一种低电位的电化学发光核酸检测方法
阅读说明：本技术 一种低电位的电化学发光核酸检测方法 (Low-potential electrochemical luminescence nucleic acid detection method ) 是由 邹桂征 董双田 于 2020-12-21 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种低电位的电化学发光核酸检测方法。本发明以谷胱甘肽与柠檬酸钠双稳定剂稳定的包被硫化锌的铜铟硫纳米晶作为电化学发光标记物,采用形成三明治夹心结构的核酸杂交复合物、并借助捕获DNA末端巯基与金电极表面原子形成Au-S键方式将包被硫化锌的铜铟硫纳米晶固定于金电极表面得到传感器电极。固定有包被硫化锌的铜铟硫纳米晶传感器电极可以水合肼作为共反应剂,实现低电位的电化学发光核酸检测。本发明检测方法的电化学发光电位为0.32V,具有优异的检测灵敏度和选择性。(The invention provides a low-potential electrochemical luminescence nucleic acid detection method. The sensor electrode is obtained by taking the copper indium sulfide nanocrystalline coated with zinc sulfide and stabilized by glutathione and sodium citrate bi-stabilizing agent as an electrochemical luminescence marker, adopting a nucleic acid hybridization compound forming a sandwich structure, and fixing the copper indium sulfide nanocrystalline coated with zinc sulfide on the surface of a gold electrode by capturing DNA terminal sulfhydryl and atoms on the surface of the gold electrode to form an Au-S bond. The copper indium sulfide nanocrystalline sensor electrode fixed with the coated zinc sulfide can use hydrazine hydrate as a coreactant to realize low-potential electrochemical luminescence nucleic acid detection. The electrochemical luminescence potential of the detection method is 0.32V, and the detection method has excellent detection sensitivity and selectivity.)
技术领域
本发明涉及一种低电位的电化学发光核酸检测方法，属于分析技术方法领域。
背景技术
电化学发光(ECL)技术已在商业化生化分析和临床诊断领域获得应用。常规ECL技术通常采用在较高电位(大于1.0V)下氧化ECL发光物与共反应剂的方式产生光辐射，但电化学干扰严重且对电极的电化学耐受性造成不利影响。因此，低电位的ECL传感对推动相关技术的更广泛应用具有重要价值。
目前商业化生化分析与临床分析通常采用钌联吡啶/三丙胺体系，该体系的ECL电位为1.2V，电化学干扰严重。鞠熀先团队开发了甲硅烷基聚合物/三丙胺体系，该体系的ECL电位为0.78V(Anal.Chem.2015,88(1),845–850.)，已被用于多巴胺检测。魏琴团队于2019年开发出了金纳米簇/三乙胺体系，构建了降钙素检测的传感器，该传感器的ECL电位为0.87V(ACS Sens.2019,4(7),1909–1916.)。但上述新开发的ECL体系的发光电位依然较高，需要进一步开发低电位的ECL新体系并构建相关的检测方法。
发明内容
