具体实施方式

首先，定义本说明书中使用的术语。

在本说明书中，术语“碳原子数1至6的直链烷基”是指碳原子数1～6的任意的直链烷基，具体是指甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基或正己基。另一方面，在称为术语“碳原子数1至6的烷基”的情况下，是指碳原子数1～6的任意的直链、支链或环状的烷基。

在本说明书中，术语“碳原子数1至6的直链烷氧基”包含具有碳原子数1～6的任意的直链烷基的烷氧基。例如可以列举甲氧基、乙氧基、正丙氧基等。另一方面，在称为术语“碳原子数1至6的烷氧基”的情况下，是指碳原子数1～6的任意的直链、支链或环状的烷氧基。另外，在称为术语“可以被碳原子数1至6的直链烷氧基取代的碳原子数1至6的直链烷氧基”的情况下，是指上述“碳原子数1至6的直链烷氧基”以及构成“碳原子数1至6的直链烷氧基”的1个或1个以上的氢原子被可以为相同或不同的其他“碳原子数1至6的直链烷氧基”取代的烷基。作为这样的“可以被碳原子数1至6的直链烷氧基取代的碳原子数1至6的直链烷氧基”，例如可以列举甲氧基、乙氧基、正丙氧基、甲氧基甲氧基、乙氧基甲氧基、正丙氧基甲氧基、甲氧基乙氧基(例如2－甲氧基乙氧基)、乙氧基乙氧基(例如2－乙氧基乙氧基)、和正丙氧基乙氧基。

在本说明书中，术语“碳原子数1至6的氰基烷氧基”是指碳原子数1～6的任意的直链、支链或环状的烷氧基中的至少1个氢原子被氰基取代的基团。

在本说明书中，术语“碳原子数1至6的直链烷基硫基”包含具有碳原子数1～6的任意的直链烷基的烷基硫基。例如可以列举甲基硫基、乙基硫基、正丙基硫基等。另一方面，在称为术语“碳原子数1至6的烷基硫基”的情况下，是指碳原子数1～6的任意的直链、支链或环状的烷基硫基。

在本说明书中，术语“碳原子数1至6的直链烷基氨基”包含具有1个或2个具有碳原子数1～6的任意的直链烷基的烷基氨基的烷基氨基。例如可以列举甲基氨基、二甲基氨基、乙基氨基、甲基乙基氨基、二乙基氨基等。

在本说明书中，术语“可以形成支链或环的碳原子数1至7的烷基”包含碳原子数1～7的任意的直链烷基、碳原子数3～7的任意的支链烷基和碳原子数3～7的任意的环状烷基。有时也简称为“低级烷基”。例如作为碳原子数1～7的任意的直链烷基，可以列举甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基和正庚基，作为碳原子数3～7的任意的支链烷基，可以列举异丙基、异丁基、叔丁基、异戊基等，并且，作为碳原子数3～7的任意的环状烷基，可以列举环丁基、环戊基、环己基等。

在本说明书中，术语“可以形成支链或环的碳原子数2至7的烯基”包含碳原子数2～7的任意的直链烯基、碳原子数3～7的任意的支链烯基和碳原子数3～7的任意的环状烯基。有时也简称为“低级烯基”。例如作为碳原子数2～7的任意的直链烯基，可以列举乙烯基、1－丙烯基、2－丙烯基、1－丁烯基、2－丁烯基、1－戊烯基、2－戊烯基、3－戊烯基、4－戊烯基、1－己烯基等，作为碳原子数3～7的任意的支链烯基，可以列举异丙烯基、1－甲基－1－丙烯基、1－甲基－2－丙烯基、2－甲基－1－丙烯基、2－甲基－2－丙烯基、1－甲基－2－丁烯基等，并且，作为碳原子数3～7的任意的环状烯基，可以列举环丁烯基、环戊烯基、环己烯基等。

在本说明书中，术语“可以包含杂原子的碳原子数3至10的芳基”包含仅由烃构成的碳原子数6～10的任意的芳基、和构成该芳基的环结构的至少1个碳原子被杂原子(例如、氮原子、氧原子和硫原子以及它们的组合)取代的碳原子数3～12的任意的杂芳基。作为该碳原子数6～10的芳基，可以列举苯基、萘基、茚基、薁基等，并且，作为该碳原子数3～12的任意的杂芳基，可以列举吡啶基、吡咯基、喹啉基、吲哚基、咪唑基、呋喃基、噻吩基等。

在本说明书中，作为术语“具有可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基部分的芳烷基”的例子，可以列举苄基、苯乙基、萘甲基、3－苯基丙基、2－苯基丙基、4－苯基丁基、2－苯基丁基、吡啶基甲基、吲哚甲基、呋喃基甲基、噻吩基甲基、吡咯基甲基、2－吡啶基乙基、1－吡啶基乙基、3－噻吩丙基等。

在本说明书中，作为术语“酰基”的例子，可以列举脂肪族酰基和芳香族酰基。具体而言，作为脂肪族酰基的例子，可以列举甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰(Pentanoyl)基、特戊酰(Pivaloyl)基、戊酰(Valeryl)基、异戊酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、3－甲基壬酰基、8－甲基壬酰基、3－乙基辛酰基、3,7－二甲基辛酰基、十一酰基、十二酰基、十三酰基、十四酰基、十五酰基、十六酰基、1－甲基十五酰基、14－甲基十五酰基、13,13－二甲基十四酰基、十七酰基、15－甲基十六酰基、十八酰基、1－甲基十七酰基、十九酰基、二十酰基和二十一酰基这样的烷基羰基；琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基这样的羧基化烷基羰基；氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基这样的卤代低级烷基羰基；甲氧基乙酰基这样的低级烷氧基低级烷基羰基；(E)－2－甲基－2－丁烯酰基这样的不饱和烷基羰基。另外，作为芳香族酰基的例子，可以列举苯甲酰基、α－萘酰基、β－萘酰基这样的芳基羰基；2－溴苯甲酰基、4－氯苯甲酰基这样的卤代芳基羰基；2,4,6－三甲基苯甲酰基、4－甲苯酰基这样的低级烷基化芳基羰基；4－甲氧基苯甲酰基这样的低级烷氧基化芳基羰基；2－羧基苯甲酰基、3－羧基苯甲酰基、4－羧基苯甲酰基这样的羧基化芳基羰基；4－硝基苯甲酰基、2－硝基苯甲酰基这样的硝基化芳基羰基；2－(甲氧基羰基)苯甲酰基这样的低级烷氧基羰基化芳基羰基；4－苯基苯甲酰基这样的芳基化芳基羰基等。优选为甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、特戊酰基、苯甲酰基。

