具体实施方式

本发明涉及运动效率改善组合物、疲劳减轻组合物、或动态视力改善组合物，这些组合物的特征在于，其含有植物来源提取物和/或植物来源加工品，所述植物来源提取物选自辣根提取物、番红花提取物、茶叶提取物、羽衣甘蓝提取物、蜂胶提取物、芥菜提取物、芝麻菜提取物和它们的混合物(优选为辣根提取物、进一步优选为辣根叶提取物)，所述植物来源加工品选自辣根加工品、番红花加工品、茶叶加工品、羽衣甘蓝加工品、蜂胶加工品、芥菜加工品、芝麻菜加工品和它们的混合物(优选为辣根加工品、进一步优选为辣根叶加工品)。

本发明中，植物来源提取物选自辣根提取物、番红花提取物、茶叶提取物、羽衣甘蓝提取物、蜂胶提取物、芥菜提取物和芝麻菜提取物。本发明中，植物来源提取物可以使用1种或组合使用多种。本发明中，“辣根提取物、番红花提取物、茶叶提取物、羽衣甘蓝提取物、蜂胶提取物、芥菜提取物、芝麻菜提取物和它们的混合物”中的“混合物”是指该列举的提取物的任意的组合。

本发明中，植物来源加工品选自辣根加工品、番红花加工品、茶叶加工品、羽衣甘蓝加工品、蜂胶加工品、芥菜加工品和芝麻菜加工品。本发明中，植物来源加工品可以使用1种或组合使用多种。本发明中，“辣根加工品、番红花加工品、茶叶加工品、羽衣甘蓝加工品、蜂胶加工品、芥菜加工品、芝麻菜加工品和它们的混合物”中的“混合物”是指该列举的加工品的任意的组合。

本发明中植物来源提取物是指：对原料(辣根(例如其叶部分)、番红花、茶叶(例如红茶叶)、羽衣甘蓝、蜂胶、芥菜、或芝麻菜)实施用于将山柰酚糖苷转化为山柰酚糖苷配基的酶处理(也可以使用能产生酶的微生物)和/或酸水解处理和提取处理而得到的提取物。植物来源提取物的制造也可以包括提取处理后的精制工序。

本发明中植物来源加工品是指：对原料(辣根(例如其叶部分)、番红花、茶叶(例如红茶叶)、羽衣甘蓝、蜂胶、芥菜、或芝麻菜)实施用于将山柰酚糖苷转化为山柰酚糖苷配基的酶处理(也可以使用能产生酶的微生物)和/或酸水解处理而得到的加工品且以不包括提取工序制造而成者。

本发明中辣根提取物是指：以辣根(Armoracia rusticana)作为原料而得到的植物来源提取物。本发明中辣根加工品是指以辣根(Armoracia rusticana)作为原料而得到的植物来源加工品。辣根的叶中包含大量山柰酚糖苷(例如山柰酚3-O-木糖基半乳糖苷)，因此优选使用叶部分作为原料。本发明中，辣根叶提取物和辣根叶加工品分别指：主要使用辣根的叶部分而制造的辣根提取物和辣根加工品。

本发明中番红花提取物是指以番红花(Crocus sativus)作为原料而得到的植物来源提取物。本发明中番红花加工品是指以番红花(Crocus sativus)作为原料而得到的植物来源加工品。

已知番红花中包含山柰酚7-O-β-d-吡喃葡萄糖苷(kaempferol 7-O-β-d-glucopyranoside)(Mini Rev Med Chem.11(4):298-344.2011)。

本发明中茶叶提取物是指以茶(Camellia sinensis)的叶(茶叶)作为原料而得到的植物来源提取物。本发明中茶叶加工品是指以茶(Camellia sinensis)的叶(茶叶)作为原料而得到的植物来源加工品。茶叶可以是未加工的，也可以是经干燥和/或发酵而成者(例如，绿茶叶、乌龙茶叶、红茶叶)。