针对现有技术的不足，尤其是大多数ECL体系发光电位较高的局限性，本发明以谷胱甘肽与柠檬酸钠双稳定剂稳定的包被硫化锌的铜铟硫纳米晶为ECL标记物，采用形成三明治夹心结构核酸杂交复合物的形式将上述包被硫化锌的铜铟硫纳米晶固定枝接于金电极表面，提供了一种低电位(0.32V)的电化学发光核酸检测方法，该检测方法具有优异的检测灵敏度和选择性。
术语说明：
目标DNA：本发明所述的目标DNA(t-DNA)指特定基因(单链)。
捕获DNA：本发明所述的捕获DNA(c-DNA)指上述特定基因某一片段的一条互补链，并且标记有巯基。
探针DNA：本发明所述的探针DNA(p-DNA)指上述特定基因某一片段的一条互补链，并标记有氨基，且其核苷酸序列与捕获DNA不同。
本发明的技术方案如下：
一种低电位的电化学发光核酸检测方法，包括步骤如下：
(1)传感器电极的制备
i、以氯化铜为铜源、氯化铟为铟源、硫化钠为硫源，以谷胱甘肽和柠檬酸钠作为稳定剂，通过双稳定剂法获得发光强度较低的铜铟硫纳米晶核层；然后以硫化锌为壳层将铜铟硫纳米晶核层进行包被，获得发光强度较强的硫化锌包被铜铟硫纳米晶[email protected] NCs；
ii、以金电极作为工作电极，将捕获DNA标记在金电极表面制得Au/c-DNA；
iii、[email protected] NCs标记探针DNA，得到p-DNA/[email protected]；
iv、基于碱基互补配对原理，目标DNA被Au/c-DNA中的捕获DNA捕获固定，然后p-DNA/[email protected]与目标DNA特异性结合，即制备得到传感器电极；
(2)ECL核酸检测
以步骤(1)制备的传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，以含15-25mmol/L的水合肼(N2H4·H2O)、0.05-0.2mol/L硝酸钾的PBS缓冲溶液为电解液，进行电化学发光测试。根据测试得到的电化学发光曲线的最大光强与标准目标DNA水溶液的浓度关系绘制工作曲线，通过与工作曲线的比对可得出待测水溶液中目标DNA的浓度；同时，还可根据测试得到的电化学发光曲线判断基因突变。
根据本发明，优选的，步骤(1)i中[email protected] NCs的制备步骤如下：
(a)将谷胱甘肽(GSH)、柠檬酸钠(TSC)、氯化铜、氯化铟和硫化钠溶解于水中得混合液，升温至90-100℃反应30-60分钟，得CuInS2核层溶液；
(b)将醋酸锌、硫脲和谷胱甘肽溶于水中得混合液，调节pH至6.0得ZnS壳层溶液；
(c)将ZnS壳层溶液和CuInS2核层溶液混合均匀，90-100℃反应40-60分钟；然后经离心、洗涤即得[email protected] NCs。
优选的，步骤(a)中，所述谷胱甘肽和柠檬酸钠摩尔比为1:6-10，优选为1:8；氯化铜、氯化铟和硫化钠的摩尔比为5：20：31；谷胱甘肽和氯化铜的摩尔比为1-3:1，优选为2:1。
优选的，步骤(a)混合液中，谷胱甘肽浓度为0.5-1.5mmol/L，优选为1mmol/L。
优选的，步骤(a)中，所述反应温度为95℃，反应时间为45分钟。
优选的，步骤(b)混合液中，所述醋酸锌、硫脲和谷胱甘肽的摩尔比为1:1:1-2，优选为1:1:1.5；所述醋酸锌的浓度为35-45mmol/L，优选为40mmol/L。
优选的，步骤(b)中，用NaOH水溶液调节pH。
优选的，步骤(a)、(b)中的谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽。
优选的，步骤(c)中，ZnS壳层溶液中的醋酸锌和CuInS2核层溶液中的氯化铜的摩尔比为5-15:1，优选为10:1。
优选的，步骤(c)中，所述反应温度为95℃，反应时间为50分钟。
根据本发明，优选的，步骤(1)ii中Au/c-DNA的制备步骤如下：
(a)将金电极置于食人鱼溶液中浸泡5-15分钟，经水清洗、干燥后用粒径0.5μm的氧化铝粉末抛光，然后经超纯水清洗、电化学清洗、无菌水清洗、干燥即得经清洗处理的金电极；
(b)将捕获DNA(c-DNA)水溶液和三(2-羧乙基)膦(TCEP)水溶液混合均匀，37℃下孵育60-90分钟，得c-DNA/TCEP溶液；将c-DNA/TCEP溶液滴在经清洗处理的金电极表面，37℃下孵育8～10小时以使c-DNA一端的巯基和金电极之间形成稳定的Au-S键，经无菌水清洗以除去未反应的c-DNA，即得Au/c-DNA。
