具体实施方式

肿瘤抗原

如本文中使用的，术语“肿瘤抗原(Tumor antigen，TA)”指肿瘤相关抗原以及肿瘤特异性抗原，即由肿瘤细胞表达的任何免疫原性表位（例如蛋白质）。该蛋白质可以由非肿瘤细胞表达，但是只在由肿瘤细胞表达时是免疫原性的。或者，该蛋白质可以由肿瘤细胞表达，但是正常细胞不表达。优选地，本发明的抗TA抗体结合TA的胞外域。在一个优选实施方案中，所述肿瘤抗原是人肿瘤抗原。例示性肿瘤抗原包括但不限于黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP, UniProt Q6UVK1,NCBI登录号NP_001888)、成纤维细胞活化蛋白(FAP,UniProt Q12884,Q86Z29,Q99998;NCBI登录号NP_004451)、表皮生长因子受体 (EGFR,也称作ErbB1和Her1, UniProt P00533; NCBI登录号NP_958439, NP_958440)、癌胚抗原(CEA,也称作癌胚抗原相关细胞粘附分子5或CD66e; UniProt P06731,NCBI登录号NP_004354)、Her2（UniProt P04626）和CD33(也称作gp76或唾液酸结合Ig样凝集素3(Siglec-3,UniProtP20138,NCBI登录号NP_001076087, NP_001171079)。

纳米抗体

Hamers等在1993年偶然发现骆驼体内存在天然缺失整个轻链和重链恒定区CH1的重链抗体（heavy chain antibody, hcAb）。重链抗体的可变区（variable domains of theHcAb, VHH）是迄今为止发现的具有抗原结合功能的最小分子量抗体片段，分子量为15kD，仅为常规抗体的1/10，其分子高度约4.8 nm，直径约2.2 nm，故又被称为纳米抗体（nanobody）或单域抗体（single domain antibody, sdAb）。纳米抗体的抗原结合区仅由VHH的3个超变区（H1-H3）组成，在空间上形成了与常规抗体典型结构不同的抗原结合域。其中H3的平均长度比常规抗体长，在空间上可呈突出的指状结构，因而可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位。

本发明的纳米抗体抗人CD16a VHH，其中互补决定区CDR1选自ASGDTTSEYWGA（SEQID No：13）、VSGYSYSSYCLA（SEQ ID No：14）、VSGYFGRRYCMA（SEQ ID No：15）、ASGNTYRSYSMA（SEQ ID No：16）和ASGAIVSRSCMG （SEQ ID No：17）所示的氨基酸序列；互补决定区CDR2选自AILPLSTTPVYAGS（SEQ ID No：18）、AMSVGGGSTYYADS（SEQ ID No：19）、SIDRNGNIDYTES（SEQID No：20）、AIASDGSKAYADS（SEQ ID No：21）、和GIFLSDGRTTYADS（SEQ ID No：22）所示的氨基酸序列；以及互补决定区CDR3选自AAARRGTNAFLTHDKYGY（SEQ ID No：23）、ASRRGGGYCYPAYRLDFYH（SEQ ID No：24）、AAPWAGVYCAASLRESDYKF（SEQ ID No：25）、AAKRGRWFLVQSDRVD（SEQ ID No：26）和AANWRRWLYGATCEATNDYN（SEQ ID No：27）所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，该抗人CD16a VHH选自以下组合：（a）CDR1的氨基酸序列为ASGDTTSEYWGA（SEQ ID No：13），CDR2的氨基酸序列为AILPLSTTPVYAGS（SEQ ID No：18）和CDR3的氨基酸序列为AAARRGTNAFLTHDKYGY（SEQ ID No：23）；（b）CDR1的氨基酸序列为VSGYSYSSYCLA（（SEQ ID No：14）），CDR2的氨基酸序列为AMSVGGGSTYYADS（SEQ ID No：19）和CDR3的氨基酸序列为ASRRGGGYCYPAYRLDFYH（SEQ ID No：24）；（c）CDR1的氨基酸序列为：VSGYFGRRYCMA（SEQ ID No：15）, CDR2的氨基酸序列为：SIDRNGNIDYTES（SEQ ID No：20）和CDR3的氨基酸序列为AAPWAGVYCAASLRESDYKF（SEQ ID No：25）；（d）CDR1的氨基酸序列为ASGNTYRSYSMA（SEQ ID No：16），CDR2的氨基酸序列为AIASDGSKAYADS（SEQ ID No：21）和CDR3的氨基酸序列为AAKRGRWFLVQSDRVD（SEQ ID No：26）；或（e）CDR1的氨基酸序列为：ASGAIVSRSCMG（SEQ ID No：17），CDR2的氨基酸序列为GIFLSDGRTTYADS（SEQ ID No：22）和CDR3的氨基酸序列为AANWRRWLYGATCEATNDYN（SEQ ID No：27）。

在一些实施方式中，所述的抗人CD16a VHH的氨基酸序列选自SEQ ID No：1、SEQID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5所示的氨基酸序列。

