一种检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用 (Preparation method and application of photoelectrochemical biosensor for detecting alpha-lactalbumin ) 是由 陈志伟 孔玲 李灿国 朱琪颖 姜蒙 常慧琴 刘红亮 张秀珍 于 2021-02-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种检测乳制品致敏原α-乳白蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法,属于功能纳米材料,食品分析以及光电化学生物传感技术领域。将CdWO-4-CdS异质结复合材料固定在ITO电极表面,应用聚多巴胺作连接剂固定致敏原α-乳白蛋白抗体,有效提高光电流响应及其灵敏度,通过层层组装方法,利用CdWO-4-CdS异质结良好的光电活性以及α-乳白蛋白与α-乳白蛋白抗体间的特异性结合,实现α-乳白蛋白的超灵敏检测,对于乳品中α-乳白蛋白的分析检测应用具有重要的意义。(The invention relates to a preparation method of a photoelectrochemical immunosensor for detecting dairy product allergen alpha-lactalbumin, belonging to the technical field of functional nano materials, food analysis and photoelectrochemical biosensing. Mixing CdWO 4 the-CdS heterojunction composite material is fixed on the surface of an ITO electrode, polydopamine is used as a connecting agent to fix an allergen alpha-lactalbumin antibody, the photocurrent response and the sensitivity of the photocurrent response are effectively improved, and the layer-by-layer assembly method is adopted and utilizedCdWO 4 The good photoelectric activity of the CdS heterojunction and the specific combination between the alpha-lactalbumin and the alpha-lactalbumin antibody realize the ultra-sensitive detection of the alpha-lactalbumin, and have important significance for the analysis and detection application of the alpha-lactalbumin in the dairy product.)
技术领域
本发明属于生物分析化学、纳米材料、免疫分析和光电化学生物传感技术领域，提供了一种检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用。具体是采用水热法合成CdWO4-CdS异质结作为抗体捕获基底，应用聚多巴胺作连接剂固定致敏原α-乳白蛋白抗体，制备一种检测α-乳白蛋白的无标型光电化学生物传感器。
背景技术
牛奶过敏是最重要的过敏反应之一，牛奶也是食品中最常见的过敏原之一，其特征是对牛奶蛋白产生强烈的IgE反应。2岁以下儿童CMA患病率约为2.5 %。CMA对儿童来说是一个严重的问题，因为牛奶是他们补充蛋白质的重要来源，严格避免使用牛奶是不可行的，代替牛奶也是不现实的。此外，严重过敏可能会持续到成年期，因此引起过敏消费者的注意。牛奶中过敏原，α-乳白蛋白是牛奶中的主要过敏原之一。
α-乳白蛋白是一种Ca2+结合蛋白，在人与牛之间存在72 %以上的序列同源性，具有重要的生理作用和营养意义。α-乳白蛋白含有丰富的人体必需氨基酸，尤其是色氨酸和半胱氨酸，它们是血清素的前体。它还具有许多支链氨基酸，例如异亮氨酸和亮氨酸，它们与肌肉中的蛋白质合成有关。但α-乳白蛋白能引起约30-35 %的IgE介导的牛奶过敏。目前尚无食物过敏的治疗方法，因此，准确检测牛奶中α-乳白蛋白的含量对于牛奶的质量控制和预防牛奶过敏非常重要。
目前，高效液相色谱法是乳品工业中检测乳清蛋白的常用方法，液相色谱-质谱联用法由于其高分辨率和短分析时间而被用于分析乳蛋白。但是这些方法需要预处理以分离靶蛋白，迫切需要开发响应速度快、选择性好、灵敏度高、成本低的替代方法。光电化学免疫传感器以其选择性和敏感性好、分析速度快、背景影响小等优点在生物分析领域受到广泛关注。
对于光电化学免疫传感器来说，灵敏度是评价其性能的一个指标。提高灵敏度的方法多种多样，其中增加初始信号是最有效的方法之一。CdWO4是一种重要的光电活性材料，由于其稳定性、合适的带隙和成本较低，但其光电活性受限于电子空穴对分离能力差、比表面积小、表面吸附能力弱。因此，有必要进一步优化CdWO4的光电活性。在本发明中采用CdS进行敏化，合成CdWO4-CdS异质结更有利于电荷的分离和转移，增强其光电响应。