优选的，步骤(a)中，所述电化学清洗方法如下：将超纯水清洗后的金电极置于含0.3-0.7mol/L NaOH水溶液的电解池中，以1.0V/s的扫速在-0.35至-1.35V的电势范围内扫描400～1000圈以进一步断裂Au-S键，然后，将金电极置于含0.2-0.8mol/L H2SO4水溶液的电解池中，以1.0V/s的扫速在-0.35至1.5V的电势范围内扫描30-60圈，从而使被食人鱼溶液强氧化后的金电极被还原。
优选的，步骤(b)中，捕获DNA水溶液的浓度为0.5-1.5μmol/L，三(2-羧乙基)膦水溶液的浓度为5-15mmol/L；进一步优选的，捕获DNA水溶液的浓度为1μmol/L，三(2-羧乙基)膦水溶液的浓度为10mmol/L；捕获DNA和三(2-羧乙基)膦的摩尔比为1:50-200，优选为1:100。
上述Au/c-DNA中c-DNA的固定量要足量，至少是需要检测的目标DNA摩尔量的1000倍，目的是使目标DNA全部被捕获，这样改变目标DNA浓度时才会形成稳定的且具有规律性的信号。
根据本发明，优选的，步骤(1)iii中[email protected] NCs标记探针DNA的制备步骤如下：
将[email protected] NCs水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合分散均匀后室温活化0.5-1小时，然后离心得到经活化的[email protected] NCs；将所得经活化的[email protected] NCs复溶于无菌水中，加入探针DNA(p-DNA)，得混合液；所得混合液在37℃下孵育2-4小时，使探针DNA一端的氨基和[email protected] NCs表面的羧基通过酰胺化反应连接，经离心分离即得p-DNA/[email protected]。
优选的，[email protected] NCs水溶液的浓度为10-20mg/mL。
优选的，[email protected] NCs和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量比为3：1-3；1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐和羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1。
优选的，混合液中探针DNA的浓度为0.5-1.5mmol/L；混合液中经活化的[email protected]的浓度为20-40mg/L，优选为30mg/L。
根据本发明，优选的，步骤(1)iv中传感器电极的制备步骤如下：
(a)将目标DNA(t-DNA)水溶液滴于Au/c-DNA表面，在37℃下孵育反应2-4小时，经无菌水清洗以除去未反应的目标DNA，得到经修饰的电极；
(b)将(a)所得经修饰的电极置于p-DNA/[email protected]水溶液中，37℃下反应2-4小时，经无菌水清洗以除去未反应的p-DNA/[email protected]，得到传感器电极。
优选的，步骤(a)中，目标DNA(t-DNA)水溶液的浓度为0.0005nmol/L-1nmol/L。
优选的，步骤(b)中，p-DNA/[email protected]水溶液的浓度为20-40mg/mL；p-DNA/[email protected]应足量，以使经修饰的电极中目标DNA全部与p-DNA/[email protected]特异性结合。
根据本发明优选的，步骤(2)中，进行电化学发光测试以检测目标DNA水溶液浓度的方法，包括步骤：
I：配制不同标准浓度的目标DNA水溶液，利用不同标准浓度的目标DNA水溶液按步骤(1)的方法制备传感器电极；以所得传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，以含15-25mmol/L的水合肼(N2H4·H2O)、0.05-0.2mol/L硝酸钾的PBS缓冲溶液为电解液，采用循环伏安法驱动产生电化学发光，得到电化学发光曲线；
II：依据步骤(I)所得电化学发光曲线上最高光强与目标DNA标准浓度之间的关系，绘制工作曲线；