已知茶叶中包含山柰酚3-O-(2-O-β-D-吡喃半乳糖基-6-O-α-L-吡喃鼠李糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(kaempferol 3-O-(2-O-β-D-galactopyranosyl-6-O-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranoside)、山柰酚3-O-(2-O-β-D-吡喃木糖基-6-O-α-L-吡喃鼠李糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(kaempferol 3-O-(2-O-β-D-xylopyranosyl-6-O-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranoside)、山柰酚3-葡糖基-(1→3)-鼠李糖基(1→6)半乳糖苷(kaempferol 3-glucosyl-(1→3)-rhamnosyl(1→6)galactoside)、山柰酚3-O-[2-香豆酰基-3-O-β-D-葡糖基-3-O-β-D-花青素鼠李葡糖苷](kaempferol3-O-[2-coumaroyl-3-O-β-D-glucosyl-3-O-β-D-glucosylrutinoside])(Mini Rev Med Chem.11(4):298-344.2011)。

本发明中羽衣甘蓝提取物是指以羽衣甘蓝(Brassica oleracea)作为原料而得到的植物来源提取物。本发明中羽衣甘蓝加工品是指以羽衣甘蓝(Brassica oleracea)作为原料而得到的植物来源加工品。

已知羽衣甘蓝中包含山柰酚3-芥子酰基-二葡萄糖苷-7-二葡萄糖苷(kaempferol3-sinapoyl-di-glucoside-7-di-glucoside)(Mini Rev Med Chem.11(4):298-344.2011)。

本发明中蜂胶提取物是指以蜂胶作为原料而得到的植物来源提取物。本发明中蜂胶加工品是指以蜂胶作为原料而得到的植物来源加工品。

本发明中芥菜提取物是指以芥菜(Brassica juncea)作为原料而得到的植物来源提取物。本发明中芥菜加工品是指以芥菜(Brassica juncea)作为原料而得到的植物来源加工品。

已知芥菜中包含山柰酚7-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)]-吡喃葡萄糖苷(kaempferol 7-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-glucopyranoside)(Mini Rev Med Chem.11(4):298-344.2011)。

本发明中芝麻菜提取物是指以芝麻菜(Eruca sativa)作为原料而得到的植物来源提取物。本发明中芝麻菜加工品是指以芝麻菜(Eruca sativa)作为原料而得到的植物来源加工品。

已知芝麻菜中包含山柰酚二-O-糖苷(kaempferol di-O-glycoside)(Mini RevMed Chem.11(4):298-344.2011)。

在制造植物来源提取物/加工品时，原料可以是未加工的状态，也可以是干燥品、粗干燥品，但从有效地对山柰酚或其糖苷进行酶处理/酸水解处理/提取的观点出发，优选利用常规方法将原料粉碎后使用。

提取方法没有特别限定，可以利用制剂学或食品工学的领域中通常使用的方法而进行。例如可列举出使用选自由乙醇、甲醇、丁醇、醚、乙酸乙酯和氯仿组成的组中的任一种以上的有机溶剂、或这些有机溶剂与水的混合溶剂进行提取。

植物体中通常包含比糖苷配基更多的糖苷，另一方面，通常除葡萄糖苷以外的糖苷比糖苷配基更不易在体内被吸收，因此本申请的植物来源提取物和植物来源加工品的制造中，包含用于将山柰酚糖苷转化为山柰酚糖苷配基的酶处理/酸水解处理工序。作为上述的植物来源提取物的原料中可能包含的山柰酚糖苷，可列举出葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、和它们的组合(例如，槐糖(葡萄糖+葡萄糖)、芸香糖(鼠李糖+葡萄糖)、新橙皮糖(鼠李糖+葡萄糖))在山柰酚的3位、6位和/或7位键合了O-糖苷的山柰酚糖苷。作为各原料中可能包含的糖苷的糖，可列举出：

