一种两面针组织培养快速繁殖方法
阅读说明：本技术 一种两面针组织培养快速繁殖方法 (Rapid propagation method for radix zanthoxyli tissue culture ) 是由 王继华 蔡时可 梅瑜 徐世强 周芳 顾艳 孙铭阳 李静宇 于 2020-11-23 设计创作，主要内容包括：本发明属于植物快速繁殖技术领域,具体涉及一种两面针组织培养快速繁殖方法,包括以下步骤：(1)外植体选取与消毒：(2)培养基的制备：制备改良MS培养基,然后在改良MS培养基的基础上分别制备不定芽诱导培养基、继代增殖培养基和无菌生根培养基；(3)不定芽诱导培养：将消毒外植体的芽接种于不定芽诱导培养基中进行诱导培养,得到两面针不定芽；(4)继代增殖；(5)无菌生根。本发明两面针组织培养快速繁殖方法,可以快速培养出两面针种苗,能保持母本的优良性状；能有效提高繁殖系数和成苗率,且培养周期短,并且能定向培育单一性别植株,便于标准化种植,种植效益大大提高。(The invention belongs to the technical field of plant rapid propagation, and particularly relates to a method for culturing and rapidly propagating zanthoxylum nitidum tissues, which comprises the following steps: (1) selecting and disinfecting explants: (2) preparation of a culture medium: preparing an improved MS culture medium, and then respectively preparing an adventitious bud induction culture medium, a subculture multiplication culture medium and a sterile rooting culture medium on the basis of the improved MS culture medium; (3) adventitious bud induction culture: carrying out induction culture on the bud of the sterilized explant in an adventitious bud induction culture medium to obtain adventitious buds of the Zanthoxylum nitidum; (4) subculturing and proliferating; (5) and (5) sterile rooting. The method for rapid propagation of zanthoxylum nitidum tissue culture can rapidly culture zanthoxylum nitidum seedlings and can keep the excellent characters of female parents; the method can effectively improve the propagation coefficient and the seedling rate, has short culture period, can directionally culture single-sex plants, is convenient for standardized planting, and greatly improves the planting benefit.)
技术领域
本发明属于植物快速繁殖技术领域，具体涉及一种两面针组织培养快速繁殖方法。
背景技术
两面针(Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.)属芸香科花椒属木质藤本植物，别称红倒钩簕、两背针、双面针等，其根是我国传统的中药材，具有活血、化瘀、祛风、消肿和止痛等功效,临床用于治疗跌打损伤、风湿痹痛、胃痛、牙痛和毒蛇咬伤等；外用则可治汤火烫伤。其主要分布于我国华南地区，广西、广东、云南、福建和台湾等地区,多生长在山野坡地灌木丛中。通过国内外学者对两面针的本草考证，在《岭南采药录》、《神农本草经》和《中华人民共和国药典》等重要中草药著作和法定标准均有收载。两面针的化学成分较复杂,主要含有生物碱类、木脂素类、黄酮类和甾醇类等化合物，其中单体有效成分如两面针碱具有解痉镇痛、抗炎、抗菌、抗癌等活性，用于解痉镇痛，开发生产出骨刺片、跌打万花油等药品和两面针中药牙膏等日用品。市场对两面针的需求巨大，长期以来都以自然挖掘为主，对两面针野生资源带来巨大压力和破坏,急需开展两面针的人工驯化种植。然而，目前两面针的育种和种苗繁育还相对落后，生产上大多直接采集野外种子进行育苗种植，由于野生两面针种质资源遗传多样性较高，居群内变异系数大，后代往往参差不齐。两面针雄株在生产上颇受种植者的喜爱，但是种子繁殖在苗期也无法判断性别，严重影响后期标准化种植和品质的保障。