III：利用待测目标DNA水溶液按步骤(1)的方法制备传感器电极；以所得传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，以含15-25mmol/L的水合肼(N2H4·H2O)、0.05-0.2mol/L硝酸钾的PBS缓冲溶液为电解液，采用循环伏安法驱动产生电化学发光，得到电化学发光曲线；根据所得电化学发光曲线上最高光强和步骤(II)所得工作曲线得到待测目标DNA水溶液中目标DNA的浓度。
优选的，所述PBS缓冲溶液的pH为7.4，PBS缓冲溶液中硝酸钾的浓度为0.1mol/L。
本发明的技术特点如下：
本发明采用谷胱甘肽、柠檬酸钠、ZnS包被的铜铟硫纳米晶，即[email protected] NCs为标记物；[email protected] NCs表面的羧基(羧基是由谷胱甘肽和柠檬酸钠提供)可枝接探针DNA一端的氨基，实现探针DNA的标记。
本发明选用一端标记有巯基的捕获DNA，其以Au—S键的结合方式实现捕获DNA在金电极表面的固定。
本发明基于碱基互补配对原理，实现目标DNA被捕获DNA捕获和探针DNA与目标DNA的结合。
本发明的有益效果：
1、本发明所提供的核酸检测方法灵敏度高；目标DNA在1pmol/L～0.5nmol/L浓度范围内的ECL信号响应会呈现出良好的线性关系，且检测限可达0.5pM，因此可通过检测电化学发光信号判断目标DNA的浓度。
2、本发明所提供的核酸检测方法选择性高。本发明构建的低电位电化学发光DNA传感器用电极是基于碱基互补配对原理构建的，当目标DNA浓度已知时，若传感器产生的信号响应大大降低，即可作出该基因已发生突变的判断。
3、本发明所提供的核酸检测方法操作简单，重复性好，所组成的DNA传感器对临床早期诊断癌症具有重要的科学意义和应用价值。
4、本发明所提供的核酸检测方法的电化学发光电位位于0.32V，大大降低了电化学的干扰，减小了电极损耗。
附图说明
图1为实施例1中所制的[email protected] NCs的荧光光谱图(横坐标为波长，纵坐标为荧光强度)。
图2为实施例1中所制的[email protected] NCs的紫外光谱图(横坐标为波长，纵坐标为吸光度)。
图3为实施例1中所制的[email protected] NCs的高倍透射电镜照片。
图4为实施例1中所制的[email protected] NCs的差分脉冲伏安曲线图(横坐标为电压，纵坐标为电流)。
图5为实施例1中空白样的电化学发光光强图(电流-电压以及电化学发光强度-电压图)。
图6为实施例1中所制的[email protected] NCs的电化学发光光强图(电流-电压以及电化学发光强度-电压图)。
图7为实施例1中经处理的金电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线图(横坐标为电压，纵坐标为电流)。
图8为实施例1中制得的Au/c-DNA的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线图(横坐标为电压，纵坐标为电流)。
图9为实施例1步骤(4)i中制得的经修饰的电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线图(横坐标为电压，纵坐标为电流)。
图10为实施例1中制得的传感器电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线图(横坐标为电压，纵坐标为电流)。
图11为实施例1中所制的[email protected] NCs的循环伏安驱动的电化学发光光谱图谱(横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
图12为实施例1中所制的传感器电极的循环伏安驱动的电化学发光光谱图谱(横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
图13为实施例1中所制的传感器电极的电化学发光曲线(横坐标为电压，纵坐标为电化学发光强度)。
图14为实施例2中所制的传感器电极的电化学发光曲线(横坐标为电压，纵坐标为电化学发光强度)。
图15为实施例3中所制的传感器电极的电化学发光曲线(横坐标为电压，纵坐标为电化学发光强度)。
图16为实施例4中所制的传感器电极的电化学发光曲线(横坐标为电压，纵坐标为电化学发光强度)。
图17为实施例5中所制的传感器电极的电化学发光曲线(横坐标为电压，纵坐标为电化学发光强度)。
图18为实施例6中所制的传感器电极的电化学发光曲线(横坐标为电压，纵坐标为电化学发光强度)。