番红花：葡萄糖；

茶叶：葡萄糖、半乳糖+鼠李糖+葡萄糖、木糖+鼠李糖+葡萄糖、半乳糖+葡萄糖、葡萄糖+芸香糖(鼠李糖+葡萄糖)；

羽衣甘蓝：槐糖(葡萄糖+葡萄糖)

芥菜：葡萄糖+葡萄糖+葡萄糖

芝麻菜：葡萄糖

辣根叶：半乳糖+木糖。

酶处理可以适宜组合使用适于将可能包含的糖苷转化为糖苷配基的酶、例如葡萄糖苷酶(glucosidase)、阿拉伯糖苷酶(arabinosidase)、鼠李糖苷酶(rhamnosidase)、木糖苷酶(xylosidase)、纤维素酶(cellulase)、橘皮苷酶(hesperidinase)、柚皮苷酶(naringinase)、葡糖醛酸酶(glucuronidase)、果胶酶(pectinase)、半乳糖苷酶(galactosidase)、淀粉葡糖苷酶(amyloglucosidase)、或淀粉酶(amylase)而进行。也可以适宜组合使用能产生该酶的微生物、例如曲霉(aspergillus)属、杆菌(bacillus)属、青霉(penicillium)属、根霉(rhizopus)属、根毛霉(rhizomucor)属、篮状菌(talaromyces)属、双歧杆菌(bifidobacterium)属、被孢霉(mortierella)属、隐球菌(cryptococcus)属、或细杆菌(microbacterium)属而进行酶处理。

例如，在辣根提取物的制造中，使用能产生葡萄糖苷酶和木聚糖酶(或可以使用能产生这些的微生物进行酶处理。

或者，可以通过酸水解处理将糖苷转化为糖苷配基。

本申请中，植物来源提取物和植物来源加工品中优选以高浓度包含山柰酚糖苷配基，包含能用作食品组合物或药物组合物的材料的程度(例如1mg/g以上、或3mg/g以上、优选为10mg/g以上、进一步优选为20mg/g以上、更优选为50mg/g以上)即可。植物来源提取物/加工品中可以残留有山柰酚糖苷。植物来源提取物和植物来源加工品中可以包含山柰酚3-O-葡萄糖苷。

植物来源提取物和植物来源加工品中的山柰酚糖苷配基的定量方法没有特别限定，可以利用常规方法进行，例如可以依据本申请实施例的试验例6的方法进行得到。

在植物来源提取物的制造中，提取工序和酶/酸水解处理的顺序和它们的次数没有特别限定，例如，

可以用溶剂提取原料，对得到的提取物进行酶/酸水解处理而制造；

可以对原料进行酶/酸水解处理，用溶剂提取得到的处理物而制造；或

也可以用溶剂提取原料，对得到的提取物进行酶/酸水解处理，用溶剂提取得到的处理物而制造。

这些制造方法均可以适宜对提取物进行精制处理和/或浓缩处理。

本发明中，植物来源提取物/加工品可以用水、醇、糖等稀释介质稀释，也可以是冷冻干燥的粉末。

例如，辣根提取物可通过下述(1)～(6)的工序制造。

(1)收获辣根叶后，进行清洗/杀菌，进行热风干燥。

(2)用包含0～50v/v％的水的乙醇提取干燥的辣根叶。

(3)将提取液吸附于树脂柱上，进行解吸、精制。

(4)用适合的酸或碱将精制液调节至pH3-7，在30-50℃下实施适合时间的基于水解酶的酶反应。

(5)以60℃以上使酶失活。

(6)将冷冻干燥而得到的物质作为辣根提取物(粉末)。

本发明的组合物中，植物来源提取物和/或加工品每次给予时，例如可以给予0.05mg～5g、优选给予0.1mg～3g、进一步优选给予0.5mg～2g、进而更优选给予10mg～1.5g。或作为该植物来源提取物和/或加工品的下限值的例子，可列举出0.05mg、0.1mg、0.5mg、10mg、20mg、50mg、100mg、200mg、500mg和700mg，作为上限值的例子，可列举出1g、1.5g、2g、3g和5g，该植物来源提取物和/或加工品的优选的范围可以通过该上限值和该下限值的组合来表示。