双特异性纳米抗体

在本发明中，“双特异性纳米抗体”或“双特异性抗体”是指包含两个结合结构域的单个多肽链，其中每个“结合结构域”包含一个纳米抗体VHH，其中第一结合结构域的VHH特异性地结合第一分子肿瘤抗原，第二结合结构域的VHH特异性地结合第二分子CD16a。两个结合结构域任选地通过短的间隔多肽（连接肽）彼此连接。在一些实施方式中，肿瘤抗原为CEA、Her2、CD19、CD20、上皮细胞粘附分子、CEACAM5、或CD66e。在一个实施方式中，所述抗肿瘤抗原位于所述抗人CD16a VHH的N末端。在另一个实施方式中，所述抗人肿瘤抗原位于所述抗人CD16a VHH的C末端。在本发明中，“在N末端”或在“C末端”是相对而言的，并非双特异抗体的绝对N末端或C末端。作为一个非限制性的例子，“位于第二结合结构域的N末端”的第一结合结构域仅表示第一结合结构域是位于双特异抗体内第二结合结构域的氨基端，并且不排除额外序列（例如如上所述的标签、或另一蛋白质或非蛋白质类的化合物，例如放射性同位素）位于双特异抗体的最终N末端的可能。

在本发明的一个方面，本发明的双特异性抗体包含：（a）与人CEA特异性结合的第一结合结构域，所述第一结合结构域包含抗人CEA VHH；（b）与人CD16a特异性结合的第二结合结构域，所述第二结合结构域包含抗人CD16a VHH。两个结合结构域任选地通过短的间隔多肽（连接肽）彼此连接。在一个实施方式中，所述抗人CEA VHH的氨基酸序列如SEQ ID No：6所示。在一个实施方式中，所述抗人CEA VHH位于所述抗人CD16a VHH的N末端。在另一个实施方式中，所述抗人CEA VHH位于所述抗人CD16a VHH的C末端。在本发明中，“在N末端”或在“C末端”是相对而言的，并非双特异抗体的绝对N末端或C末端。作为一个非限制性的例子，“位于第二结合结构域的N末端”的第一结合结构域仅表示第一结合结构域是位于双特异抗体内第二结合结构域的氨基端，并且不排除额外序列（例如如上所述的标签、或另一蛋白质或非蛋白质类的化合物，例如放射性同位素）位于双特异抗体的最终N末端的可能。

双特异抗体的第一和/或第二结合结构域可以是非人源性的，例如可以衍生自鼠单克隆抗体。但是，当将其施用于人患者时，衍生自鼠抗体的双特异性单链抗体可能被人体识别为异物。因此，优选地，双特异性单链抗体的第一和/或第二结合结构域为人源性的，即衍生自人的序列。例如，可通过基于噬菌体展示的技术来鉴定特异性结合人CEA或人CD16a的结合结构域。或者，其中一个结合结构域是人源性的，另一个是非人源性的，从而产生嵌合的双特异纳米抗体。

在本发明的一个实施方式中，所述双特异抗体通过人工合成方法得到核酸序列，通过原核细胞表达和纯化而制得。

可以预期到的是，本发明的双特异抗体的结合结构域可带有用于例如蛋白质表达、纯化、检测或富集的“标签”，例如Flag-标签、c-myc-标签、GST-标签或His-标签。例如，对于Flag-标签，目前应用最广泛的是亲水性八肽DYKDDDDK。这些标签可以位于双特异抗体的N末端或C末端。

还可以预期到的是，本发明的双特异抗体的结合结构域可带有信号肽，其通常位于分泌蛋白的N端，一般由15～30个氨基酸组成。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒(SRP)所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，新合成的蛋白质进入内质网腔，而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除。如终止转运序列存在于新生肽链的C端，也可以不被信号肽酶切除，如卵清蛋白含有内部信号肽。它的前体与成熟形式都没有被信号肽酶切除的过程。一个示例性的信号肽序列为MGKKIWLALAGLVLAFSASA。

术语“特异性地结合”或“与…特异地结合”是指所述双特异抗体的第一和/或第二结合结构域分辨各自第一和/或第二分子至某种程度的能力，从而在来自可能作为结合配体的多种不同分子的库中，仅所述各自的第一和/或第二分子能够被结合或被显著的结合。可以在例如Biacore仪器上，通过ELISA、FACS分析等常规的方法来测定这种结合。

具体而言，本发明的双特异抗体的第一结合结构域结合于人CEA（癌胚抗原、癌胚抗原相关的细胞粘附分子5、CEACAM5、CD66e），而第二结合结构域结合于人CD16a。

“特异性结合”是指本发明的双特异抗体能够特异性地与各人靶标分子的至少两个、 三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多氨基酸相互作用。抗体的“特异性结合”主要由两个参数来表征：定性参数（结合表位或抗体结合位置）和定量参数（结合亲和力或结合强度）。抗体结合表位可通过FACS法、肽点表位作图法、质谱法或肽ELISA法测定。Biacore法和/或ELISA法可测定抗体与特定表位的结合强度。通常将信噪比作结合特异性的代表性测定计算方法。在这样的信噪比中，信号代表抗体结合至目标表位的强度，而噪声代表抗体与其他非目标表位结合的强度。优选地，对于目标表位的信噪比为约50时可以认为所评估的抗体以特异性方式结合至目标表位，即“特异性结合”。