图19为实施例7中所制的传感器电极的电化学发光曲线(横坐标为电压，纵坐标为电化学发光强度)。
图20为实施例8中所制的传感器电极的电化学发光曲线(横坐标为电压，纵坐标为电化学发光强度)。
图21为实施例9中所制的传感器电极的电化学发光曲线(横坐标为电压，纵坐标为电化学发光强度)。
图22为对比例1中不同配体制备的传感器电极的电化学发光曲线对比图(横坐标为电压，纵坐标为电化学发光强度)。
图23为对比例2所制的传感器电极的电化学发光曲线(横坐标为电压，纵坐标为电化学发光强度)。
图24为试验例1中得到的工作曲线(横坐标为目标DNA水溶液的浓度，纵坐标为电化学发光强度)。
图25为试验例2中传感器电极的选择性对比图(纵坐标为电化学发光强度)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例中所用原料如无特殊说明，均为市购产品。
实施例中，目标DNA(t-DNA)指K-RAS基因(单链)。K-RAS基因是RAS基因家族成员之一，与肿瘤的生成、增殖、迁移、扩散以及血管生成均有关系。捕获DNA(c-DNA)指K-RAS基因某一片段的一条互补链，并且标记有巯基，可市购获得。探针DNA(p-DNA)指K-RAS基因某一片段的一条互补链，并标记有氨基，且其核苷酸序列与捕获DNA不同，可市购获得。
实施例1
一种低电位的电化学发光核酸检测方法，其中传感器电极的制备步骤如下：
(1)[email protected] NCs的制备
在剧烈搅拌下，依次将20μmol还原型谷胱甘肽，160μmol柠檬酸钠，10μmolCuCl2·2H2O，40μmol InCl3·4H2O和62μmol Na2S溶解于20mL超纯水中，使反应混合物在95℃下反应45分钟以获得CuInS2核层溶液。
将醋酸锌(0.8mmol)，硫脲(0.8mmol)和还原型谷胱甘肽(1.2mmol)溶解在20mL超纯水中，用1mol/L NaOH水溶液将溶液的pH调节至6.0，得ZnS壳层溶液。
将2.5mL ZnS壳层溶液引入CuInS2核层溶液中，混合均匀，并在95℃下反应50分钟，然后离心分离得到沉淀、所得沉淀用异丙醇在8500rpm下离心洗涤3次，即得[email protected]。
可将所得[email protected] NCs分散在超纯水中以获得浓度为15mg/mL单分散的[email protected]水溶液，将其保存在4℃的冰箱当中。
测试上述[email protected] NCs水溶液的荧光光谱图，如图1所示。由图1可知[email protected] NCs的最大发射峰在638nm，半峰宽约为120nm。
测试上述[email protected] NCs水溶液的紫外光谱图，如图2所示。由图2可知500nm左右显示一个宽肩峰。
将上述[email protected] NCs水溶液滴于铜网观察形貌，高倍透射电镜照片如图3所示。由图3可知[email protected] NCs的粒径尺寸均匀，且为3.5nm左右。
以金电极为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，以含20mmol/L的水合肼(N2H4·H2O)、15mg/L [email protected] NCs、0.1mol/L硝酸钾的PBS缓冲溶液为电解液，采用循环伏安法(电势窗口为0～0.8伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0V，初扫向正)得到电化学发光光谱图谱如图11所示。由图11可知[email protected] NCs在PBS缓冲液中的单分散状态的发光波长为740nm。
以金电极为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，以含15mg/L [email protected] NCs、0.1mol/L硝酸钾的PBS缓冲溶液为电解液，采用差分脉冲伏安法得到电化学谱图如图4所示，由图4可知[email protected] NCs在0.30V左右可被氧化。