植物组织培养技术能够利用侧芽，茎段等无性快速繁殖，保留母本的优良性状，规模培育大量生长一致的种苗，缓解传统生产上的种苗繁殖率低下和无法定向培育雄株的问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种两面针组织培养快速繁殖方法，以解决现有两面针种植技术繁殖系数较低，培养周期长的不足。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种两面针组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体选取与消毒：选取两面针的幼嫩茎作为外植体进行消毒处理，得到消毒外植体；
(2)培养基的制备：制备改良MS培养基，然后在改良MS培养基的基础上分别制备不定芽诱导培养基、继代增殖培养基和无菌生根培养基；所述改良MS培养基配方为在MS培养基中降低硝酸铵的用量，达到550-825mg/L，其他组分均无变化；
(3)不定芽诱导培养：将消毒外植体的芽接种于不定芽诱导培养基中进行诱导培养，得到两面针不定芽；
(4)继代增殖：将两面针不定芽接入继代增殖培养基中进行继代增殖培养，得到两面针丛苗；
(5)无菌生根：将两面针从苗接入无菌生根培养基中进行生根培养，得到两面针幼苗，然后炼苗、移栽。
本发明两面针组织培养快速繁殖方法采用系统选育两面针优良单株，利用组培技术进行工厂化育苗，既可以在短期内提供大量的优质种苗，缓解当前市场过渡挖掘对野生资源的破坏，也能提供均一的种苗给种植户，保障种苗的周年供应市场。
本发明中，消毒处理为先采用酒精浸泡，再放入含有吐温-20的升汞溶液消毒。
进一步地，所述酒精浸泡是采用70％酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗；所述升汞溶液消毒是采用含有0.01％吐温-20的质量百分数为0.1-0.3％的升汞溶液消毒15min，再用无菌水洗涤。
本发明可以做以下改进，所述不定芽诱导培养基配方为在所述改良MS培养基上添加6-BA和IAA；在不定芽诱导培养基中6-BA的浓度为1-3mg/L，IAA的浓度为0.1-0.5mg/L。
优选地，在所述用于不定芽诱导的培养基中6-BA的浓度为2mg/L，IAA的浓度为0.5mg/L。
本发明中，消毒外植体的芽是两面针茎段的腋芽。
本发明中，所述诱导培养条件是温度为28±2℃，相对湿度为85±10％，光照时间为12小时/天，光照强度为600-8001x；培养时间为4-6周。
本发明可以进一步做以下改进，所述继代增殖培养培养基配方为在所述改良MS培养基上添加6-BA和IAA；在继代增殖培养基中6-BA的浓度为1-3mg/L，IAA的浓度为0.1-0.2mg/L。
优选地，在所述用于继代增殖的培养基中6-BA的浓度为2mg/L，IAA的浓度为0.2mg/L。
本发明中，所述继代增殖培养条件是温度为28±2℃，湿度为85±10％，光照时间为12小时/天，光照强度为600-10001x；培养时间为4周。
本发明还可以进一步改进，所述无菌生根培养基配方为在所述改良MS培养基的基础上添加NAA和IBA，在生根培养基中NAA的浓度为0.5-1mg/L，IBA的浓度为0.2-0.5mg/L。
优选地，在所述用于无菌生根的培养基中NAA的浓度为1mg/L，IBA的浓度为0.5mg/L。
本发明中，所述生根培养条件是温度为28±2℃，湿度为85±10％，光照时间为10-15小时/天，光照强度为600-8001x；培养时间为30-50天。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明两面针组织培养快速繁殖方法，可以快速培养出两面针种苗，能保持母本的优良性状；能有效提高繁殖系数和成苗率，且培养周期短，并且能定向培育单一性别植株，便于标准化种植，种植效益大大提高，能够有效解决当前两面针严重供应不足的问题。
(2)本发明根据两面针种苗的繁育和生长特性，在MS培养基的基础上配置出适合两面针组织培养的用于不定芽诱导的培养基、用于继代增殖的培养基和用于无菌生根的培养基。