在本说明书中，作为术语“甲硅烷基”的例子，可以列举三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、异丙基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、甲基二异丙基甲硅烷基、甲基二叔丁基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基这样的三低级烷基甲硅烷基；二苯基甲基甲硅烷基、丁基二苯基丁基甲硅烷基、二苯基异丙基甲硅烷基、苯基二异丙基甲硅烷基这样的被1～2个芳基取代的三低级烷基甲硅烷基等。优选为三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基，更优选为三甲基甲硅烷基。

在本说明书中，作为术语“卤原子”，例如可以列举氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。优选为氟原子或氯原子。

在本说明书中，术语“核酸合成的氨基的保护基”、“核酸合成的羟基的保护基”、“被核酸合成的保护基保护的羟基”、“被核酸合成的保护基保护的磷酸基”、“被核酸合成的保护基保护的巯基”的“保护基”只要是在核酸合成时稳定并能够保护氨基、羟基、磷酸基或巯基的基团，就没有特别限制。具体是指在酸性或中性条件下稳定，能够通过加氢分解、水解、电解和光解这样的化学方法裂解的保护基。作为这样的保护基，例如可以列举低级烷基、低级烯基、酰基、四氢吡喃基或四氢噻喃基、四氢呋喃基或四氢硫代呋喃基、甲硅烷基、低级烷氧基甲基、低级烷氧基化低级烷氧基甲基、卤代低级烷氧基甲基、低级烷氧基化乙基、卤化乙基、被1～3个芳基取代的甲基、“被由低级烷基、低级烷氧基、卤原子或氰基取代了芳基环的1～3个芳基取代的甲基”、低级烷氧基羰基、“被卤原子、低级烷氧基或硝基取代的芳基”、“被卤原子或三低级烷基甲硅烷基取代的低级烷氧基羰基”、烯氧基羰基、“芳基环可以被低级烷氧基或硝基取代的芳烷基氧基羰基”等。

更具体而言，作为四氢吡喃基或四氢噻喃基，可以列举四氢吡喃－2－基、3－溴四氢吡喃－2－基、4－甲氧基四氢吡喃－4－基、四氢噻喃－4－基、4－甲氧基四氢噻喃－4－基等。作为四氢呋喃基或四氢硫代呋喃基，可以列举四氢呋喃－2－基、四氢硫代呋喃－2－基。作为低级烷氧基甲基，可以列举甲氧基甲基、1,1－二甲基－1－甲氧基甲基、乙氧基甲基、丙氧基甲基、异丙氧基甲基、丁氧基甲基、叔丁氧基甲基等。作为低级烷氧基化低级烷氧基甲基，可以列举2－甲氧基乙氧基甲基等。作为卤代低级烷氧基甲基，可以列举2,2,2－三氯乙氧基甲基、双(2－氯乙氧基)甲基等。作为低级烷氧基化乙基，可以列举1－乙氧基乙基、1－(异丙氧基)乙基等。作为卤化乙基，可以列举2,2,2－三氯乙基等。作为被1～3个芳基取代的甲基，可以列举苄基、α－萘基甲基、β－萘基甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、α－萘基二苯基甲基、9－蒽基甲基等。作为“被由低级烷基、低级烷氧基、卤原子或氰基取代了芳基环的1～3个芳基取代的甲基”，可以列举4－甲基苄基、2,4,6－三甲基苄基、3,4,5－三甲基苄基、4－甲氧基苄基、4－甲氧基苯基二苯基甲基、4,4′－二甲氧基三苯基甲基、2－硝基苄基、4－硝基苄基、4－氯苄基、4－溴苄基、4－氰基苄基等。作为低级烷氧基羰基，可以列举甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、异丁氧基羰基等。作为“被卤原子、低级烷氧基或硝基取代的芳基”，可以列举4－氯苯基、2－氯苯基、4－甲氧基苯基、4－硝基苯基、2,4－二硝基苯基等。作为“被卤原子或三低级烷基甲硅烷基取代的低级烷氧基羰基”，可以列举2,2,2－三氯乙氧基羰基、2－三甲基甲硅烷基乙氧基羰基等。作为烯氧基羰基，可以列举乙烯基氧基羰基、芳基氧基羰基等。作为“芳基环可以被低级烷氧基或硝基取代的芳烷基氧基羰基”，可以列举苄基氧基羰基、4－甲氧基苄基氧基羰基、3,4－二甲氧基苄基氧基羰基、2－硝基苄基氧基羰基、4－硝基苄基氧基羰基等。

在一个实施方式中，作为“核酸合成的羟基的保护基”，例如可以列举脂肪族酰基、芳香族酰基、被1～3个芳基取代的甲基、“被由低级烷基、低级烷氧基、卤素、氰基取代了芳基环的1～3个芳基取代的甲基”、和甲硅烷基。或者，在一个实施方式中，作为“核酸合成的羟基的保护基”，例如可以列举乙酰基、苯甲酰基、苄基、对甲氧基苯甲酰基、二甲氧基三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、叔丁基二苯基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基(TOM)、[(2－硝基苄基)氧基]甲基(NBOM)、双(乙酰氧基乙氧基)甲基醚(ACE)基、四氢－4－甲氧基－2H－吡喃－2－基(Mthp)、1－(2－氰基乙氧基)乙基(CEE)、2－氰基乙氧基甲基(CEM)、叔丁基二硫代甲基(DTM)、2－(4－甲苯基磺酰基)乙氧基甲基(TEM)、和4－(N－二氯乙酰基－N－甲基氨基)苄氧基甲基(4－MABOM)。