本发明利用光电化学分析法，以CdS进行敏化，合成CdWO4-CdS异质结，增强其可见光吸收，得到光电活性显著提高的复合材料，通过层层自组装方法，将聚多巴胺、α-乳白蛋白抗体、牛血清白蛋白和α-乳白蛋白抗原组装到CdWO4-CdS异质结复合材料上，利用CdWO4-CdS异质结良好的光电活性以及α-乳白蛋白与α-乳白蛋白抗体间的特异性结合，构建了一种基于CdWO4-CdS的α-乳白蛋白光电化学传感器。该传感器具有优异的光电化学活性，具有灵敏度高、线性范围宽、检出限低、检测快速、制备过程相对简单等优点，实现了对α-乳白蛋白的超灵敏分析，对于乳品中α-乳白蛋白的分析检测应用具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用，实现了α-乳白蛋白的超灵敏检测。本发明的目的之一是提供一种检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的制备方法。本发明的目的之二是制备的光电化学免疫传感器实现对α-乳白蛋白的超灵敏检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤：
（1）制备CdWO4-CdS异质结；
（2）制备检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的工作曲线。
其中步骤（1）制备CdWO4-CdS异质结包括：
取0.5~1.5 mmol CH4N2S和0.5~1.5 mmol Na2WO4·2H2O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液A；0.5~1.5 mmol Cd(CH3COO)2·2H2O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液B；在磁力搅拌下，将溶液A逐滴滴加到溶液B中，搅拌2小时后，将白色悬浮液转移到转移到50毫升聚四氟乙烯反应釜中在160 ℃反应24 h，将所得混合物离心洗涤去离子水、无水乙醇各3次，然后在50 ℃下真空干燥；
其中步骤（2）制备无标型检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的工作曲线包括：
①将2.5 cm×0.8 cm ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；
②将8 ~ 12 μL、3 ~ 7 mg / mL CdWO4-CdS悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟；
③将3 ~ 5 μL、含1 mg/mL多巴胺盐酸盐的pH 8.5 Tris-HCl溶液滴加至CdWO4-CdS修饰的电极表面，室温下反应50 ~ 70分钟，超纯水冲洗电极表面；
④滴加3 ~ 5 μL 10 μg/mL的α-乳白蛋白抗体溶液，反应20 ~ 40分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑤继续滴加3 ~ 5 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 ~ 40 分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑥继续滴加3 ~ 5 μL、0.001 ~ 10 ng/mL的α-乳白蛋白，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干，制得一种基于CdWO4-CdS的α-乳白蛋白的无标型光电化学生物传感器，于4℃冰箱中储存备用；
本发明所用的原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）本发明通过基于CdWO4-CdS异质结构建了一种新颖的光电化学免疫传感器用于乳品中致敏原α-乳白蛋白的检测。使用CdS敏化CdWO4原位生长异质结的方法。
（2）该免疫传感器对α-乳白蛋白检测灵敏度高，线性范围从0.001 ng/mL到10 ng/mL，检测限低，为0.17 pg·mL-1。制备的免疫传感器稳定性高，重现性好。
（3）本发明为α-乳白蛋白的早期检测提供了一种新颖可行的检测方法，操作简单，检测快捷，可用于实际样品的检测。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此
实施例1制备CdWO4-CdS异质结，步骤如下：
取0.5 mmol CH4N2S和0.5 mmol Na2WO4·2H2O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液A；0.5 mmol Cd(CH3COO)2·2H2O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液B；在磁力搅拌下，将溶液A逐滴滴加到溶液B中，搅拌2小时后，将白色悬浮液转移到转移到50毫升聚四氟乙烯反应釜中在160 ℃反应24 h，将所得混合物离心洗涤去离子水、无水乙醇各3次，然后在50℃下真空干燥。
实施例2制备CdWO4-CdS异质结，步骤如下：
取1.0 mmol CH4N2S和1.0 mmol Na2WO4·2H2O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液A；1.0 mmol Cd(CH3COO)2·2H2O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液B；在磁力搅拌下，将溶液A逐滴滴加到溶液B中，搅拌2小时后，将白色悬浮液转移到转移到50毫升聚四氟乙烯反应釜中在160 ℃反应24 h，将所得混合物离心洗涤去离子水、无水乙醇各3次，然后在50℃下真空干燥。
实施例3制备CdWO4-CdS异质结，步骤如下：