阳性表达肿瘤

“CEA阳性表达肿瘤”或“CEA阳性肿瘤”是指在细胞表面表达CEA的肿瘤细胞。在本发明中，要治疗的CEA阳性肿瘤可以为胃肠道腺癌、乳腺癌或肺癌。胃肠道腺癌可以选自结直肠癌、胰腺癌、食道癌或胃腺癌。如前所述，本发明的双特异抗体尤其适合治疗具有进行性肿瘤、转移性肿瘤、复发性肿瘤、晚期上皮肿瘤、高上皮肿瘤负荷的患者，或具有CEA血清浓度高于100 ng/mL（例如通过ELISA测定）的患者。在这些肿瘤患者的某些中，血浆中具有高水平的可溶性CEA抗原。或者，这些肿瘤细胞的周围存在高水平的可溶性CEA。应当意识到的是，在许多基于抗体的治疗方法中，血清CEA抑制抗体与肿瘤细胞膜上的CEA的结合，并且阻断抗体的活性，从而阻碍抗肿瘤治疗的成功。然而，得益于本发明双特异抗体的特殊结构，本发明的双特异抗体不再受限于此。本文所用“抑制”或“治疗”包括延缓与疾病有关的症状的发展和/或减轻所述疾病将要或预期发展的这些症状的严重程度。所述术语还包括减缓已有症状、防止另外的症状和减缓或防止这些症状的潜在原因。因此，所述术语表示业已将有益结果赋予患有疾病的脊椎动物对象。

本文所用术语“治疗有效量”或“有效量”是指当将本发明双特异性抗体给予或与另外的治疗剂联合给予细胞、组织或受治疗者时，其有效防止或减缓待治疗的疾病或病症的量。治疗有效剂量进一步指所述化合物足以导致症状减缓的量，所述减缓症状例如为治疗、治愈、防止或减缓相关医学状态，或提高对所述病征的治疗率、治愈率、防止率或减缓率。当施用给个体单独给予的活性成分时，治疗有效量是指该单独的成分。当施用组合时，治疗有效量是指产生治疗效果的活性成分的联合的量，而不论其是联合给予、连续给予还是同时给予。治疗有效量将减轻症状通常至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％和最优选至少50％。

药物组合物和疗法

“药物组合物”是指用于人的药物制剂。该药物组合物包含本发明的双特异抗体以及载体、稳定剂和/或赋形剂的合适制剂。本发明包括本文所述双特异性纳米抗体的药物制剂。为了制备药物组合物或无菌组合物，让抗体与可药用载体或赋形剂混合。可通过与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，来制备呈例如冻干粉、浆液、水溶液剂或混悬剂形式的治疗及诊断药物的制剂。

可通过标准药物方法，在细胞培养物或实验动物中测定单独给予或与免疫抑制剂联合给予的抗体组合物的毒性和治疗功效，所述方法例如为用于测定LD50（使群体的50％致死的剂量）和ED50（有效治疗群体的50％的剂量）的方法。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，可表示为LD50与ED50之比。从这些细胞培养物测定及动物研究中获得的数据可用于调配用于人的剂量范围。所述化合物的剂量优选在包括毒性极少或无毒性的ED50的循环浓度范围内。可根据采用的剂型及所用的给药途径，使剂量在该范围内变化。

合适的给药途径包括胃肠外给药（例如肌内、静脉内或皮下给药）及口服给药。可按多种常规方式施用本发明的抗体或组合物，这些方法例如有经口摄取、吸入、局部施用或经皮肤、皮下、腹膜内、胃肠外、动脉内或静脉内注射。在一个实施方案中，静脉内给予本发明的双特异性纳米抗体或药物组合物。在另一个实施方案中，皮下给予本发明的双特性纳米抗体或药物组合物。或者，人们可以以局部而非全身方式（通常为长效制剂或缓释制剂）给予抗体，例如经由将抗体直接注射到作用位点。此外，人们可在靶向药物递送系统中给予抗体。

由临床医生例如用本领域已知或怀疑影响治疗或预期影响治疗的参数或因子来测定合适的剂量。通常，开始剂量比最佳剂量稍低，此后少量增加直到达到相对于任何不良副作用所要的或最佳的作用效果。重要的诊断测量包括测量例如炎性症状或所产生的炎性细胞因子的水平。

可通过连续输注或通过以一定间隔（例如一天、一周或每周1-7次）给药来提供抗体、抗体片段和细胞因子。可通过静脉内、皮下、腹膜内、经皮肤、局部、经口、经鼻、经直肠、肌内、大脑内、脊柱内或通过吸入来提供剂量。优选剂量方案是包括避免显著的不合乎需要的副作用的最大剂量或给药频率的方案。周总剂量通常为至少0.05 μg/kg体重，更通常为至少0.2 μg/kg，最通常为至少0.5 μg/kg，典型地为至少1 μg/kg，更典型地为至少10 μg/kg，最典型地为至少109 μg/kg，优选为至少0.2 mg/kg，更优选为至少1.0 mg/kg，最优选为至少2.0 mg/kg，理想地为至少10 mg/kg，更理想地为至少25 mg/kg，而最理想地为至少50mg/kg。基于摩尔/kg计算，小分子治疗剂例如肽模拟物、天然产物或有机化学药剂的所需剂量与抗体或多肽的剂量接近相同。