在一个实施方式中，作为“被核酸合成的保护基保护的羟基”的保护基，例如可以列举脂肪族酰基、芳香族酰基、“被1～3个芳基取代的甲基”、“被卤原子、低级烷氧基或硝基取代的芳基”、低级烷基和低级烯基。或者，在一个实施方式中，作为“被核酸合成的保护基保护的羟基”的保护基，例如可以列举苯甲酰基、苄基、2－氯苯基、4－氯苯基和2－丙烯基。

在一个实施方式中，作为“核酸合成的氨基的保护基”，例如可以列举酰基，优选列举苯甲酰基。

在一个实施方式中，作为“被核酸合成的保护基保护的磷酸基”的“保护基”，例如可以列举低级烷基、被氰基取代的低级烷基、芳烷基、“由硝基或卤原子取代了芳基环的芳烷基”、和“被低级烷基、卤原子或硝基取代的芳基”。或者，在一个实施方式中，作为“被核酸合成的保护基保护的磷酸基”的“保护基”，例如可以列举2－氰基乙基、2,2,2－三氯乙基、苄基、2－氯苯基、和4－氯苯基。

在一个实施方式中，作为“被核酸合成的保护基保护的巯基”的“保护基”，例如可以列举脂肪族酰基和芳香族酰基，优选列举苯甲酰基。

在本说明书中，－P(R⁴)R⁵[式中，R⁴和R⁵分别独立地表示羟基、被核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、被核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1至6的烷氧基、碳原子数1至6的烷基硫基、碳原子数1至6的氰基烷氧基、或具有碳原子数1至6的烷基的二烷基氨基]所示的基团中，R⁴为OR^4a且R⁵为NR^5a的基团是指“亚磷酰胺基”(其中，R^4a例如为碳原子数1至6的氰基烷氧基，并且R^5a例如为碳原子数1至6的烷基)。作为亚磷酰胺基，优选列举式－P(OC₂H₄CN)(N(iPr)₂)所示的基团、或式－P(OCH₃)(N(iPr)₂)所示的基团。其中，iPr表示异丙基。

在本说明书中，术语“核苷”和“核苷类似物”是指嘌呤或嘧啶碱基与糖结合而成的“核苷”中非天然型的物质、以及能够利用嘌呤和嘧啶以外的芳香族杂环和芳香族烃环代替嘌呤或嘧啶碱基的物质与糖结合而成的物质。

在本说明书中，术语“人工寡核苷酸”和“寡核苷酸类似物”是指例如2～50个相同或不同的“核苷”或“核苷类似物”以磷酸二酯键结合得到的“寡核苷酸”的非天然型衍生物。作为那样的类似物，优选列举糖部分被修饰的糖衍生物；磷酸二酯部分被硫酯化的硫酯衍生物；末端的磷酸部分被酯化的酯体；嘌呤碱基上的氨基被酰胺化的酰胺体，更优选列举糖部分被修饰的糖衍生物。

在本说明书中，术语“其盐”是指本发明的式(I)或(II)所示的化合物的盐。作为那样的盐，例如可以列举钠盐、钾盐、锂盐这样的碱金属盐、钙盐、镁盐这样的碱土金属盐、铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等金属盐；铵盐这样的无机盐、叔辛胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N－甲基葡萄糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、N,N′－二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N－苄基－苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟基甲基)氨基甲烷盐这样的有机盐等胺盐；氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐这样的氢卤酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐这样的低级烷烃磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐这样的芳基磺酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐；和甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐这样的氨基酸盐。

在本说明书中，作为术语“其药理学上可接受的盐”，是指含有至少一个本发明的式(II)所示的核苷结构的寡核苷酸类似物的盐。作为那样的盐，例如可以列举钠盐、钾盐、锂盐这样的碱金属盐、钙盐、镁盐这样的碱土金属盐、铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等金属盐；铵盐这样的无机盐、叔辛胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N－甲基葡萄糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、N,N′－二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N－苄基－苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟基甲基)氨基甲烷盐这样的有机盐等胺盐；氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐这样的氢卤酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐这样的低级烷烃磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐这样的芳基磺酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐；和甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐这样的氨基酸盐。

以下，对本发明进行详述。

本发明的5'位修饰核苷为以下的式(I)所示的化合物或其盐：

(式中，

Base¹和Base²分别独立地表示可以具有1个以上选自α组的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、被核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1至6的直链烷基、碳原子数1至6的直链烷氧基、巯基、被核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1至6的直链烷基硫基、氨基、碳原子数1至6的直链烷基氨基、被核酸合成的保护基保护的氨基、和卤原子，

G为氰基或硝基，

R²和R³分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1至7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2至7的烯基、可以具有1个以上选自该α组的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3至10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α组的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α组的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α组的任意取代基的磷酸基、被核酸合成的保护基保护的磷酸基、－P(R⁴)R⁵[式中，R⁴和R⁵分别独立表示羟基、被核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、被核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1至6的烷氧基、碳原子数1至6的烷基硫基、碳原子数1至6的氰基烷氧基、或具有碳原子数1至6的烷基的二烷基氨基]，

R⁶为可以被卤原子取代的碳原子数1或2的烷基，

R⁸为氢原子，并且，R⁹为氢原子、卤原子；可以被碳原子数1至6的直链烷氧基取代的碳原子数1至6的直链烷氧基；或－OR¹²[式中，R¹²为氢原子、或核酸合成的羟基的保护基]，或者

R⁸和R⁹一起表示下述式所示的二价基团：

[式中，

R²¹为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2至6的烯基、可以具有1个以上选自该α组的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3至10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基部分的芳烷基、或核酸合成的氨基的保护基；

R²²和R²³分别独立地为氢原子；可以被可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基取代且可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基；或具有可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基部分的芳烷基；或者

R²²和R²³一起表示－(CH₂)_q1－[式中，q1为2至5的整数]；

R²⁴和R²⁵分别独立地为选自氢原子；羟基；可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基；可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基；氨基；和被核酸合成的保护基保护的氨基中的基团；或者

R²⁴和R²⁵一起表示＝C(R³⁶)R³⁷[式中，R³⁶和R³⁷分别独立表示氢原子、羟基、被核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、被核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1至6的直链或支链烷氧基、碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基、碳原子数1至6的氰基烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基氨基]；