以金电极为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，以含20mmol/L的水合肼(N2H4·H2O)、15mg/L [email protected] NCs、0.1mol/L硝酸钾的PBS缓冲溶液为电解液，采用循环伏安法(电势窗口为0～0.8伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0V，初扫向正)得到电化学发光光强图如图6所示；同时设置空白样(即电解液中不加[email protected] NCs)，按上述方法得到电化学发光光强图如图5所示。由图可知，[email protected] NCs在PBS缓冲液中的单分散状态的发光电位为0.79V。
(2)捕获DNA在金电极表面的标记，即Au/c-DNA的制备
(i)金电极的清洗处理。将质量分数为98.3％的浓硫酸和质量浓度为30％的过氧化氢以7：3的体积比配置成食人鱼溶液。将金电极放在食人鱼溶液中浸泡10分钟，经水清洗、干燥后用粒径0.5μm的氧化铝粉末抛光，然后用大量超纯水清洗金电极表面。然后对金电极进行进一步电化学清洗：首先，将金电极置于含0.5mol/L NaOH水溶液的电解池中，以1.0V/s的扫速在-0.35至-1.35V的电势范围内扫描400-1000圈，直至曲线走向趋于稳定。然后，将金电极置于含0.5mol/L H2SO4水溶液的电解池中，以1.0V/s的扫速在-0.35至1.5V的电势范围内扫描30-60圈至曲线走向趋于稳定。最后，用大量无菌水冲洗金电极表面并用氮气吹干，即得经清洗处理的金电极。
上述经清洗处理的金电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在5mmol/L铁氰化钾溶液中扫描的循环伏安曲线如图7所示，由图7可知，经处理的金电极的电位差为71mV。
(ii)捕获DNA在金电极表面的固定。取300μL 1μmol/L捕获DNA(c-DNA)水溶液和3μL 10mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)水溶液置于1.5mL离心管中，混合均匀，并在37℃下孵育60分钟，得c-DNA/TCEP溶液。取30μL c-DNA/TCEP溶液滴在经清洗处理的金电极表面，37℃下孵育9小时，用无菌水清洗电极以除去未反应的捕获DNA，即可得到Au/c-DNA。
上述Au/c-DNA为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在5mmol/L铁氰化钾溶液中扫描的循环伏安曲线如图8所示，由图8可知电位差相对图7增大，表明捕获DNA成功接到了电极上。
(3)p-DNA/[email protected]的制备
将1mL 30mg/mL [email protected] NCs水溶液、0.01g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及0.01g羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合分散均匀后室温活化0.5小时，离心后所得沉淀复溶于750μL无菌水中，加入250μL 5mM探针DNA(p-DNA)水溶液，在37℃下孵育3小时并离心即得p-DNA/[email protected]；将所得p-DNA/[email protected]分散至1mL无菌水中得到p-DNA/[email protected]分散液。
(4)Au/c-DNA/t-DNA/p-DNA/[email protected]的制备
(i)：取30μL待检测的目标DNA(t-DNA)水溶液(1nmol/L)滴于Au/c-DNA表面，在37℃孵育箱内反应3小时，目标DNA(t-DNA)水溶液和Au/c-DNA通过碱基互补配对结合，用无菌水清洗以除去未反应的t-DNA，得到经修饰的电极；
上述所得经修饰的电极为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在0.5mmol/L铁氰化钾水溶液中扫描的循环伏安曲线如图9所示，由图9可知电位差相对图8进一步增大，表明目标DNA成功接到了电极上。
(ii)：将(i)所得的经修饰的电极引入200μL上述p-DNA/[email protected]分散液中，修饰电极上的目标DNA可与探针DNA通过碱基互补配对结合，37℃下反应3小时并用无菌水清洗以除去未反应的p-DNA/[email protected]，得到传感器电极。