本发明的组合物中，植物来源提取物和/或加工品每1天可以给予例如0.05mg～10g、优选为0.1mg～7.5g、进一步优选为0.5mg～5g。作为该植物来源提取物和/或加工品的下限值的例子，可列举出0.05mg、0.1mg、0.5mg、10mg、20mg、50mg、200mg、500mg和700mg，作为上限值的例子，可列举出1g、1.5g、2g、3g、5g、7.5g和10g，该植物来源提取物和/或加工品的优选的范围可以通过该上限值和该下限值的组合来表示。每1天能给予的植物来源提取物和/或加工品可以通过1次进行给予，也可以分成多次(例如2次、3次、4次和5次)进行给予。

本发明的组合物中(饮食品、药物组合物等)中可能包含的、植物来源提取物和/或加工品(或山柰酚)的量、每次给予时所给予的植物来源提取物和/或加工品(或山柰酚)的量、及每1天所给予的植物来源提取物和/或加工品(或山柰酚)的量只要是能发挥目标效果的范围就没有特别限制，可以根据组合物的形态、给药次数、对象的健康状态等进行适宜选择。本发明的组合物的给药期间只要是能发挥目标效果的范围就没有特别限制，可以是单次，也可以持续给药。为了持续地获得改善运动效率、减轻疲劳或改善动态视力的效果，长期持续性给予本发明的组合物是理想的，例如可以给予2天、3天、1周、10天、1个月、3个月以上。

本发明的组合物中，还取决于组合物的总重量，对于植物来源提取物和/或加工品，以山柰酚计，包含例如0.1mg～200mg、优选为0.5mg～100mg、进一步优选为1mg～30mg、进而更优选为2mg～10mg。作为该山柰酚的下限值的例子，可列举出0.1mg、0.5mg、1mg、2mg和2.5mg，作为上限值的例子，可列举出200mg、150mg、100mg、50mg、30mg、25mg、15mg、10mg、5mg、3mg和2.5mg，该山柰酚的优选的范围可以通过该上限值和该下限值的组合来表示。

本发明的组合物中，每次给予植物来源提取物和/或加工品时，以山柰酚计，可以给予例如0.1mg～200mg、优选为0.5mg～100mg、进一步优选为1mg～30mg、进而更优选为2mg～10mg。作为该山柰酚的下限值的例子，可列举出0.1mg、0.5mg、1mg、2mg和2.5mg，作为上限值的例子，可列举出200mg、150mg、100mg、50mg、30mg、25mg、15mg、10mg、5mg、3mg和2.5mg，该山柰酚的优选的范围可以通过该上限值和该下限值的组合来表示。

本发明的组合物中，植物来源提取物和/或加工品以每1天的山柰酚计，可以给予例如0.1mg～600mg、优选为0.5mg～200mg、进一步优选为1mg～100mg。作为该山柰酚的下限值的例子，可列举出0.1mg、0.5mg、1mg、2mg和2.5mg，作为上限值的例子，可列举出600mg、300mg、200mg、150mg、100mg、50mg、30mg、25mg、15mg、10mg、5mg、3mg和2.5mg，该山柰酚的优选的范围可以通过该上限值和该下限值的组合来表示。每1天能给予的山柰酚可以通过1次进行给予，也可以分成多次(例如2次、3次、4次和5次)进行给予。

本发明的组合物优选制成经口给药制剂，制剂剂型没有特别限定，例如可以为片剂、颗粒剂、胶囊剂、粉末剂、咀嚼片、点心糖果类(曲奇饼(cookie)、饼干(biscuits)、巧克力糖果、薯片、蛋糕、口香糖、糖果(candy)、软糖(Gummi)、馒头、羊羹、布丁、果冻、酸奶、冰激凌、果子露(sherbet)等)、面包、面类、米饭类、谷物食品、饮料(液体制剂、清凉饮料、碳酸饮料、营养饮料、粉末饮料、果实饮料、乳饮料、果冻饮料等)、汤(粉末、冻干)、豆酱汁(粉末、冻干)等通常的食品形态。