R²⁶和R²⁷分别独立地为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基；

R²⁸为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基；

R²⁹为氢原子、羟基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、氨基、或被核酸合成的保护基保护的氨基；

R³¹、R³²和R³³分别独立地为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、或核酸合成的氨基的保护基；

R³⁴和R³⁵分别独立地为氢原子、羟基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、氨基、或被核酸合成的保护基保护的氨基；

m为0至2的整数；

n为0至1的整数；

p为0至1的整数；

X¹为氧原子、硫原子或氨基；并且

X²为氧原子或硫原子]

R¹⁰为氢原子，并且，R¹¹为氢原子、卤原子；可以被碳原子数1至6的直链烷氧基取代的碳原子数1至6的直链烷氧基；或－OR^12b[式中，R^12b为氢原子、或核酸合成的羟基的保护基]，或者

R¹⁰和R¹¹一起表示下述式所示的二价基团：

[式中，

R^21b为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2至6的烯基、可以具有1个以上选自该α组的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3至10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基部分的芳烷基、或核酸合成的氨基的保护基；

R^22b和R^23b分别独立地为氢原子；可以被可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基取代且可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基；或具有可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基部分的芳烷基；或者

R^22b和R^23b一起表示－(CH₂)_q2－[式中，q2为2至5的整数]；

R^24b和R^25b分别独立地为选自氢原子；羟基；可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基；可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基；氨基；和被核酸合成的保护基保护的氨基中的基团；或者

R^24b和R^25b一起表示＝C(R^36b)R^37b[式中，R^36b和R^37b分别独立地表示氢原子、羟基、被核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、被核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1至6的直链或支链烷氧基、碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基、碳原子数1至6的氰基烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基氨基]；

R^26b和R^27b分别独立地为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基；

R^28b为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基；

R^29b为氢原子、羟基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、氨基、或被核酸合成的保护基保护的氨基；

R^31b、R^32b和R^33b分别独立地为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、或核酸合成的氨基的保护基；

R^34b和R^35b分别独立地为氢原子、羟基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、氨基、或被核酸合成的保护基保护的氨基；

m′为0至2的整数；

n′为0至1的整数；

p′为0至1的整数；

X^1b为氧原子、硫原子或氨基；并且

X^2b为氧原子或硫原子]

M¹为单键或以下的式：

[式中，

Base³表示可以具有1个以上选自该α组的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，

G²为氰基或硝基，

R¹³为可以被卤原子取代的碳原子数1或2的烷基，

R¹⁴为氢原子，并且，R¹⁵为氢原子、卤原子；可以被碳原子数1至6的直链烷氧基取代的碳原子数1至6的直链烷氧基；或－OR^12c[式中，R^12c为氢原子、或核酸合成的羟基的保护基]，或者

R¹⁴和R¹⁵一起表示下述式所示的二价基团：

[式中，

R^21c为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2至6的烯基、可以具有1个以上选自该α组的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3至10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基部分的芳烷基、或核酸合成的氨基的保护基；

R^22c和R^23c分别独立地为氢原子；可以被可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基取代且可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基；或具有可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基部分的芳烷基；或者

R^22c和R^23c一起表示－(CH₂)_q3－[式中，q3为2至5的整数]；

R^24c和R^25c分别独立地为选自氢原子；羟基；可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基；可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基；氨基；和被核酸合成的保护基保护的氨基中的基团；或者

R^24c和R^25c一起表示＝C(R^36c)R^37c[式中，R^36c和R^37c分别独立地表示氢原子、羟基、被核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、被核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1至6的直链或支链烷氧基、碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基、碳原子数1至6的氰基烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基氨基]；

R^26c和R^27c分别独立地为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基；

R^28c为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基；

R^29c为氢原子、羟基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、氨基、或被核酸合成的保护基保护的氨基；

R^31c、R^32c和R^33c分别独立地为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、或核酸合成的氨基的保护基；

R^34c和R^35c分别独立地为氢原子、羟基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、氨基、或被核酸合成的保护基保护的氨基；

m"为0至2的整数；

n"为0至1的整数；

p"为0至1的整数；

X^1c为氧原子、硫原子或氨基；并且

X^2c为氧原子或硫原子]。

在上述式(I)中，Base¹、Base²和Base³彼此可以相同或不同。Base¹、Base²和Base³分别独立地例如为嘌呤碱基(即、嘌呤－9－基)或嘧啶碱基(即、2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基)。这些碱基可以具有1个以上选自包括羟基、碳原子数1至6的直链烷基、碳原子数1至6的直链烷氧基、巯基、碳原子数1至6的直链烷基硫基、氨基、碳原子数1至6的直链烷基氨基和卤原子的α组中的任意取代基。

作为上述Base¹、Base²和Base³的具体例，可以列举腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胞嘧啶基、尿嘧啶基和胸腺嘧啶基、以及6－氨基嘌呤－9－基、2,6－二氨基嘌呤－9－基、2－氨基－6－氯嘌呤－9－基、2－氨基－6－氟嘌呤－9－基、2－氨基－6－溴嘌呤－9－基、2－氨基－6－羟基嘌呤－9－基、6－氨基－2－甲氧基嘌呤－9－基、6－氨基－2－氯嘌呤－9－基、6－氨基－2－氟嘌呤－9－基、2,6－二甲氧基嘌呤－9－基、2,6－二氯嘌呤－9－基、6－巯基嘌呤－9－基、2－氧代－4－氨基－1,2－二氢嘧啶－1－基、4－氨基－2－氧代－5－氟－1,2－二氢嘧啶－1－基、4－氨基－2－氧代－5－氯－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－甲氧基－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－巯基－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－羟基－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－羟基－5－甲基－1,2－二氢嘧啶－1－基、和4－氨基－5－甲基－2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基。

或者，Base¹、Base²和Base³在以将本发明的5′位修饰核苷导入核酸药物为目的的情况下，优选为以下的结构式分别所示的基团：

以及2－氧代－4－羟基－5－甲基－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－氨基－1,2－二氢嘧啶－1－基、6－氨基嘌呤－9－基、2－氨基－6－羟基嘌呤－9－基、4－氨基－5－甲基－2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基和2－氧代－4－羟基－1,2－二氢嘧啶－1－基。Base¹、Base²和Base³还优选为在合成寡核苷酸时构成上述基团的羟基和氨基被保护基保护的基团。

