一种颗粒稳定的氧微气泡在制备改善肿瘤缺氧微环境的药物或试剂中的应用
阅读说明：本技术 一种颗粒稳定的氧微气泡在制备改善肿瘤缺氧微环境的药物或试剂中的应用 (Application of oxygen microbubbles with stable particles in preparation of drugs or reagents for improving tumor hypoxia microenvironment ) 是由 陈东 盛剑鹏 梁廷波 吴将超 孙竹 翟小威 吴柏衡 于 2020-12-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种颗粒稳定的氧微气泡在制备改善肿瘤缺氧微环境的药物或试剂中的应用。通过将氧微气泡制备成药物或试剂,应用时可直接注射到肿瘤中心,从而高效改善肿瘤缺氧环境,联合化疗药物,可以有效提高肿瘤治疗效果。进一步的,本发明采用聚多巴胺纳米颗粒稳定的微气泡载氧,氧气通过自由扩散的方式进入环境,根据环境的缺氧程度可以被动调节氧微气泡释放氧气的速率。本发明体外细胞培养证实氧气微气泡能有效改善缺氧微环境；体内实验证明,在小鼠体内注射氧气微气泡可以有效抑制肿瘤生长,达到很好的治疗效果。(The invention discloses application of oxygen microbubbles with stable particles in preparation of a medicine or a reagent for improving a tumor hypoxia microenvironment. The oxygen microbubbles are prepared into the medicine or the reagent, and can be directly injected into the center of the tumor during application, so that the tumor hypoxia environment is efficiently improved, and the treatment effect of the tumor can be effectively improved by combining the oxygen microbubbles with chemotherapeutic drugs. Furthermore, microbubbles with stable polydopamine nanoparticles are used for carrying oxygen, oxygen enters the environment in a free diffusion mode, and the oxygen microbubble oxygen release rate can be passively adjusted according to the oxygen deficiency degree of the environment. The in vitro cell culture proves that oxygen microbubbles can effectively improve an anoxic microenvironment; in vivo experiments prove that the injection of oxygen microbubbles into mice can effectively inhibit the growth of tumors and achieve good treatment effect.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种颗粒稳定的氧微气泡在制备改善肿瘤缺氧微环境的药物或试剂中的应用。