本发明的组合物可以为饮食品或药物组合物，可以用作例如功能性标示食品、特定保健用食品、健康食品、营养辅助食品(营养增强剂)、医疗用食品等饮食品。

本发明的组合物除了植物来源提取物/加工品之外，可以添加药学上可接受的基剂、载体、能用于食品的添加物等并制成经口给药制剂。本发明的组合物中使用的除植物来源提取物/加工品以外的材料期望不损害山柰酚的稳定性，进而期望不损害本发明的组合物的目标效果(例如氧利用效率改善、改善运动效率、减轻疲劳、或改善动态视力)。

本发明中“氧利用效率改善”是指利用氧的能力提高。作为具体例，可列举出：本申请实施例中记载的耗氧效率(VO₂/VE)的增加、及在规定的运动强度下的氧利用量(VO₂)的增加、氧气摄取效率梯度(OUES的增加)、和最大氧利用量(VO_2peak)的增加。

本说明书中“运动”是指活动身体，包括日常的家务、搬用东西、上下楼梯、运动等所有的方式。

本发明中“改善运动效率”是指在所有运动情况下更舒适地活动身体。例如可列举出：可以在持久力改善、更舒适的状态下持续长时间运动、或在减轻了气喘的状态下更舒适地运动。作为改善运动效率的指标的例子，可列举出在规定的运动强度下的氧利用量(VO₂)的增加、耗氧效率(VO₂/VE)的增加、氧气摄取效率梯度(OUES的增加)、最大氧利用量(VO_2peak)的增加、最大运动负荷量的增加、在规定的氧利用量(VO₂)下的运动强度的减少、或主观运动强度的减少(这些术语在本申请实施例进行说明)。

为了改善运动效率而给予本发明的组合物的情况下，其用量和给药次数没有特别限定，例如可以以上述所示例的给药量、给药次数、给药期间进行给予。

本发明中减轻疲劳是指在所有运动情况下能够以更少的疲劳进行运动。作为减轻疲劳的指标的例子，可列举出运动强度或主观运动强度(这些术语在本申请实施例中进行说明)减少。

为了减轻疲劳而给予本发明的组合物的情况下，其用量和给药次数没有特别限定，例如可以以上述所示例的给药量、给药次数、给药期间进行给予。

本发明中改善动态视力是指防止动态视力的降低或改善动态视力。

为了改善动态视力而给予本发明的组合物的情况下，其用量和给药次数没有特别限定，例如可以以上述所示例的给药量、给药次数、给药期间进行给予。

本发明的组合物可以具有改善氧利用效率(即利用氧的能力提高)的效果。因此，本发明的组合物也可以用作氧利用效率改善剂。

本发明中，低氧状态是指体内缺氧的状态，例如可列举出动脉血氧饱和度低于95％的状态。

本发明的组合物在低氧状态的对象中也可以具有改善氧利用效率的效果，因此即使对于该低氧状态的对象，也可有助于改善运动效率、减轻疲劳、改善动态视力。

本发明的组合物的给药对象没有特别限定，优选为人。优选：在运动前后、在室外工作前后、日常的劳动(上下楼梯、家务等)前后、感到无法消除疲劳时、希望有效地工作时、由于年龄增长而活动变缓慢时进行给予。

实施例

以下，列举制剂例和试验例对本发明进行说明，但本发明不限定于这些。

[制剂例1]曲奇饼(山柰酚含量2.5mg/1片)