本发明药物组合物还可含有其它药剂，包括但不限于细胞毒剂、细胞生长抑制剂、抗血管形成药物或抗代谢药物、靶向肿瘤药物、免疫刺激剂或免疫调节剂或与细胞毒剂、细胞生长抑制剂或其它毒性药物缀合的抗体。也可与其它治疗形式（例如手术、化疗及放射）一起施用所述药物组合物。典型的兽医、实验或研究对象包括猴、狗、猫、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、马和人。

具体地，本发明的双特异性纳米抗体可与第二抗癌剂或组合使用。在具体实施例中，第二抗癌剂及本发明的纳米抗体于实质上相同的时间施用。个体有时会同时使用第二抗癌剂及本发明的双特异性纳米抗体。在一种实施方式中，该第二抗癌剂或其他典型施用至癌症病患的药剂及本发明的双特异性纳米抗体可组合成药物组合物；在其他具体实施例中，两者分别施用。

术语“第二抗癌剂”是指任何的抗肿瘤药品，包括但不限于：酪胺酸激酶抑制剂如特罗凯(erlotinib)；蒽环霉素(anthracycline)，例如道诺霉素(daunorubicin)(包括微脂体型道诺霉素)、阿霉素(doxorubicin)(包括微脂体型阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、埃达霉素(idarubicin)与伐鲁比辛(valrubicin)；链霉菌属相关的试剂，例如博来霉素(bleomycin)、放线菌素(actinomycin)、光辉霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、波弗霉素(porfiromycin)；以及蒽醌(anthracenedione)，例如米托蒽醌(mitoxantrone)与匹杉琼(pixantrone)。第二抗癌剂也可以是治疗性抗体，例如具有抗肿瘤活性的单株抗体，其包括但不限于：鼠科的、嵌合的或部分或全部人源化的单株抗体。治疗性抗体包括但不限于：针对细胞表面或细胞内部的肿瘤或癌症抗原的抗体。治疗性抗体还包括但不限于：针对与CEA直接或间接相关的标的或路径的抗体。治疗性抗体可进一步包括但不限于：针对直接与本发明化合物相关的标的或路径交互作用的标的或路径的抗体。在一种实施方式中，治疗性抗体包括但不限于：阿仑单抗(Alemtuzumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、利妥昔单抗(Rituximab)帕妥珠单抗（Pertuzumab）、或曲妥珠单抗(Trastuzumab)。

本发明的一方面提供一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括向患有肿瘤的对象施用治疗有效量的本发明的双特异性纳米抗体。在一些实施方式中，所述双特异性纳米抗体包含：（a）与肿瘤抗原特异性结合的第一结合结构域，所述第一结合结构域包含抗肿瘤抗原的VHH；（b）与人CD16a特异性结合的第二结合结构域，所述第二结合结构域包含本发明的抗人CD16a VHH。在一些实施方式中，所述双特性纳米抗体，其包含：（a）与人CEA特异性结合的第一结合结构域，所述第一结合结构域包含抗人CEA VHH；（b）与人CD16a特异性结合的第二结合结构域，所述第二结合结构域包含本发明的抗人CD16a VHH。在一些实施方式中，所述双特异性纳米抗体氨基酸序列选自SEQ ID No：8、SEQ ID No：9、SEQ ID No：10、SEQ ID No：11、SEQ ID No：12所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述对象为哺乳动物，优选是人。

本发明的另一方面提供一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括向患有肿瘤的对象施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物包含本发明的双特异性纳米抗体以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包含本发明的双特异性纳米抗体及第二抗癌剂。在一些实施方式中，所述对象为哺乳动物，优选是人。

免疫佐剂

本发明的双特异性纳米抗体可与其他重组蛋白和/或肽（例如肿瘤抗原或癌细胞）联合使用，以便提高对这些蛋白的免疫应答（即在接种方案中）。例如，通过共同给予双特异性抗体与目标抗原（例如疫苗），可将双特异性抗体及其抗体片段用于刺激抗原特异性免疫应答。因此，本发明在另一方面提供了增强受治疗者对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给予受治疗者：（i）抗原；和（ii）本发明双特异性抗体或其抗原结合部分，以便提高受治疗者对抗原的免疫应答。例如，抗原可为肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。所述抗原的非限制性实例包括但不限于肿瘤抗原或来自病毒、细菌或其它病原体的抗原。

其它组合疗法

如上文所述，可共同给予本发明双特异性抗体及一种或多种其它治疗剂（例如细胞毒剂、放射性毒性剂或免疫抑制剂）。所述抗体可与所述药剂连接（作为免疫复合体），或可与治疗剂分开给予。在后一种情况下（分开给予）下，可在给予治疗剂之前、之后或并行给予抗体，或可与其它已知的疗法共同给予。

