拟的时间窗内表现稳定，蛋白质中的几个残基与木犀草素在相当长的时间内相互作用。特别是D766、H862、Y896和E988在超过90％的模拟轨迹中保持与木犀草素的接触。由于G863、E988和D766残基的侧链形成了氢键，木犀草素在PARP-1的催化位点似乎是稳定的，这些残基也是NAD+结合的关键残基(图22(c))。
讨论
DELs是使用包括裂池合成在内的组合方法合成的，从根本上讲，这是一个迭代过程，需要在DNA存在下进行多次复杂的转化。具有高度复杂立体结构的化合物，如天然产物，通常不包括在DELs中，因为它们的合成需要更复杂的化学转化。随时间推移的自然选择与使用大量数字进行DELs选择的相对优势尚未确定。然而，目前的研究首次提供了一种在单个试管中同时研究两种系统的方法。在相同的环境条件下启用DEL筛选可以更深入地了解不同的DEL及其应用。此外，在nDELs中，靶蛋白的已知结合物或抑制剂可以作为内部对照，这大大提高了DEL筛选中的确认率和命中选择。重要的是，天然产品可能已经朝着一个目标进化，可能对其他目标没有用处。通过将靶点暴露于大量潜在配体中，nDELs的使用克服了这一限制。
本文所述方案的一个特殊特征是在DNA和有机化合物之间使用挥发性连接子。已经证明不完全的化学合成和不希望的副产物会影响DEL筛选(例如，过量的连接子可以与生物靶点反应)。挥发性连接子可以容易地除去未反应的连接子分子，使得多个反应可以在单个样品中进行，而无需考虑连接子的修饰。因此，后续分析不会受到连接子修饰的干扰。对于某些化合物，特别是那些只含C-H的化学物质，重氮甲烷的标记效率较低，因为卡宾插入许多天然产物的C-H键可能会有问题。新的后期修饰方法对于扩展nDEL方法是必要的。4-((三甲硅基)乙炔基)苯基氨基磺酸盐和7-叠氮基-1,1-二氟庚烷-1-亚磺酸钠生成的氮宾和碳自由基的C-H插入物显示出作为辅助工具的巨大前景。这些修饰也可以作为替代标记方法，以在具有单一官能团的化合物中产生额外的几何异构体。
尽管nDEL处于早期发展阶段，但数量有限的nDEL在不同类别靶点的命中鉴定方面已经显示出令人鼓舞的潜力。木犀草素作为PARP-1酶抑制剂的发现突出了nDELs的作用。木犀草素是一种天然的类黄酮，存在于许多水果和蔬菜中，如胡萝卜、西兰花、洋葱叶、欧芹、芹菜、甜椒和菊花。木犀草素也是传统中药中许多药材的活性成分，如金银花、菊花、生草(Herba unripe)、夏枯草、朝鲜蓟、紫苏、黄芩、紫花等。传统上，这些草药在复杂的配方中用作抗炎剂，以止咳、化痰和治疗疾病，如心血管疾病和肝炎。木犀草素因其对多种癌细胞类型的强效抗癌活性而得到广泛研究。更重要的是，更重要的是，它在逆转多重耐药性癌细胞(MDR)的生长中显示出功效。木犀草素通过细胞凋亡和细胞周期调节发挥其抗癌活性。有人建议将木犀草素用于多个分子靶标，例如JNK、NF-κB、IGF-1等。但是，对于任何提议的靶点，仍然缺乏与定义的结合口袋直接相互作用的证据。而且，列出的靶点之一或全部不能调和木犀草素的所有药理行为。多重药理是天然产物研究中常见的一种障碍，极大地限制了这些活性天然化合物的临床开发。通过nDEL筛选鉴定木犀草素的PARP-1，证明nDEl在天然产物多药生态学分析中的潜力。聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)与DNA结合，以响应细胞中由多种生物过程(包括DNA修复、复制、重组和基因重排)引起的瞬时和局部DNA链断裂。
作为临床证明的化疗靶点，PARP-1抑制在凋亡，细胞周期停滞等方面表现出与木犀草素类似的调节模式。PARP可能是木犀草素的关键靶点之一，木犀草素具有多种药理作用。nDELs具有整合数字、多样性和信息的潜力，在我们寻找生物医学问题的治疗和解决方案的努力中可能是无价的。
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