取1.5 mmol CH4N2S和1.5 mmol Na2WO4·2H2O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液A；1.5 mmol Cd(CH3COO)2·2H2O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液B；在磁力搅拌下，将溶液A逐滴滴加到溶液B中，搅拌2小时后，将白色悬浮液转移到转移到50毫升聚四氟乙烯反应釜中在160 ℃反应24 h，将所得混合物离心洗涤去离子水、无水乙醇各3次，然后在50℃下真空干燥。
实施例4制备无标型检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的工作曲线，步骤如下：
①将2.5 cm ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；
②将8 μL、3 mg/mL CdWO4-CdS悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟；
③将3 μL、含1 mg/mL多巴胺盐酸盐的pH 8.5 Tris-HCl溶液滴加至CdWO4-CdS修饰的电极表面，室温下反应50分钟，超纯水冲洗电极表面；
④滴加3 μL 10 μg/mL的α-乳白蛋白抗体溶液，反应20分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑤继续滴加3 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 min后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑥继续滴加3 μL、0.001 ~ 10 ng/mL的α-乳白蛋白，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于CdWO4-CdS的α-乳白蛋白的无标型光电化学生物传感器，于4 ℃冰箱中储存备用。
实施例5制备无标型检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的工作曲线，步骤如下：
①将2.5 cm ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；
②将10 μL、5 mg/mL CdWO4-CdS悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟；
③将4 μL、含1 mg/mL多巴胺盐酸盐的pH 8.5 Tris-HCl溶液滴加至CdWO4-CdS修饰的电极表面，室温下反应60分钟，超纯水冲洗电极表面；
④滴加4 μL 10 μg/mL的α-乳白蛋白抗体溶液，反应30分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑤继续滴加4 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应30 min后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑥继续滴加4 μL、0.001 ~ 10 ng/mL的α-乳白蛋白，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于CdWO4-CdS的α-乳白蛋白的无标型光电化学生物传感器，于4 ℃冰箱中储存备用。
实施例6制备无标型检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的工作曲线，步骤如下：
①将2.5 cm ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；
②将12 μL、7 mg/mL CdWO4-CdS悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟；
③将5 μL、含1 mg/mL多巴胺盐酸盐的pH 8.5 Tris-HCl溶液滴加至CdWO4-CdS修饰的电极表面，室温下反应70分钟，超纯水冲洗电极表面；
④滴加5 μL 10 μg/mL的α-乳白蛋白抗体溶液，反应40分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑤继续滴加5 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应40 min后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑥继续滴加5 μL、0.001 ~ 10 ng/mL的α-乳白蛋白，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于CdWO4-CdS的α-乳白蛋白的无标型光电化学生物传感器，于4 ℃冰箱中储存备用。
实施例7如权利要求l所述的一种检测α-乳白蛋白的的无标型光电化学生物传感器的制备方法及应用，其特征在于，用于α-乳白蛋白的检测，检测步骤如下：
①使用电化学工作站的三电极系统进行信号测定，测试溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为5.0 ~ 8.0的0.1 mol/L的抗坏血酸磷酸盐缓冲溶液；
②采用i-t法对不同浓度的标品α-乳白蛋白进行检测，设置电压为0 V，运行时间为50 s，激发光源的为LED，记录电流的变化，绘制工作曲线；
③将待测样品稀释之后代替 ② 中标准品进行检测，根据光电流响应强度和工作曲线，得到待测样品中α-乳白蛋白的含量。