抗体还可用于体内诊断测定。通常用放射性核素（例如111In、99Tc、4C、31I、125I、3H、32P、35S或18F）标记抗体，以使可用免疫显像或正电子成像术定位抗原或表达抗体的细胞。

接头序列或连接肽

本发明的双特异抗体还包括位于第一结合结构域和第二结合结构域之间的接头序列，通常为4-20个氨基酸构成的短肽。这些接头序列使得各组分之间被合理地定位而实现各组分的功能活性。

优选地，接头序列包括2至20个氨基酸序列，更优选为5至20个氨基酸。接头序列优选为柔性接头序列，因而其不会限制效应分子或多肽在单个不期望的构象中。接头序列优选主要由具有小侧链的氨基酸构成，例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，从而提供所述柔性。优选地，接头序列的约80%以上或更多比例的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸残基。合适的接头序列的例子有GGGGS（G₄S），即Gly Gly Gly Gly Ser；或G₄SG₄SG₄S (SEQ ID No: 7)，例如用于连接本发明中的抗人CEA VHH和抗人CD16a VHH。也可以使用其他不同的接头序列，包括已被成功地用于连接不同抗体可变区的多种柔性接头设计。接头序列的大小和序列组成可通过常规的电脑建模及技术来确定。

在本发明中，“多肽”是指基本上由20种天然氨基酸中的任何几个所组成的任何长度的聚合物。虽然“蛋白质”或“蛋白”通常是指氨基酸长度较大的聚合物，而“肽”通常是指氨基酸长度较小的聚合物，但是这两个术语之间通常没有明显的界限，而且经常范围上有重叠。

在本发明中，“载体”为能够在宿主细胞中自主复制且可接受外源DNA的核酸分子。载体带有其自身的复制起始位点，可用于插入外源DNA的限制性内切酶识别位点，以及通常的选择性标记（如编码抗生素抗性的基因），常常还包括用于表达插入的DNA的识别序列（如启动子和增强子）。常见的载体包括质粒载体和噬菌体载体。

通过参考以下实施例将更充分地理解本发明。然而，这些实施例不应该理解为限制本发明范围。本文提及的所有文献和专利引用都明确地通过引用并入本文。

实施例1 免疫VHH噬菌体展示文库的构建和筛选

为了产生抗CD16a单域抗体，将CD16a-His蛋白（Acrobiosystems，货号CDA-H5220）用于免疫骆驼。简而言之，在一头骆驼的四轮免疫之后，其通过ELISA获得高效价，提取外周血细胞并通过梯度离心分离。通过Trizol试剂（Invitrgoen）将RNA从淋巴细胞中完全分离。在逆转录成cDNA的第一链之后，将VHH片段扩增并将其连接到pMECS噬菌粒载体。通过将连接产物转化为XL1-Blue E.coli细胞来创建VHH噬菌体文库。

为了扩增噬菌体文库，在37°C，220 rpm/min将200 µL CD16a-VHH噬菌体文库培养在40 mL含有100 μg/mL的氨苄青霉素和10μg/ mL的四环素的超级肉汤培养基（10 g MOPS，Sigma；30 g胰蛋白胨，BD-Bioscience；20 g酵母提取物，BD-Bioscience；用ddH₂O配成1升总体积）中，直至OD600达到0.6-−0.8。然后加入〜1.4×10¹² cfu（菌落形成单位）辅助噬菌体VCSM13，在不搅拌的情况下于37℃孵育15分钟，然后以220 rpm/min培养约1.5-2小时。在孵育后，以4000 rpm/min离心10分钟，收集噬菌体，然后将其重悬于40 mL含有100 µg/mL氨苄青霉素、10 µg/mL四环素和50 µg/mL卡那霉素的新鲜肉汤培养基中，并在30°C下培养过夜。然后通过在4℃，以4000 rpm/min离心10分钟以丢弃细菌细胞。用5×PEG/NaCl（20％PEG/2.5 M NaCl）从上清液中沉淀出噬菌体，然后将其重悬于1 mL PBS中，然后再次沉淀以完全去除细菌细胞。然后将该噬菌体重悬于100-200 µL PBS+1％BSA中。

使用板淘选（Plate panning）来选择CD16a特异性VHH结合物。简而言之，将人CD16a-His抗原包被在96孔微孔板上。然后将含有约10¹² cfu噬菌体的噬菌体文库（称为输入）与该被包被的板在37°C孵育15分钟。将弱结合的噬菌体或过量的非结合的噬菌体用0.1％PBST洗涤5次。用甘氨酸-BSA缓冲液（pH 2.2）洗脱特异性结合的噬菌体，并立即用2 MTris缓冲液（pH 9.0）中和。所得噬菌体集合被命名为输出。将被洗脱的噬菌体结合物用于感染感受态E. coli XL1-blue（OD600=0.6），并扩增以用于下一轮淘选。为了使阳性结合物富集，通过在每个循环中包被较低浓度的CD16a（1ug至100 ng），将淘选进行4个循环，从而提高了严格度。通过4轮噬菌体淘选，随机挑选阳性克隆，并在96孔深孔板（deep block）中扩增，并通过加入VCSM13辅助噬菌体进行救援。用含噬菌体的培养基上清液进行噬菌体ELISA，以进一步确认阳性克隆。然后将阳性噬菌体克隆通过PEG/NaCl溶液沉淀，并重悬于PBS中。通过测量在A₂₈₀处的OD来确定噬菌体浓度。