将这些混合，利用常规方法在烘箱温度约140℃下焙烧20分钟，制造了曲奇饼。每1片曲奇饼的山柰酚的含量为2.5mg(基于HPLC)。

昆诺阿藜提取物*：通过酶处理将山柰酚糖苷转化为山柰酚糖苷配基的提取物。

＜试验例1：蹬自行车的渐增负荷运动试验＞

对25位健康成年男性，将3种剂量的含山柰酚的曲奇饼状食品(以山柰酚计，包含2.5mg、10mg、25mg)和安慰剂曲奇饼状食品(不含山柰酚)作为试验食品，1天1次连续摄取8天，通过交叉法重复4组。在摄取第1天(单次摄取时)和摄取第8天(连续摄取时)的试验食品摄取3小时后，边采集呼出气体边实施蹬自行车的渐增负荷运动，计算出氧利用量。在运动中，监测了心率和主观的运动强度。另外，在运动前后测定了动态视力。以下示出各评价项目的详情。

＜1：氧利用量(VO₂)的评价＞

由吸入的气体(大气)中包含的氧气的量与呼出气体中包含的氧气的量的差值计算出氧利用量(VO₂)(mL/分钟/kg)。

在蹬自行车的渐增负荷运动中，在踏板的重量接近待检者的极限时，心率(HR)会最大化。将由安静时的心率增加到最大心率作为运动强度的100％，绘制了各运动强度下的氧利用量(VO₂)。

即，例如运动强度50％HR时，下式：

100×(x-安静时心率)/(最大心率-安静时心率)＝50％HR

中的表示“x”的心率时的氧利用量(VO₂)成为“运动强度50％HR中的氧利用量(VO₂)”。

结果示于图1。

如图1所示，确认了：在单次摄取后和连续摄取后，与未摄取山柰酚时相比，摄取了山柰酚时的氧利用量在运动强度50％、60％、70％、80％、90％和100％中均增加。

＜2：耗氧效率(VO₂/VE)的评价＞

利用下式计算出耗氧效率。

耗氧效率(VO₂/VE)＝氧利用量/换气量

如图2所示，确认了：与未摄取山柰酚时相比，在单次摄取后和连续摄取后摄取了山柰酚时的耗氧效率(VO₂/VE)均增加。

＜3：氧气摄取效率梯度(OUES)的评价＞

利用从渐增负荷运动开始时起每1分钟的换气量和VO₂计算出氧气摄取效率梯度(OUES)。具体而言，得到绘制了横轴为“换气量(VE)的log值”、纵轴为“VO₂”的线性图，将其线性函数图的斜率作为OUES。详细而言，参照非专利文献5。

如图3所示，确认了：在单次摄取后和连续摄取后，与未摄取山柰酚时相比，摄取了山柰酚时的氧气摄取效率梯度(OUES)均增加，在渐增负荷运动过程中能够有效地利用氧气。

＜4：最大氧利用量(VO_2peak)的评价＞

如图4所示，在单次摄取后和连续摄取后，与未摄取山柰酚时相比，摄取了山柰酚时的最大氧利用量(VO_2peak)(mL/分钟/kg)增加。

＜5：最大运动负荷量的评价＞

如图5所示，在单次摄取后和连续摄取后，与未摄取山柰酚时相比，摄取了山柰酚时的最大运动负荷量(踏板的重量(watt、瓦特))增加。

＜6：对日常生活中运动强度的影响＞

有上楼梯时和慢跑时的氧利用量(VO₂)通常分别为14mL/分钟/kg和24.5mL/分钟/kg的报道。

在渐增负荷运动中，评价了氧利用量(VO₂)分别相当于上楼梯和慢跑的14mL/分钟/kg和24.5mL/分钟/kg时的运动强度(％HR)和主观运动强度(RPE)。

氧利用量(VO₂)和运动强度(％HR)的计算方法与上述相同。

对于主观运动强度(RPE)，依据下表从渐增负荷运动开始时起每隔1分钟对待检者进行评价，将各待检者的回答值平均而算出。

如图6-1和图6-2所示，在相当于上楼梯时和慢跑时的氧利用量(VO₂)这两者中，在单次摄取后和连续摄取后，与未摄取山柰酚时相比，摄取了山柰酚时的运动强度和主观运动强度降低。