背景技术
肿瘤是严重威胁人类健康的主要原因。传统的肿瘤治疗方法包括手术切除、化疗、放疗和分子靶向治疗等。这些方法对于部分肿瘤可以有效治疗并且控制其转移，但仍然存在缺陷，例如手术切除具有较高复发率，化疗对身体伤害较大，电离辐射线对肿瘤周围正常组织损伤严重等。肿瘤之所以难治疗，其中一个主要的原因就是肿瘤细胞会不断适应其所处的不良环境，缺氧就是肿瘤所处不良环境中的一种，虽然不良环境会削弱肿瘤的功能，但相反恶性肿瘤细胞往往能够进行补偿过程并且驱动后期更加恶性疾病行为的发生。而且人们发现大多数肿瘤的缺氧水平比正常组织严重。缺氧往往发生在实体肿瘤的中心，主要是由于肿瘤细胞生长的速度超过其血管生长的速度，肿瘤细胞群周围毛细血管的氧有效弥散范围不能满足肿瘤快速生长的需要，导致肿瘤组织内毛细血管的氧和营养供应不均，由此形成肿瘤缺氧微环境。缺氧区域是一种非常复杂的微环境，会引起肿瘤化疗耐药、血管新生、侵袭、转移、放疗耐药和代谢变化等多种效应，因此通过改善肿瘤缺氧环境治疗肿瘤具有重大的现实意义。
目前临床上采用的肿瘤供氧干预方法为高压氧治疗，创造一种高压氧环境(比如高压氧舱)让病人身处其中或者让病人吸入卡泊金，是一种通过向血液中溶解高浓度氧，利用人体血液循环为肿瘤提供更多氧气。但是，肿瘤血管的异常结构会严重影响血液对肿瘤的供氧，因此高压氧治疗效果并不显著，我们需要一种新的、可以越过肿瘤血管干预的途径来实施更高效的肿瘤供氧治疗。
因此，能够将氧气输送到肿瘤部位并改善其缺氧状况的氧微气泡可以为肿瘤治疗提供一种替代疗法。本发明采用的聚多巴胺纳米颗粒氧微气泡是一种稳定的、生物相容性的试剂，直接注射到肿瘤中心可以高效改善肿瘤缺氧微环境，从而达到治疗肿瘤的目的，在生物医药领域具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供氧微气泡在制备改善肿瘤缺氧微环境的药物或试剂中的应用，并提供氧微气泡在制备肿瘤联合治疗的药物或试剂中的应用。本发明采用的氧微气泡具有优异的稳定性和生物相容性，可以在缺氧环境中高效释放氧气，改善肿瘤缺氧微环境。
本发明的技术方案如下：
本发明另一方面提供了一种氧微气泡在制备改善肿瘤缺氧微环境的药物或试剂中的应用。
本发明另一方面提供了一种氧微气泡在制备用于肿瘤联合治疗的药物或试剂中的应用，所述联合治疗为采用药物联合治疗，联合治疗药物为吉西他滨。具体为，在改善肿瘤缺氧微环境的同时采用药物联合治疗。
进一步的，所述的氧微气泡为采用颗粒稳定的氧微气泡。
更进一步的，所述的氧微气泡为聚多巴胺纳米颗粒包裹的氧微气泡，平均粒径为5-20um，平均Zeta电位约等于63mV。优选地，所述氧微气泡平均粒径为7.5±0.3um，平均zeta电位为63±1mV，
进一步的，所述的药物或试剂为可以直接注射到肿瘤中心的药物或试剂。
进一步的，所述的氧微气泡浓度为0.5-2mL氧微气泡/1mL水。
进一步的，所述的肿瘤为胰腺癌肿瘤。
进一步的，所述药物或试剂直接注射到肿瘤中心，微气泡内的氧气自由扩散可以高效提高肿瘤微环境含氧量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明开发了一种聚多巴胺纳米颗粒氧微气泡改善肿瘤缺氧微环境的方法，旨在提供一种具有较高生物相容性、稳定性、高效性的方法，提高肿瘤环境含氧量，从而治疗肿瘤。具体如下：
本发明采用的氧微气泡具有很高的生物相容性、稳定性且具有被动调节释放的特性：当作用环境极度缺氧时，氧微气泡可以快速释放氧气，当环境氧浓度较高时，氧微气泡释放氧气速率会相应降低，因此克服了传统方法在治疗肿瘤过程中对正常组织的损害。