结果：为了获得单域抗hCD16a抗体，用300 µg hCD16a-His蛋白将骆驼免疫4次，并从分离自被免疫的骆驼的淋巴细胞构建噬菌体文库。在通过将包被抗体从1 µg降低到100ng以增强的严格性的4轮淘选（表1）之后，获得了54个阳性克隆。然后通过PEG/NaCl溶液使阳性噬菌体克隆沉淀，并重悬于PBS中。通过在A₂₈₀处测量OD来确定噬菌体浓度。然后将这些被纯化和定量的54个克隆用于另一个定量ELISA。ELISA实验表明，这些噬菌体中的34个可以特异性识别CD16a-His蛋白。在分析序列之后，获得了23个不同的序列。根据多样性和Elisa结果，进一步将23个克隆中的6个进行分析（图1）。

表1. hCD16a-VHH文库的富集数据

实施例2. 抗CEA-CD16a VHH 蛋白的表达和纯化

将所选的噬菌体克隆进行测序和克隆，然后与抗CEA-VHH（GenBank：ABS29544.1）融合，并将其亚克隆到pET26b载体（Novagen）中。执行周质蛋白纯化方法。简而言之，将抗CEA-CD16a VHH质粒转化到E. coli菌株BL21（DE3）感受态细胞中，用于0.1mM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）的诱导表达。用Ni-NTA亲和色谱纯化CEA-CD16a VHH抗体，并通过SDS-PAGE进行分析。

通过Superdex 75 10/300 GL（GE health，货号17-5174-01）以0.5 ml/min的流速进行凝胶过滤。将蛋白质标记物（Sigma Aldrich，货号MWGF200）上样作为凝胶过滤分析的标准对照。

动态光散射（DLS）：以830 nm的光源波长和150°的固定散射角下运行的DynaPro读板仪（美国怀亚特）进行DLS测量。以25℃至75℃的运行温度测量约50 µL样品。

结果：

我们先前已经通过将抗CD16a VHH与抗CEA VHH15连接而构建了双特异性抗体BiSS。BiSS双特异性抗体在体外和体内均表现出有效的抗肿瘤活性，表明该双特异性抗体形式可用于评估成双特异性形式的抗CD16a VHH活性。因此，通过用选定的分别具有柔性接头（GGGGS）3（在抗CD16a VHH和抗CEA VHH之间）的抗CD16a VHH将BiSS中的抗CD16a VHH替换（图2a），将六种不同的抗CD16a VHH（图1）用于构建双特异性抗体（SBC74-SBC79）。

通过Ni-NTA亲和层析纯化抗体，并在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中4℃进行交换至少12h。SBC75-79在SDS-PAGE上以单体的预期分子量约〜36KD的单条带运行。SBC74的大小几乎是预期大小的一半，表明已降解（图2b）。因此，没有进一步表征SBC74。

为了进一步表征被纯化的SBC75-79，进行了凝胶过滤。双特异性抗体SBC77以约〜36KD分子大小的单峰运行，表明大多数的SBC77成单体形式（图2c）。对于双特异性抗体SBC75（）、SBC76、SBC78、SBC79和BiSS观察到相似的结果。

为了进一步表征SBC75-79，通过DLS测量双特异性抗体的解链温度。SBC77的半径在50 °C以下没有变化，而在50 °C以上则明显增加（图2d）。对于其他双特异性抗体SBC75，SBC76、SBC78、SBC79和BiSS也观察到了相似的结果。

实施例4 CEA-CD16a VHH抗体的生物学活性

细胞培养和动物

CEA阳性癌细胞系LS174T和HT29（人结肠癌细胞系）以及CEA阴性癌细胞系SKOV3（人卵巢癌细胞系）购自上海中国科学院典型培养物保藏中心。HT29和SKOV3在含10％HI胎牛血清（Gibco，Life Technologies，美国）和1％青霉素/链霉素（HyClone）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，Gibco，Life Technologies，中国）中培养； LS174T也在RPMI-1640培养基（Gibco, Life Technologies, 中国）中培养，该培养基也含10％HI胎牛血清和1％青霉素/链霉素。

通过用Ficoll-Plaque Plus（GE health）的梯度离心法从健康供体中制备新鲜的人外周血单核细胞（PBMC）。使用EasySep人NK细胞富集试剂盒（PB）(Stem cell Co.Ltd,Vancouver, Canada)，根据制造商的说明分离新鲜的NK细胞。