上述所得传感器电极为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极；在0.5mmol/L铁氰化钾水溶液中扫描的循环伏安曲线如图10所示，由图10可知电位差相对于图9进一步增大，表明p-DNA/[email protected]成功接到了电极上。
上述所得传感器电极为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极；以含20mmol/L的水合肼(N2H4·H2O)、0.1mol/L硝酸钾的PBS缓冲溶液为电解液，采用循环伏安法(电势窗口为0～0.8伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0V，初扫向正)得到电化学发光光谱图谱如图12所示，由图12可知，所得电极和单分散状态[email protected] NCs(图11)的发光波长相差不大，说明[email protected] NCs可用于生物传感。
以本实施例制备的传感器电极为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，以含20mmol/L的水合肼(N2H4·H2O)、0.1mol/L硝酸钾的PBS缓冲溶液为电解液，采用循环伏安法(电势窗口为0～0.8伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0V，初扫向正)驱动电化学发光得到的电化学发光图像如图13所示，由图13可知最大光强为30400左右，发光电位低至0.32V。
实施例2
一种低电位的电化学发光核酸检测方法，其中传感器电极的制备步骤如实施例1所述，所不同的是：步骤(4)中待检测的目标DNA(t-DNA)水溶液的浓度为0.5nmol/L；其它步骤和条件与实施例1一致。
本实施例制备的传感器电极按实施例1方法得到电化学发光图像如图14所示，由图14可知最大发光强度为26413左右。
实施例3
一种低电位的电化学发光核酸检测方法，其中传感器电极的制备步骤如实施例1所述，所不同的是：步骤(4)中待检测的目标DNA(t-DNA)水溶液的浓度为0.1nmol/L；其它步骤和条件与实施例1一致。
本实施例制备的传感器电极按实施例1方法得到电化学发光图像如图15所示，由图15可知最大发光强度为21003左右。
实施例4
一种低电位的电化学发光核酸检测方法，其中传感器电极的制备步骤如实施例1所述，所不同的是：步骤(4)中待检测的目标DNA(t-DNA)水溶液的浓度为0.05nmol/L；其它步骤和条件与实施例1一致。
本实施例制备的传感器电极按实施例1方法得到电化学发光图像如图16所示，由图16可知最大发光强度为17523左右。
实施例5
一种低电位的电化学发光核酸检测方法，其中传感器电极的制备步骤如实施例1所述，所不同的是：步骤(4)中待检测的目标DNA(t-DNA)水溶液的浓度为0.01nmol/L；其它步骤和条件与实施例1一致。
本实施例制备的传感器电极按实施例1方法得到电化学发光图像如图17所示，由图17可知最大发光强度为12155左右。
实施例6
一种低电位的电化学发光核酸检测方法，其中传感器电极的制备步骤如实施例1所述，所不同的是：步骤(4)中待检测的目标DNA(t-DNA)水溶液的浓度为0.005nmol/L；其它步骤和条件与实施例1一致。
本实施例制备的传感器电极按实施例1方法得到电化学发光图像如图18所示，由图18可知最大发光强度为9523左右。
实施例7
一种低电位的电化学发光核酸检测方法，其中传感器电极的制备步骤如实施例1所述，所不同的是：步骤(4)中待检测的目标DNA(t-DNA)水溶液的浓度为0.001nmol/L；其它步骤和条件与实施例1一致。
本实施例制备的传感器电极按实施例1方法得到电化学发光图像如图19所示，由图19可知最大发光强度为3665左右。
实施例8
一种低电位的电化学发光核酸检测方法，其中传感器电极的制备步骤如实施例1所述，所不同的是：步骤(4)中待检测的目标DNA(t-DNA)水溶液的浓度为0.0005nmol/L；其它步骤和条件与实施例1一致。
本实施例制备的传感器电极按实施例1方法得到电化学发光图像如图20所示，由图20可知最大发光强度为534左右。
实施例9
一种低电位的电化学发光核酸检测方法，其中传感器电极的制备步骤如实施例1所述，所不同的是：步骤(4)中待检测的目标DNA(t-DNA)水溶液的浓度为0nmol/L；其它步骤和条件与实施例1一致。