本发明提供了一种可直接注射到实体肿瘤中心改善肿瘤缺氧环境的试剂或药物，因此克服了传统提高血液含氧量却受限于肿瘤血管干预的缺点，从而取得了高效改善肿瘤缺氧环境的技术效果。
本发明提供了一种氧微气泡联合吉西他滨药物治疗肿瘤的方法，在改善肿瘤缺氧微环境同时采用药物治疗，因此可以克服吉西他滨药物治疗肿瘤产生耐药性的缺点，并实现联合治疗效果。
附图说明
图1为制备聚多巴胺纳米颗粒稳定的微气泡分散体系的装置示意图；
图2为本发明实施例1中聚多巴胺纳米颗粒在氧气-水界面附着交联的方案示意图；
图3a为本发明实施例1中步骤(3)中得到的聚多巴胺纳米颗粒稳定的氧微气泡分散溶液的光学图像；
图3b为本发明实施例1中步骤(4)中得到的聚多巴胺纳米颗粒稳定的氧气微气泡分散液的光学图像；
图4是氧微气泡的氧气输送性能。
图4(a)显示三组不同细胞培养的示意图。
图4(b)三种不同培养条件下缺氧细胞的荧光强度分布。分别为缺氧环境(1％O2，L-O2组)、常氧环境(21％O2，N-O2组)和低氧微气泡(1％O2+氧气微气泡，M-O2组)培养24h后细胞的荧光强度。
图4(c)三种不同培养条件下缺氧细胞的平均荧光强度。含氧微气泡培养的缺氧细胞荧光强度最低，提示氧微气泡是最有效的氧输送载体。NS表示不显著；**表示p<0.001；***表示p<0.05。
图5是氧微气泡与GEM药物联合治疗胰腺癌。
图5(a)未接受治疗的肿瘤照片(C组)，使用氧微气泡(M组)，使用吉西他滨药物(G组)，使用氧微气泡和吉西他滨药物(M+G组)。用氧微气泡和吉西他滨药物治疗的小鼠肿瘤大小最小，表明联合治疗对于抑制肿瘤生长效果更好。
图5(b)肿瘤的重量。
图5(c)不同处理下低氧肿瘤细胞的平均荧光强度。未治疗、使用氧气治疗、使用GEM治疗以及使用氧气和GEM治疗的肿瘤中的活细胞、单细胞、EPCAM+肿瘤细胞和低氧肿瘤细胞的流程图。SSC-A＝侧面散射面积；SSCH＝侧面散射高度。ns表示不重要；*表示p<0.05**表示p<0.01***表示p<0.001。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明作进一步详细说明，但实施例并不作为本发明的限定。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1氧微气泡的制备
本发明的氧微气泡的制备方法参见专利CN111067872A中公开的方法，在本实施例中，具体的制备方法如下：
参照附图1中的装置，采用本发明的方法制备聚多巴胺纳米颗粒稳定的氧气微气泡分散体系，具体步骤如下：
(1)将20mg多巴胺，5mg聚赖氨酸和120mg壳聚糖季铵盐溶于10mL去离子水中，然后加入1mL的pH＝8.5的tris盐缓冲溶液调节混合溶液pH值，使该混合溶液为碱性。
(2)向步骤(1)所得溶液中以1L/min的流速通入氧气，调节高速分散均质机转速为12000rpm，用均质机将氧气剪切成微气泡。多巴胺在碱性条件下氧化自聚形成聚多巴胺纳米颗粒，并附着在微气泡界面，形成一层致密的聚多巴胺颗粒壳层。(如附图2所示)，均质5min后关闭高速分散均质机，继续通入氧气2min至溶液呈棕黑色。
(3)向步骤(2)所得溶液中加入1ml的4％戊二醛溶液，并用高速分散均质机在12000rpm下均质3min，然后在室温下以1000rpm搅拌30min，固化附着在微气泡界面的聚多巴胺颗粒壳层,得到聚多巴胺纳米颗粒稳定的微气泡分散溶液，如附图3a所示。
(4)将步骤(3)中所得聚多巴胺纳米颗粒稳定的微气泡分散溶液用去离子水稀释5倍，然后用孔径为2.5um的滤纸和玻璃漏斗对稀释后的溶液进行过滤，去除多余的未吸附在微气泡界面的聚多巴胺纳米颗粒和其他试剂，然后将留在滤纸上的微气泡用去离子水洗涤，再次过滤，最后用去离子水将微气泡冲入玻璃瓶中储存，得到在水中稳定分散的聚多巴胺纳米颗粒稳定的氧气微气泡分散液,浓度为1mL氧微气泡/1mL水，如附图3b所示。微气泡表面带有+62.5mV的正电荷，证明微气泡表面存在聚多巴胺壳层。