非肥胖型糖尿病重症合并免疫缺陷疾病（NOD/SCID）的4-5周龄18-22g雌性小鼠购自维通利华实验动物技术有限公司(北京)并饲养在中山大学动物实验中心（室温20-26°C，相对湿度40％-70％，12小时昼夜节律）。

抗CEA-CD16a双特异性抗体能够识别CEA和CD16抗原

流式细胞术分析：为了进行流式细胞术分析，将LS174T和SKOV3细胞用0.25％的胰蛋白酶消化并收集。每个样品收集5×10⁵个细胞，然后用1 mL冰冷的PBS+0.2％BSA洗涤两次。将团块重悬于200 µL冰冷的PBS+0.2％BSA中。在每个试管中，加入抗CEA-CD16a VHHs作为一抗。将抗His PE（BioLegend，货号652504）用作二抗。然后在FC500（Beckman Coulter）上进行流式细胞术分析。

试验：执行ELISA方法以确定双特异性抗体与hCD16a之间的相互作用。简而言之，将双特异性抗体SBC75-79和BiSS在含100 µL PBS（pH 7.4）缓冲液中的96孔板上每孔5 µg包被过夜，然后用封闭缓冲液（PBS + 0.2％BSA）在37°C孵育2小时。用含有0.05％Tween-20（pH 7.2）的PBS洗涤3次后，将CD16a-Avi（Sino Biological，10389-H27H1-B）加入并孵育。在洗涤3次之后，使用抗链霉亲和素-HRP（R＆D，1：40 v/v）进行检测。在450nm处测量吸光度。使用Graphpad Prism 5分析数据。

结果

为了确定抗CEA-CD16a（SBC75-SBC79）双特异性抗体是否可以结合肿瘤抗原CEA，使用CEA阳性细胞系LS174T和CEA阴性细胞系SKOV3进行了流式细胞术分析。阳性对照BiSS和抗CEA-CD16a（SBC75-SBC79）在CEA阳性细胞系LS174T上显示阳性染色，而在CEA阴性细胞系SKOV3上没有染色（图3a）。

然后进行ELISA试验以检查双特异性抗体是否可以结合CD16a蛋白（图3b）。所有双特异性抗体SBC75、SBC76、SBC77、SBC78和SBC79都能以相似的强度结合CD16a（图3b）。没有包被CD16a（作为阴性对照）示出对每种双特异性抗体都没有结合，表明了双特异性抗体具有特异性结合。BiSS（作为阳性对照）的抗CD16a VHH部分对hCD16a的Kd值为10×10^-9 mol/L，比SBC75-79的结合强度都低，这表明SBC75-79的结合强度比BiSS中的抗CD16 VHH的结合强度高。

抗CEA-CD16a双特异性抗体在表达CEA的细胞中介导有效的细胞毒活性

体外细胞毒性试验：简而言之，将肿瘤细胞以每孔约2500个细胞接种到96孔板中，并在37℃，5％CO₂下孵育6小时。然后将25000个NK细胞和不同浓度的抗体与生长培养基混合，并加入到每个孔中。72小时后，使用Cell Counting Kit-8试剂（Dojindo，CK04）。孵育1-4小时后，通过TECAN酶标仪测量OD450nm。使用以下公式计算靶细胞的存活率（％）：[（活靶细胞（样品）-培养基）/（活靶细胞（对照）-培养基）]。

结果：

为了评估抗CEA-CD16a双特异性抗体是否可以介导肿瘤细胞的杀伤，进行了细胞毒性试验。在具有NK细胞的CEA阴性细胞SKOV3中未观察到细胞毒性（图4）。当将各个抗CD16aVHHs与NK细胞一起使用时，在CEA阳性细胞LS174T中未观察到细胞毒性（图4）。 对于CEA阳性细胞LS174T，在存在NK细胞的情况下，所有双特异性抗体均表现出有效的肿瘤细胞杀伤作用，而在没有NK细胞的情况下，未观察到细胞杀伤作用（图5）。

为了进一步评估抗CEA-CD16a双特异性抗体的细胞毒性，对剂量依赖性细胞杀伤作用进行了研究（图5）。无论双特异性抗体SBC75-SBC79的浓度如何，在CEA阴性细胞SKOV3中均未观察到细胞毒性（图5a和5b）。对于CEA阳性细胞LS174T和HT29，在NK细胞存在的情况下，所有双特异性抗体均表现出有效的肿瘤细胞杀伤作用（图5a）。在5种不同的双特异性抗体中，SBC77示出了最强的杀伤能力。因此，进一步评估了剂量依赖性细胞杀伤作用（图5b）。与阳性对照BiSS抗体相比，SBC77对高CEA表达的LS174T细胞和低CEA表达的HT29细胞均显示较高的细胞毒性（图5b）。对于有NK细胞的抗CD16a VHH，在LS17T和HT29细胞中都未观察到细胞杀伤作用（图5b）。