如上述1～6的评价结果所示，通过摄取含山柰酚的食品，在相同运动强度下氧利用量、氧利用效率增加。进而最大运动负荷量增大。另外，启示了如下可能性：假定在相同氧利用量下的运动强度的情况，心率降低，待检者的持久力得到改善而能够在没有气喘的情况下舒适地进行运动。如此运动效率得到改善，因此可认为待检者的疲劳感也减轻。实际上，通过摄取含山柰酚的食品，待检者主观的运动强度降低，减轻了气喘、疲劳感。因此，启示出本组合物能够用作气喘减轻组合物和/或持久力改善组合物。

＜7：对动态视力的影响＞

在渐增负荷运动之前和之后(运动后约1分钟以内)测定横向动态视力(DVA)和深度方向动态视力(KVA)，研究了对动态视力的影响。

(1)横向动态视力(DVA：Dynamic Visual Acuity)的测定

测定设备：

动态视力计HI-10Dynamic Vision Tester(兴和株式会社)

测定方法：

测定了以待检者为中心在圆弧上水平移动的Randold氏环可见的最快速度。目标物在每次旋转时会自动逐渐减速，在发现Randold氏环的破裂时，待检者按下手边的开关，回答出裂缝的方向(上下左右)。将以数字显示的此时的转速记载于记录用纸上，作为检测成绩。将结果示于图7。

＜试验例2：对低氧气环境下的ATP产生的影响＞

得到由马血清分化出的C₂C₁₂骨骼肌细胞，添加各种化合物(最终浓度20μM)或作为阴性对照的二甲基亚砜(DMSO)，在低氧孵化器(3％O₂)中培养24小时后，使用TOYO B-NetCo.,Ltd.制试剂盒(荧光素酶发光法)对细胞中的ATP含量进行定量。

活性值用将DMSO添加样品的ATP含量设为100％时的％值表示。

将结果示于图8。

＜试验例3：大鼠的山柰酚或山柰酚3-O-葡萄糖苷的影响＞

对9周龄雄性SD大鼠，每天早上9点经口给予山柰酚(KMP；1.0mg/kg体重)或山柰酚3-O-葡萄糖苷(K3G；以KMP糖苷配基换算值计为0.1、0.2或1mg/kg体重)，1天1次连续8天(以氧气21％进行喂养)。在给予第8天，对照组暴露于氧气21％下1小时后，除此以外的组暴露于氧气浓度12％下1小时后，摘取比目鱼肌(Sol)、全脑，测定了组织中的ATP含量。

将结果示于图9-1～图9-2。

＜试验例4：原料中包含的山柰酚和山柰酚糖苷的量＞

将辣根叶、番红花、红茶叶、羽衣甘蓝、蜂胶、芥菜和芝麻菜作为待检体，依据下述的方法测定了这些中包含的山柰酚和山柰酚糖苷的量。将结果示于图10。

(1)用电子天平称取待检体0.8g至50mL PP管中(N＝1～3)，用量筒分取70％乙醇水溶液40mL，进行添加/秤量。用Polytron型匀质器以室温、2000rpm悬浮1分钟。

(2)将悬浮液充分地反转混合，用1mL自动移液器将悬浮液1mL分注/秤量于14mL玻璃试管中(N＝1～3)。

(3)在1mL自动移液器中添加2N盐酸1mL，通过涡漩进行混合后，用加热块在100℃下加热20分钟(通过酸水解将山柰酚糖苷转化为山柰酚糖苷配基)。加热结束后冰冷5分钟以上。

(4)在通风橱内，通过分配器添加己烷5mL。用手水平地振荡20次。在大型冷却离心机中以4℃、12000rpm离心分离5分钟。

(5)在通风橱内，通过巴氏吸管废弃掉上层。通过分配器添加乙酸乙酯5mL。在振荡机中以室温、150rpm水平地振荡10分钟。在大型冷却离心机中以4℃、12000rpm离心分离5分钟。