本实施例制备的传感器电极按实施例1方法得到电化学发光图像如图21所示，由图21可知发光强度为217左右。
实施例10
一种低电位的电化学发光核酸检测方法，其中传感器电极的制备步骤如实施例1所述，所不同的是：步骤(4)中待检测的目标DNA为全碱基错配的目标DNA；其它步骤和条件与实施例1一致。
实施例11
一种低电位的电化学发光核酸检测方法，其中传感器电极的制备步骤如实施例1所述，所不同的是：步骤(4)中待检测的目标DNA为三碱基错配的目标DNA；其它步骤和条件与实施例1一致。
实施例12
一种低电位的电化学发光核酸检测方法，其中传感器电极的制备步骤如实施例1所述，所不同的是：步骤(4)中待检测的目标DNA为单碱基错配的目标DNA；其它步骤和条件与实施例1一致。
对比例1
一种电化学发光核酸检测方法，其中传感器电极的制备步骤如实施例2所述，所不同的是：实施例2中的还原型谷胱甘分别替换为相同摩尔量的硫代水杨酸、二巯基丁二酸、N-乙酰-L-半胱氨酸、L-高半胱氨酸；其它步骤和条件与实施例2一致。
上述制备的传感器电极按实施例1方法得到电化学发光对比图如图22所示，由图可知，本发明谷胱甘肽制备得到的铜铟硫纳米晶具有更优异的效果。
对比例2
一种传感器电极的制备方法，步骤如下：将1mL 30mg/mL [email protected] NCs水溶液、0.01g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及0.01g羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合分散均匀后室温活化0.5小时；然后加入0.1mL 0.02mol/L的巯基乙胺水溶液，室温反应2.5小时后得到反应液，通过酰胺化反应巯基乙胺实现与铜铟硫纳米晶的结合；将上述所得反应液滴到金电极表面，在室温下孵育8小时，通过巯基与金电极形成的Au-S键将铜铟硫纳米晶固定到金电极表面，从而制备得到传感器电极。
以上述传感器电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极，以含20mmol/L的水合肼(N2H4·H2O)、0.1mol/L硝酸钾的PBS缓冲溶液为电解液，电化学发光光强图如图23所示。由图可知，此时[email protected] NCs的发光电位为0.38V，说明将铜铟硫纳米晶直接固定到电极表面也会使电位降低，但是相比本发明方法所得到的传感器效果要差。
试验例1
一种低电位的电化学发光核酸检测方法，以检测目标DNA水溶液的浓度，包括步骤如下：
I：利用不同标准浓度的目标DNA水溶液制备得到传感器电极(实施例1-9)；以所得传感器电极为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，以含20mmol/L的水合肼(N2H4·H2O)、0.1mol/L硝酸钾的PBS缓冲溶液为电解液，采用循环伏安法驱动产生电化学发光，得到电化学发光曲线(即图13-图21)；
II：依据步骤(I)所得电化学发光曲线上最高光强与目标DNA标准浓度之间的关系，绘制工作曲线，如图24所示；
III：以待测目标DNA水溶液按实施例1方法制备的传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，以含20mmol/L的水合肼(N2H4·H2O)、0.1mol/L硝酸钾的PBS缓冲溶液为电解液，采用循环伏安法驱动产生电化学发光，得到电化学发光曲线；根据所得电化学发光曲线上最高光强和步骤(II)所得工作曲线得到待测目标DNA水溶液中目标DNA的浓度。
例如，所得电化学发光曲线上最高光强为21000，根据工作曲线得到待测目标DNA水溶液中目标DNA的浓度为0.1nmol/L。
试验例2
选择性检测：
分别以实施例1、实施例9-12制备的传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，以含20mmol/L的水合肼(N2H4·H2O)、0.1mol/L硝酸钾的PBS缓冲溶液为电解液，采用循环伏安法驱动产生电化学发光，得到电化学发光曲线，如图25所示。
由图25所示，本发明制得的传感器选择性良好，当有错配碱基存在时，电化学发光信号会产生强烈的响应，即信号响应大大降低，从而可以判断其产生了基因突变。