抗CEA-CD16a双特异性抗体SBC77在体内抑制肿瘤生长

体内肿瘤生长抑制试验：在共移植模型中，收获LS174T人结肠癌细胞，洗涤两次，然后重悬于PBS中。然后将该胞与新鲜分离的人外周血单核细胞（PBMC）混合，并皮下注射到NOD/ SCID小鼠的右腹，其中每只小鼠的总体积为200 µL 1×10⁶个 LS174T细胞和5×10⁶个PBMC细胞。移植后，腹腔给药（i.p.）抗体（20 µg/小鼠或5 µg/小鼠）或溶媒对照（PBS）（每组n =5）。然后在接下来的10天内每两天对动物进行治疗。

在另一项研究中，使用EasySep人NK细胞富集试剂盒(Stem cell Co. Ltd,Vancouver, Canada)将新鲜制备的PBMC的NK细胞耗竭。然后将该细胞（NK阴性细胞）与LS174T细胞（每只小鼠总体积为200 µL的5×10⁶ NK阴性PBMC细胞和1×10⁶ LS174T细胞）混合，并皮下注射到NOD/SCID的右腹。当肿瘤体积达到50-100 mm³时，每2天腹腔给药（i.p.）SBC77（20 µg/小鼠）或PBS（每组n = 5）。每两天测量动物体重和肿瘤体积。使用公式（宽度²×长度）/2计算肿瘤体积。

结果：

为了进一步研究抗CEA-CD16a双特异性抗体是否可以在体内抑制肿瘤细胞的生长，SBC77被用于评估Nod/Scid小鼠中的抗肿瘤活性。之后，使Nod / Scid小鼠移植LS174T细胞和新鲜分离的人PBMC。观察到了肿瘤的快速生长。SBC77在较低剂量（每只动物5微克）下示出最小的肿瘤生长抑制作用，但在高剂量（每只动物20微克）下示出有效的肿瘤生长抑制作用（图6a）。在用低剂量或高剂量的SBC77处理的这些小鼠中均未观察到明显的体重减轻和毒性。这些数据表明，SBC77在异种移植小鼠模型中可以有效地抑制肿瘤的生长。

为了进一步分析SBC77体内功效是否需要NK细胞，从新鲜分离的人PBMC中将NK细胞耗竭。然后将LS174T细胞和NK阴性PBMC细胞移植到NOD/SCID小鼠上。每两天用SBC77或溶媒PBS治疗小鼠。用SBC77治疗未观察到明显的肿瘤生长抑制作用（图6b）。这些数据证实需要NK细胞来在体内赋予SBC77的肿瘤的抑制作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 非同（成都）生物科技有限公司

<120> 抗CD16a抗原的VHH及含有其的双特性纳米抗体

<130> 191447CN

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<170> PatentIn version 3.5

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<223> 抗CD16a VHH

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<223> 5'-抗-CEA VHH- 抗CD16a VHH-3'

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<223> 抗-CD16a VHH的CDR1

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<213> Artificial Sequence

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<223> 抗-CD16a VHH的CDR1

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<223> 抗-CD16a VHH的CDR1

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<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗-CD16a VHH的CDR1

<400> 17

Ala Ser Gly Ala Ile Val Ser Arg Ser Cys Met Gly

1 5 10

<210> 18

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗-CD16a VHH的CDR2

<400> 18

Ala Ile Leu Pro Leu Ser Thr Thr Pro Val Tyr Ala Gly Ser

1 5 10

<210> 19

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗-CD16a VHH的CDR2

<400> 19

Ala Met Ser Val Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10

<210> 20

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗-CD16a VHH的CDR2

<400> 20

Ser Ile Asp Arg Asn Gly Asn Ile Asp Tyr Thr Glu Ser

1 5 10

<210> 21

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗-CD16a VHH的CDR2

<400> 21

Ala Ile Ala Ser Asp Gly Ser Lys Ala Tyr Ala Asp Ser

1 5 10

<210> 22

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗-CD16a VHH的CDR2

<400> 22

Gly Ile Phe Leu Ser Asp Gly Arg Thr Thr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10

<210> 23

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗-CD16a VHH的CDR3

<400> 23

Ala Ala Ala Arg Arg Gly Thr Asn Ala Phe Leu Thr His Asp Lys Tyr

1 5 10 15

Gly Tyr

<210> 24

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗-CD16a VHH的CDR3

<400> 24

Ala Ser Arg Arg Gly Gly Gly Tyr Cys Tyr Pro Ala Tyr Arg Leu Asp

1 5 10 15

Phe Tyr His

<210> 25

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗-CD16a VHH的CDR3

<400> 25

Ala Ala Pro Trp Ala Gly Val Tyr Cys Ala Ala Ser Leu Arg Glu Ser

1 5 10 15

Asp Tyr Lys Phe

20

<210> 26

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗-CD16a VHH的CDR3

<400> 26

Ala Ala Lys Arg Gly Arg Trp Phe Leu Val Gln Ser Asp Arg Val Asp

1 5 10 15

<210> 27

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗-CD16a VHH的CDR3

<400> 27

Ala Ala Asn Trp Arg Arg Trp Leu Tyr Gly Ala Thr Cys Glu Ala Thr

1 5 10 15

Asn Asp Tyr Asn

20