本发明的5′位修饰核苷如上所述，具有式(I)所示这样的结构、即、将规定的呋喃糖环组合构成的以下的式(I′)或(I")所示的二聚体或三聚体的结构：

(式(I′)中，Base¹、Base²、G、R²、R³、R⁶、R⁸、R⁹、R¹⁰和R¹¹与上述式(I)中定义相同，并且式(I")中，Base¹、Base²、Base³、G、G²、R²、R³、R⁶、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹³、R¹⁴和R¹⁵与上述式(I)中定义相同)。其中，在构成式(I′)的二聚体的各呋喃糖环的5′位分别结合有2个R⁶和2个氢原子。在构成式(I")的三聚体的各呋喃糖环的5′位分别结合有2个R⁶、2个氢原子和2个R¹³。通过具有这样的结构，本发明的5′位修饰核苷并不是在同一分子内所含的各吡喃糖环的5′位具有非对映异构体的结构，与现有的在5′位导入取代基的人工核酸相比，在其合成时不需要进行非对映异构体的分离。

在一个实施方式中，上述式(I′)的二聚体中的R⁶为甲基。在一个实施方式中，上述式(I")的三聚体中的R⁶和R¹³均为甲基。

在一个实施方式中，上述式(I′)的R⁸、R⁹、R¹⁰和R¹¹均为氢原子。在一个实施方式中，上述式(I")的R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹⁴和R¹⁵均为氢原子。

上述式(I′)所示的本发明的5′位修饰核苷通过在构成式(I′)的各呋喃糖环的5′位分别导入2个R⁶和2个氢原子，后述的寡核苷酸的核酸酶耐受性提高。进而，上述式(I")所示的本发明的5′位修饰核苷通过在构成式(I")的各呋喃糖环的5′位分别导入2个R⁶、2个氢原子和2个R¹³，后述的寡核苷酸的核酸酶耐受性提高。

在本发明中，寡核苷酸能够使用这样的式(I)或者式(I′)或(I")所示的5′位修饰核苷，例如利用该领域中公知的亚酰胺法或M.Kuwahara等、Nucleic Acids Res.，2008年，36卷，13号，4257-4265页记载的三磷酸化容易地制造。

本发明的寡核苷酸或其药理学上可接受的盐(以下，有时将它们总称为“本发明的寡核苷酸”)包含至少一个以下的式(II)所示的核苷结构：

(式中，

Base¹和Base²分别独立地表示可以具有1个以上选自α组的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、被核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1至6的直链烷基、碳原子数1至6的直链烷氧基、巯基、被核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1至6的直链烷基硫基、氨基、碳原子数1至6的直链烷基氨基、被核酸合成的保护基保护的氨基、和卤原子，

G为氰基或硝基，

R⁶为可以被卤原子取代的碳原子数1或2的烷基，

R⁸为氢原子，并且，R⁹为氢原子、卤原子；可以被碳原子数1至6的直链烷氧基取代的碳原子数1至6的直链烷氧基；或－OR¹²[式中，R¹²为氢原子、或核酸合成的羟基的保护基]，或者

R⁸和R⁹一起表示以下的式(CR01a)～(CR11a)所示的二价基团：

[式中，

R²¹为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2至6的烯基、可以具有1个以上选自该α组的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3至10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基部分的芳烷基、或核酸合成的氨基的保护基；

R²²和R²³分别独立地为氢原子；可以被可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基取代且可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基；或具有可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基部分的芳烷基；或者

R²²和R²³一起表示－(CH₂)_q1－[式中，q1为2至5的整数]；

R²⁴和R²⁵分别独立地为选自氢原子；羟基；可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基；可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基；氨基；和被核酸合成的保护基保护的氨基中的基团；或者

R²⁴和R²⁵一起表示＝C(R³⁶)R³⁷[式中，R³⁶和R³⁷分别独立地表示氢原子、羟基、被核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、被核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1至6的直链或支链烷氧基、碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基、碳原子数1至6的氰基烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基氨基]；

R²⁶和R²⁷分别独立地为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基；

R²⁸为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基；

R²⁹为氢原子、羟基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、氨基、或被核酸合成的保护基保护的氨基；

R³¹、R³²和R³³分别独立地为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、或核酸合成的氨基的保护基；

R³⁴和R³⁵分别独立地为氢原子、羟基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、氨基、或被核酸合成的保护基保护的氨基；

m为0至2的整数；

n为0至1的整数；

p为0至1的整数；

X¹为氧原子、硫原子或氨基；并且

X²为氧原子或硫原子]，

R¹⁰为氢原子，并且，R¹¹为氢原子、卤原子；可以被碳原子数1至6的直链烷氧基取代的碳原子数1至6的直链烷氧基；或－OR^12b[式中，R^12b为氢原子、或核酸合成的羟基的保护基]，或者

R¹⁰和R¹¹一起表示以下的式(CR01b)～(CR11b)所示的二价基团：

[式中，

R^21b为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2至6的烯基、可以具有1个以上选自该α组的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3至10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基部分的芳烷基、或核酸合成的氨基的保护基；

R^22b和R^23b分别独立地为氢原子；可以被可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基取代且可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基；或具有可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基部分的芳烷基；或者

R^22b和R^23b一起表示－(CH₂)_q2－[式中，q2为2至5的整数]；

R^24b和R^25b分别独立地为选自氢原子；羟基；可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基；可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基；氨基；和被核酸合成的保护基保护的氨基中的基团；或者

R^24b和R^25b一起表示＝C(R^36b)R^37b[式中，R^36b和R^37b分别独立地表示氢原子、羟基、被核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、被核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1至6的直链或支链烷氧基、碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基、碳原子数1至6的氰基烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基氨基]；

R^26b和R^27b分别独立地为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基；

R^28b为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基；

R^29b为氢原子、羟基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、氨基、或被核酸合成的保护基保护的氨基；

R^31b、R^32b和R^33b分别独立地为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、或核酸合成的氨基的保护基；