(3)本发明两面针培养快速繁殖方法，生产的雄性两面针种苗生长整齐一致，便于后期管理，降低生产成本，同时保障种苗的一致，提高种植和销售者的收入，促进两面针产业的发展。
说明书附图
图1为本发明实施例1培养得到的两面针组培苗；
图2为本发明中不同浓度6-BA对两面针增殖系数的影响对比图；
图3为本发明MS培养基和改良MS培养对植株生长的影响对比图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。
实施例1
一种两面针组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体选取与消毒：
①选取生长健康，无病虫害的雄性两面针的幼嫩枝条作为外植体；
②去除多余的叶片和刺，切成1-2cm茎段，用自来水冲洗枝条表面的污垢，再用纸巾吸干；
③在超净工作台上，先用70％酒精浸泡15s，再用无菌水冲洗5min；
④再用含有0.01％吐温-20的质量百分比为0.2％的升汞溶液消毒10min，最后用无菌水洗涤3次，每次5min，得到消毒外植体；
(2)改良MS培养基的制备：
改良MS培养基的配方为：降低硝酸铵的用量，达到825mg/L，其他组分均无变化其他组分均无变化。
(3)无菌外植体获得与不定芽诱导：
将步骤(1)得到的消毒外植体，在超净工作台上，用无菌手术刀片切下两端与升汞溶液接触的地方，然后将茎段的腋芽按照生物学顶端在上的方向，将生物学下端插入不定芽诱导的培养基，置于人工气候箱中培养6周，诱导得到两面针不定芽；诱导培养条件如下：温度为28±2℃，相对湿度为85±10％，光照时间为12小时/天，光照强度为7001x；所述用于不定芽诱导的培养基的配方为：在所述改良MS培养基上添加6-BA和IAA；其中6-BA的浓度为2mg/L，IAA的浓度为0.5mg/L；
(4)继代增殖：
将步骤(3)得到的两面针不定芽从外植体上切下来，并切掉叶片，接入继代增殖的培养基，进行继代培养4周，得到两面针丛芽；继代增殖培养条件如下：温度为28±2℃，湿度为85±10％，光照时间为12小时/天，光照强度为8001x；所述用于继代增殖的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA和IAA，其中6-BA的浓度为2mg/L，IAA为0.2mg/L；
(5)无菌生根：
待步骤(4)获得的两面针从苗长至2-3cm高时，进行诱导生根。切下单株，接种于生根培养基中，进行生根培养40天，得到两面针幼苗；生根培养条件如下：培养温度为28±2℃，湿度为85±10％％，光照时间为13小时/天，光照强度为7001x；所述用于无菌生根的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加NAA和IBA,浓度分别为1mg/L和0.5mg/L；
步骤(5)中两面针幼苗生长至根长2-4cm、苗高5-8cm后，见图1，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养6天，然后洗净根部培养基，种植在直径为5cm，装有泥炭土育苗袋中，置于塑料大棚，保持基质的湿润，代植株成活后移植于大田。
实施例2
一种两面针组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体选取与消毒：
①选取生长健康的两面针的幼嫩茎作为外植体；
②去除多余的叶片，用自来水冲洗枝条表面的污垢，再用纸巾吸干；
③在超净工作台上，先用70％酒精浸泡25s，再用无菌水冲洗1次，3min；
④再用含有0.01％吐温-20的质量百分数为0.3％的升汞溶液,消毒15min，最后用无菌水洗涤5次，每次3min，得到消毒外植体；
(2)改良MS培养基的制备：
改良MS培养基的配方为：降低硝酸铵的用量，达到825mg/L，其他组分均无变化。
(3)无菌外植体获得与不定芽诱导：
将步骤(1)得到的消毒外植体，在超净工作台上，用无菌手术刀片切下两端与升汞溶液接触的地方，然后将茎段的腋芽按照生物学顶端在上的方向，将生物学下端插入不定芽诱导的培养基，置于人工气候箱中培养4周，诱导得到两面针不定芽；诱导培养条件如下：温度为28±2℃，相对湿度为85±10％，光照时间为12小时/天，光照强度为8001x；所述用于不定芽诱导的培养基的配方为：在所述改良MS培养基上添加6-BA和IAA；其中6-BA的浓度为1mg/L，IAA的浓度为0.1mg/L；
(4)继代增殖：