所制得氧微气泡粒径为7.5±0.3um，Zeta电位等于63±1mV。
实例2：氧气微气泡体外改善肿瘤细胞缺氧微环境。
首先为准备阶段培养KPC细胞：添加10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素。KPC细胞在含5％CO2的湿式细胞培养箱中维持在37.0±0.2℃培养。贴壁的单层细胞在37℃的常氧环境(5％CO2和95％空气)中培养，然后暴露在低氧环境(1％O2由CO2和N2平衡)中，在常氧条件下接种细胞，融合至大约60％。细胞培养24小时后，移入低氧室暴露在低氧条件下(1％O2由CO2和N2平衡)。将1ul低氧绿试剂加入1mL含1×106细胞的RPMI-1640培养液中3h。之后分别在低氧环境(1％O2)、常氧环境(21％O2)和低氧条件加氧气微气泡(1％O2+实施例1得到的氧气微气泡)3种不同环境(如图4a)下培养细胞(缺氧培养18h后，分别于18h和21h加入1mL分散的氧气微气泡)；在三组中，L-O2组培养的KPC细胞处于缺氧状态的细胞最多，缺氧绿试剂标记的KPC细胞的荧光强度最高。相反，培养在M-O2组的KPC细胞显示出最低的荧光强度，如图4b所示。
结果表明，氧气微气泡是一种优良的氧气输送载体，能有效地抑制缺氧细胞的数量。有趣的是，M-O2组比N-O2组表现得更好，缺氧细胞更少，这表明氧气微气泡分散在培养基中可以更好地提高氧气水平，如图4c所示。因此，氧微气泡能很好地改善肿瘤细胞的缺氧状态。
实例3：氧微气泡用于改善胰腺癌肿瘤缺氧微环境治疗肿瘤。
每只小鼠皮下注射300000个悬浮在500ul培养基中的未经处理的KPC细胞；两周后，肿瘤直径在5-9mm之间的小鼠被用于体内研究。将裸鼠分为2组：对照组、氧气微气泡组，每组有四只老鼠。对照组不做治疗处理；氧气微气泡组小鼠肿瘤中心注射100μL实施例1得到的氧微气泡,隔日1次，一周后处死小鼠；
如图5a中C组和M组所示，治疗两周后，氧气微气泡组的肿瘤体积和重量小于对照组。为了证实通过氧气微气泡的治疗改变缺氧微环境的效果，通过流式细胞仪分析肿瘤细胞。如图5c和图5d所示。通过在肿瘤中依次筛选活细胞、单细胞、EPCAM+肿瘤细胞和低氧肿瘤细胞，结果证实氧疗法有利于抑制肿瘤中低氧肿瘤细胞的数量，从而抑制肿瘤的生长。因此，氧微气泡能改善胰腺肿瘤微环境的缺氧状况，在抑制肿瘤生长方面发挥了重要作用。
实例4：氧微气泡和吉西他滨协同治疗胰腺癌肿瘤。
每只小鼠皮下注射300000个悬浮在500ul培养基中的未经处理的KPC细胞；两周后，肿瘤直径在5-9mm之间的小鼠被用于体内研究。将裸鼠分为3组：对照组、吉西他滨组、氧气微气泡+吉西他滨组。每组有四只老鼠。对照组不做治疗处理；氧气微气泡组小鼠肿瘤中心注射100ul实施例1得到的氧微气泡，隔日1次；氧气微气泡+吉西他滨组小鼠肿瘤中心注射100ul实施例1得到的氧微气泡，腹腔注射200ul 7.5mg/ml吉西他滨，隔日1次，一周后处死小鼠。
如图5a和b中所示，虽然采用吉西他滨治疗的G组表现出一定的抗肿瘤作用，但采用氧气和吉西他滨药物治疗的M+G组在四组中显示出最小的肿瘤体积和重量，表明氧气微气泡和吉西他滨药物联合治疗有利于增强肿瘤治疗。图5c和d的流式细胞仪分析也表明通过而氧微气泡与吉西他滨药物联合治疗胰腺癌具有更加优异的效果。在临床治疗中，单独使用吉西他滨药物虽有一定效果，但存在导致肿瘤产生耐药性的风险且药效有限，然而配合氧微气泡后，通过改善肿瘤缺氧微环境极大的降低了肿瘤的耐药性风险，经实验证明联合治疗效果远好于仅使用吉西他滨治疗(如图5)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种金黄色葡萄球菌抑制物及其制备方法、应用