R^34b和R^35b分别独立地为氢原子、羟基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、氨基、或被核酸合成的保护基保护的氨基；

m′为0至2的整数；

n′为0至1的整数；

p′为0至1的整数；

X^1b为氧原子、硫原子或氨基；并且

X^2b为氧原子或硫原子]

M¹为单键或以下的式：

[式中，

Base³表示可以具有1个以上选自该α组的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，

G²为氰基或硝基，

R¹³为可以被卤原子取代的碳原子数1或2的烷基，

R¹⁴为氢原子，并且，R¹⁵为氢原子、卤原子；可以被碳原子数1至6的直链烷氧基取代的碳原子数1至6的直链烷氧基；或－OR^12c[式中，R^12c为氢原子、或核酸合成的羟基的保护基]，或者

R¹⁴和R¹⁵一起表示以下的式(CR01c)～(CR11c)所示的二价基团：

[式中，

R^21c为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2至6的烯基、可以具有1个以上选自该α组的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3至10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基部分的芳烷基、或核酸合成的氨基的保护基；

R^22c和R^23c分别独立地为氢原子；可以被可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基取代且可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基；或具有可以包含杂原子的碳原子数3至12的芳基部分的芳烷基；或者

R^22c和R^23c一起表示－(CH₂)_q3－[式中，q3为2至5的整数]；

R^24c和R^25c分别独立地为选自氢原子；羟基；可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基；可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基；氨基；和被核酸合成的保护基保护的氨基中的基团；或者

R^24c和R^25c一起表示＝C(R^36c)R^37c[式中，R^36c和R^37c分别独立地表示氢原子、羟基、被核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、被核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1至6的直链或支链烷氧基、碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基、碳原子数1至6的氰基烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基氨基]；

R^26c和R^27c分别独立地为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基；

R^28c为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、或碳原子数1至6的直链或支链烷基硫基；

R^29c为氢原子、羟基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、氨基、或被核酸合成的保护基保护的氨基；

R^31c、R^32c和R^33c分别独立地为氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、或核酸合成的氨基的保护基；

R^34c和R^35c分别独立地为氢原子、羟基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷基、可以形成支链或环的碳原子数1至6的烷氧基、氨基、或被核酸合成的保护基保护的氨基；

m"为0至2的整数；

n"为0至1的整数；

p"为0至1的整数；

X^1c为氧原子、硫原子或氨基；并且

X^2c为氧原子或硫原子])。

此外，在本发明中，上述式(CR01a)～(CR11a)、(CR01b)～(CR11b)和(CR01c)～(CR11c)所示的交联结构中，式(CR07a)、(CR09a)、(CR07b)、(CR09b)、(CR07c)和(CR09c)所示的结构由于在该交联结构的周边存在的任意的阴离子(例如氢氧化物离子、磷酸离子、氯化物离子)而保持电中性。

即，本发明的上述式(II)的寡核苷酸包含以下的式(II′)或(II")所示的核苷结构：

(式(II′)中，Base¹、Base²、G、R⁶、R⁸、R⁹、R¹⁰和R¹¹与上述式(II)中定义相同，并且式(II")中，Base¹、Base²、Base³、G、G²、R⁶、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹³、R¹⁴和R¹⁵与上述式(II)中定义相同)。

在一个实施方式中，包含上述式(II′)的核苷结构的寡核苷酸中的R⁶为甲基或乙基。在一个实施方式中，包含上述式(II")的核苷结构的寡核苷酸中的R⁶和R¹³均为甲基或乙基。

在一个实施方式中，上述式(II′)的R⁸、R⁹、R¹⁰和R¹¹均为氢原子。在一个实施方式中，上述式(II")的R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹⁴和R¹⁵均为氢原子。

本发明的寡核苷酸在任意的位置具有至少1个上述式(II)、或者式(II′)或(II")所示的核苷结构。其位置和数量没有特别限定，可以根据目的适当设计。

包含这样的核苷结构的寡核苷酸(反义分子)与使用现有的2′,4′－BNA/LNA的情况相比，核酸酶耐受性飞跃性提高。还具有与公知的2′,4′－BNA/LNA相媲美的ssRNA结合亲合性。

由此，使用本发明的5′位修饰核苷所合成的本发明的寡核苷酸可以被期待作为以抗肿瘤剂、抗病毒剂为代表的、阻碍特定的基因的功能来治疗疾病的医药品(反义分子)的有用性。

特别是在反义法中，需要对于互补正义链RNA的结合亲合性和对生物体内DNA分解酶的耐受性的两者。一般而言，已知核酸在单链状态下，糖部的结构不断在接近DNA的形式与接近DNA－RNA双链或RNA双链的形态之间摇摆。在单链核酸与互补的RNA链形成双链的情况下，其糖部结构被固定。因此，在本发明的5′位修饰核苷中，糖部被预先固定为形成双链时的状态，因此容易与目标RNA链形成双链，能够稳定地存在。另外，还已知核酸双链通过被称为水分子的网络的链状连接的水合水被稳定化。

本发明的寡核苷酸例如能够配合赋形剂、结合剂、防腐剂、氧化稳定剂、崩解剂、光滑剂、矫味剂等医药制剂技术领域中通常使用的辅助剂，制成非口服给药制剂或脂质体制剂。另外，例如能够配合该技术领域中通常使用的医药用载体，制备液剂、霜剂、软膏剂等局部用的制剂。

实施例

以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不被这些实施例所限定。

(实施例1：5′位修饰核苷的合成(1))

各工序的试剂和条件：(a)TEMPO，PhI(OAc)₂，CH₂Cl₂，室温，5小时，然后H₂O，MeCN，室温，4小时；(b)EDC·HCl，MeOH，CH₂Cl₂，0℃，4.5小时，84％(2个工序)；(c)CH₂MgBr，THF，-20℃，8小时，84％；(d)DMT-dT亚磷酰胺，BTT，MeCN，室温，3小时；(e)TBHP，MeCN，室温，1小时，76％(2个工序)；(f)TEA·3HF，THF，0℃至室温，41.5小时，95％；(g)ⁱPr₂NP(Cl)OC₂H₄CN，DIPEA，MeCN，室温，4小时，67％。