将步骤(3)得到的两面针不定芽从外植体上切下来，并切掉叶片，接入继代增殖的培养基，进行继代培养4周，得到两面针丛芽；继代增殖培养条件如下：温度为28±2℃，湿度为85±10％，光照时间为12小时/天，光照强度为9001x；所述用于继代增殖的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA和IAA，其中6-BA的浓度为1mg/L，IAA为0.1mg/L；
(5)无菌生根：
待步骤(4)获得的两面针从苗长至2-3cm高时，进行诱导生根。切下单株，接种于生根培养基中，进行生根培养42天，得到两面针幼苗；生根培养条件如下：培养温度为28±2℃，湿度为85±10％％，光照时间为14小时/天，光照强度为7001x；所述用于无菌生根的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加NAA和IBA,浓度分别为0.5mg/L和0.5mg/L；
步骤(5)中两面针幼苗生长至根长1-2cm、苗高5-8cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养7天，然后洗净根部培养基，种植在直径为5cm，装有泥炭土育苗袋中，置于塑料大棚，保持基质的湿润，代植株成活后移植于大田。
实施例3
一种两面针组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体选取与消毒：
①选取生长健康的两面针的幼嫩茎作为外植体；
②去除多余的叶片，用自来水冲洗枝条表面的污垢，再用纸巾吸干；
③在超净工作台上，先用70％酒精浸泡20s，再用无菌水冲洗1次，3min；
④再用含有0.01％吐温-20的质量百分数为0.1％的升汞溶液消毒15min，最后用无菌水洗涤5次，每次3min，得到消毒外植体；
(2)改良MS培养基的制备：
改良MS培养基的配方为：降低硝酸铵的用量，达到825mg/L，其他组分均无变化。
(3)无菌外植体获得与不定芽诱导：
将步骤(1)得到的消毒外植体，在超净工作台上，用无菌手术刀片切下两端与升汞溶液接触的地方，然后将茎段的腋芽按照生物学顶端在上的方向，将生物学下端插入不定芽诱导的培养基，置于人工气候箱中培养6周，诱导得到两面针不定芽；诱导培养条件如下：温度为28±2℃，相对湿度为85±10％，光照时间为12小时/天，光照强度为6501x；所述用于不定芽诱导的培养基的配方为：在所述改良MS培养基上添加6-BA和IAA；其中6-BA的浓度为3mg/L，IAA的浓度为0.3mg/L；
(4)继代增殖：
将步骤(3)得到的两面针不定芽从外植体上切下来，并切掉叶片，接入继代增殖的培养基，进行继代培养4周，得到两面针丛芽；继代增殖培养条件如下：温度为28±2℃，湿度为85±10％，光照时间为12小时/天，光照强度为9001x；所述用于继代增殖的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA和IAA，其中6-BA的浓度为3mg/L，IAA为0.2mg/L；
(5)无菌生根：
待步骤(4)获得的两面针从苗长至2-3cm高时，进行诱导生根。切下单株，接种于生根培养基中，进行生根培养36天，得到两面针幼苗；生根培养条件如下：培养温度为28±2℃，湿度为85±10％％，光照时间为14小时/天，光照强度为8001x；所述用于无菌生根的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加NAA和IBA，浓度分别为0.5mg/L和0.5mg/L；
步骤(5)中两面针幼苗生长至根长1-2cm、苗高5-8cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养7天，然后洗净根部培养基，种植在直径为5cm，装有泥炭土育苗袋中，置于塑料大棚，保持基质的湿润，代植株成活后移植于大田。
6-BA和培养基对两面针生长的影响实验
1、不同浓度6-BA对两面针增殖系数的影响
以实施例1的工艺为基础，仅改变6-BA的浓度，分别增设6-BA浓度为1mg/L和3mg/L进行培养，培育结果如图2所示，从左至右6-BA的浓度分别为1、2、3mg/L，繁殖系数为2.32、3.84、4.56。
2、改良MS培养基对植株生长的影响
以实施例1的工艺为基础，增设MS培养基的对照组进行培养，培育结果如图3所示，从左至右分别是改良MS培养基、MS培养基。
以上实施实例对本发明不同的实施过程进行了详细的阐述，但是本发明的实施方式并不仅限于此，所属技术领域的普通技术人员依据本发明中公开的内容，均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。
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