(6)在通风橱内，通过巴氏吸管将上层回收至干固用的14mL玻璃试管中。回收的上层通过喷雾式氮气干固机在60℃下进行氮气干固。在下层通过分配器添加乙酸乙酯5mL。在振荡机中以室温、150rpm水平地振荡10分钟。

在大型冷却离心机中以4℃、12000rpm离心分离5分钟。

(7)取出干固用的14mL玻璃试管(也可以未完成干固)。在通风橱内，通过巴氏吸管将上层回收至干固用的14mL玻璃试管中。回收的上层通过喷雾式氮气干固机在60℃下进行氮气干固。

(8)干固结束后取出14mL玻璃试管，用1mL自动移液器添加70％乙醇水溶液1mL，通过涡流机使其溶解。在超声波发生装置中进行1分钟×2次超声波处理而通过涡流使其溶解。用1mL自动移液器将溶解液400mL添加至Mini-Uni过滤器中使其通过过滤器。

(9)供于HPLC分析。

＜试验例5：辣根提取物的制造＞

通过下述(1)～(6)的工序制造了辣根提取物。

(1)收获辣根叶后，进行清洗/杀菌，进行热风干燥。

(2)用50％乙醇提取干燥的辣根叶(山柰酚含量(以糖苷配基换算)11mg/g)并进行浓缩。

(3)将提取浓缩液吸附于树脂柱上及进行解吸，精制/浓缩了山柰酚。

(4)用适合的酸或碱将精制液调节至pH5.0，在50℃下实施适合时间的基于水解酶的酶反应。

(5)在80℃下使酶失活。

(6)将冷冻干燥而成者作为辣根提取物(粉末)。

＜试验例6：辣根提取物中的山柰酚的定量＞

利用下述的方法对试验例5中得到的辣根提取物(粉末、干燥重量)中包含的山柰酚糖苷配基的量进行定量。辣根提取物(粉末、干燥重量)中的山柰酚含量为161mg/g。

定量方法

(1)用电子天平称量待检体0.2g至50mL PP管中(N＝1～3)，用量筒分取70％乙醇水溶液40mL，进行添加/秤量。用Polytron型匀质器以室温、2000rpm悬浮1分钟。

(2)将悬浮液充分地反转混合，用1mL自动移液器将悬浮液1mL分注/秤量于14mL玻璃试管中(N＝1～3)。

(3)用1mL自动移液器添加超纯水1mL，通过涡漩进行混合后，用加热块在100℃下加热20分钟。加热结束后冰冷5分钟以上。

(4)在通风橱内，通过分配器添加己烷5mL。用手水平地振荡20次。在大型冷却离心机中以4℃、12000rpm离心分离5分钟。

(5)在通风橱内，通过巴氏吸管废弃掉上层。通过分配器添加乙酸乙酯5mL。在振荡机中以室温、150rpm水平地振荡10分钟。在大型冷却离心机中以4℃、12000rpm离心分离5分钟。

(6)在通风橱内，通过巴氏吸管将上层回收至干固用的14mL玻璃试管中。回收的上层通过喷雾式氮气干固机在60℃下进行氮气干固。在下层通过分配器添加乙酸乙酯5mL。在振荡机中以室温、150rpm水平地振荡10分钟。

在大型冷却离心机中以4℃、12000rpm离心分离5分钟。

(7)取出干固用的14mL玻璃试管(也可以未完成干固)。在通风橱内，通过巴氏吸管将上层回收至干固用的14mL玻璃试管中。回收的上层通过喷雾式氮气干固机在60℃下进行氮气干固。

(8)干固结束后取出14mL玻璃试管，用10mL自动移液器添加70％乙醇水溶液10mL，通过涡流使其溶解。在超声波发生装置中进行1分钟×2次超声波处理而通过涡流使其溶解。用1mL自动移液器将溶解液400mL添加至Mini-Uni过滤器中使其通过过滤器。

(9)供于HPLC分析。