(1－1)化合物2的合成

将根据Caruthers等、Tetrahedron Lett.，1996年，37卷，35号，6239-6242页中记载的方法制作的化合物1(4.26g，11.95mmol)溶解于二氯甲烷(60mL)后，添加二乙酸碘苯(PhI(A)2；8.47g，26.30mmol)。然后，在0℃添加2，2,6,6－四甲基哌啶－1－氧基自由基(TEMPO；430.4mg，2.75mmol)，在室温搅拌5小时。反应结束后，添加水/乙腈(＝1：1(容量比)，0.66mL)，在室温搅拌4小时。反应结束后，添加甲醇(20mL)，然后，将溶剂减压蒸馏除去，得到化合物2(粗产物)。不对化合物2进行精制而用于后续反应。

(1－2)化合物3的合成

在上述得到的化合物2(粗产物)的二氯甲烷溶液(120mL)中添加甲醇(4.8mL，0.12mol)和1－(3－二甲基氨基丙基)－3－乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl；2.76g，14.39mmol)，在0℃搅拌4.5小时。在反应结束后添加水，用乙酸乙酯提取。用水以及饱和盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥，将溶剂减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱(SiO₂，乙酸乙酯：正己烷＝1：1(容量比))精制，作为白色固体得到化合物3(3.84g，收率84％，2个工序)。

将所得到的化合物3的物性数据表示于表1。

[表1]

(1－3)化合物4的合成

将上述得到的化合物3(3.00g，7.80mmol)用无水甲苯共沸后，溶解于无水四氢呋喃(80mL)，在氮气流下在－20℃缓慢滴加甲基溴化镁(CH₃MgBr；31mL，31.0mmol、THF中1M)，搅拌4.5小时。由于反应没有完成，再在－20℃缓慢滴加甲基溴化镁(CH₃MgBr；7.8mL，7.8mmol、THF中1M)，搅拌3.5小时。反应结束后，添加氯化铵水溶液，用乙酸乙酯提取。用饱和碳酸氢钠水以及饱和盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥，将溶剂减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱(SiO₂，乙酸乙酯：正己烷＝3：2(容量比))精制，作为白色固体得到化合物4(2.52g，收率84％)。

将所得到的化合物4的物性数据表示于表2。

[表2]

(1－4)化合物5的合成

将上述得到的化合物4(1.26g，3.28mmol)用无水甲苯共沸后，溶解于无水乙腈(35mL)，在氮气流下依次添加5′－(4,4′－二甲氧基三苯甲基)－胸苷－3′－[(2－氰基乙基)－(N,N－二异丙基)]－亚磷酰胺(DMT－dT亚磷酰胺；3.69g，4.95mmol)和5－(苄基硫代)－1H－四唑(BTT；0.98g，5.10mmol)，在室温搅拌3小时。反应结束后添加水，用乙酸乙酯提取。用水以及饱和盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥，将溶剂减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱(SiO₂，乙酸乙酯：正己烷＝1：1→5：2(容量比))简单地精制，作为粗产物得到化合物5(3.48g)。

(1－5)化合物6的合成

将上述得到的化合物5(3.48g)溶解于乙腈(30mL)，添加叔丁基过氧化氢(TBHP；4.6mL，70％水溶液，33.59mmol)，在室温搅拌1小时。反应结束后，在0℃添加饱和硫代硫酸钠水溶液，用乙酸乙酯提取。用水以及饱和盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥，将溶剂减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱(SiO₂，甲醇：氯仿＝1：20(容量比))精制，作为白色固体得到化合物6(3.24g，收率76％，2个工序)。

将所得到的化合物6的物性数据表示于表3。

[表3]

(1－6)化合物7的合成

将上述得到的化合物6(0.64g，0.61mmol)溶解于无水四氢呋喃(6mL)，在0℃添加三乙胺三氢氟酸盐(TEA·3HF；1.0mL，6.13mmol)搅拌15分钟后，在室温搅拌41.5小时。反应结束后，添加乙酸乙酯(30mL)将溶液稀释，用2％的碳酸氢钠水清洗2次，用水清洗1次。将水层用乙酸乙酯再提取，与有机层合并，用饱和盐水清洗1次后，用无水硫酸钠干燥，将溶剂减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱(SiO₂，甲醇：氯仿＝1：10(容量比))精制，作为白色固体得到化合物7(539mg，收率95％)。

将所得到的化合物7的物性数据表示于表4。

[表4]

(1－7)化合物8的合成

将上述得到的化合物7(3.98g，4.28mmol)用无水甲苯共沸后，在氮气流下依次添加无水乙腈(43mL)、N,N－二异丙基乙胺(DIPEA；2.2mL，12.94mmol)和2－氰基乙基－N,N－二异丙基磷酰氯(ⁱPr₂NP(Cl)OC₂H₄CN；1.8mL，6.46mmol)，在室温搅拌4小时。反应结束后用乙酸乙酯稀释，用水以及饱和盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥，将溶剂减压蒸馏除去。所得到的残渣用硅胶柱色谱(diol－SiO₂，乙酸乙酯：正己烷＝1：1→1：2(容量比))精制后，通过再沉淀(己烷：氯仿＝20：1(容量比))，作为白色固体得到化合物8(3.25g，收率67％)。

将所得到的化合物8的物性数据表示于表5。

[表5]

(实施例2：5′位修饰核苷的合成(2))

各工序的试剂和条件：(h)DMT-dG(ib)亚磷酰胺，BTT，MeCN，室温，2小时；(i)TBHP，MeCN，室温，2小时，94％(2个工序)。

(2－1)化合物9的合成

将实施例1的(1－3)中得到的化合物4(494.7mg，1.29mmol)用无水甲苯共沸后，溶解于无水乙腈(13mL)，在氮气流下依次添加5′－(4,4′－二甲氧基三苯甲基)－N－异丁酰基－2′－脱氧鸟苷－3′－[(2－氰基乙基)－(N,N－二异丙基)]－亚磷酰胺(DMT－dG(ib)亚磷酰胺；1.66g，1.98mmol)、5－(苄基硫代)－1H－四唑(BTT；372.6mg，1.94mmol)，在室温搅拌2小时。反应结束后添加水，用乙酸乙酯提取。用水以及饱和盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥，将溶剂减压蒸馏除去。不对所得到的化合物9(2.51g；粗产物)进行精制而用于后续反应。

(2－2)化合物10的合成

将上述得到的化合物9(2.51g)溶解于乙腈(11mL)，添加叔丁基过氧化氢(TBHP；1.8mL，70％水溶液，13.14mmol)，在室温搅拌2小时。反应结束后，在0℃添加饱和硫代硫酸钠水溶液，用乙酸乙酯提取。用水以及饱和盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥，将溶剂减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱(SiO₂，甲醇：氯仿＝1：18→1：16)精制，作为白色固体得到化合物10(1.37g，收率94％，2个工序)。

将所得到的化合物10的物性数据表示于表6。

[表6]

(2－3)和(2－4)化合物11和化合物11′的合成

使用上述得到的化合物10，按照以下的合成路线，基于上述实施例1的(1－6)～(1－7)中记载的方法，能够得到化合物11′。

(实施例3：5′位修饰核苷的合成(3))

各工序的试剂和条件：(j)BTT，MeCN，室温，5.5小时；(k)TBHP，MeCN，室温，1.5小时，42％(2个工序)

(3－1)化合物12的合成

将上述实施例1的(1－7)得到的化合物8(80.5mg，0.071mmol)用无水甲苯共沸后，溶解于无水乙腈(0.5mL)，在氮气流下依次添加上述实施例1的(1－3)所得到的化合物4(21.9mg，0.057mmol)、5－(苄基硫代)－1H－四唑(BTT；17.1mg，0.089mmol)，在室温搅拌5.5小时。反应结束后添加水，用乙酸乙酯提取。用水以及饱和盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥，将溶剂减压蒸馏除去。不对所得到的化合物12(105.9mg；粗产物)进行精制而用于后续反应。

(3－2)化合物13的合成

将上述得到的化合物12(105.9mg)溶解于乙腈(0.45mL)，添加叔丁基过氧化氢(TBHP；71.3μL，70％水溶液，0.052mmol)，在室温搅拌1.5小时。反应结束后，在0℃添加饱和硫代硫酸钠水溶液，用乙酸乙酯提取。用水以及饱和盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥，将溶剂减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱(SiO₂，甲醇：氯仿＝1：12)精制，作为白色固体得到化合物13(33.1mg，收率42％，2工序)。

将所得到的化合物13的物性数据表示于表7。

[表7]

(3－3)和(3－4)化合物14和化合物15的合成

使用上述得到的化合物13，按照以下的合成路线，基于上述实施例1的(1－6)～(1－7)中记载的方法，能够得到化合物15。

(实施例4：5′位修饰核苷的合成(4))

各工序的试剂和条件：(l)C₂H₅MgBr，THF，-20℃，3.5小时，76％；(m)DMT-dT亚磷酰胺，BTT，MeCN，室温，4小时；(n)TBHP，MeCN，室温，3.5小时；(o)TEA·3HF，THF，0℃至室温，23小时，65％(3个工序)；(p)ⁱPr₂NP(Cl)OC₂H₄CN，DIPEA，MeCN，室温，2.5小时，45％。

(4－1)化合物16的合成

将化合物3(446mg，1.16mmol)用无水甲苯共沸后，溶解于无水四氢呋喃(12mL)，在氮气流下在－20℃缓慢滴加乙基溴化镁(C₂H₅MgBr；4.6mL，4.6mmol、THF中1M)，在该温度下搅拌3.5小时。反应结束后，加入氯化铵水溶液，用乙酸乙酯提取。用饱和碳酸氢钠水以及饱和盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥，将溶剂减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱(SiO₂，乙酸乙酯：正己烷＝1：1)精制，作为白色固体得到化合物16(364mg，76％)。

将所得到的化合物16的物性数据表示于表8。

[表8]

(4－2)化合物17的合成

将上述得到的化合物16(283mg，0.69mmol)用无水甲苯共沸后，溶解于无水乙腈(7mL)，在氮气流下依次加入5′－(4,4′－二甲氧基三苯甲基)－胸苷－3′－[(2－氰基乙基)－(N,N－二异丙基)]－亚磷酰胺(DMT－dT亚磷酰胺；840.3mg，1.13mmol)和5－(苄基硫代)－1H－四唑(BTT；198.9mg，1.03mmol)，在室温搅拌4小时。反应结束后加入水，用乙酸乙酯提取。用水与饱和盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥，将溶剂减压蒸馏除去，作为粗产物得到化合物17(1.22g)。不对该化合物17进行精制而用于后续反应。

(4－3)化合物18的合成

将上述得到的化合物17(1.22g)溶解于乙腈(6.2mL)，加入叔丁基过氧化氢(TBHP；0.7mL，70％水溶液，5.11mmol)，在室温搅拌3.5小时。反应结束后，在0℃加入饱和硫代硫酸钠水溶液，用乙酸乙酯提取。用水与饱和盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥，将溶剂减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱(SiO₂，甲醇：氯仿＝0：1→1：30)简单地精制，作为粗产物得到化合物18(979mg)。

将所得到的化合物18的物性数据表示于表9。

[表9]

(4－4)化合物19的合成

将上述得到的化合物18(979mg)溶解于无水四氢呋喃(6.9mL)，在0℃加入三乙胺三氢氟酸盐(TEA·3HF；1.1mL，6.61mmol)后，在室温搅拌16.5小时。由于反应没有完成，在0℃再加入三乙胺三氢氟酸盐(TEA·3HF；0.6mL，3.61mmol)后，在室温搅拌6.5小时。反应结束后，加入乙酸乙酯(30mL)，将溶液稀释，用2％碳酸氢钠水清洗2次，用水清洗1次。将水层用乙酸乙酯再提取，与有机层合并，用饱和盐水清洗1次后，用无水硫酸钠干燥，将溶剂减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱(SiO₂，甲醇：氯仿＝0：1→1：30)精制，作为白色固体得到化合物19(425mg，65％(3个工序以上))。

将所得到的化合物19的物性数据表示于表10。

[表10]

(4－5)化合物20的合成

将上述得到的化合物19(393mg，0.41mmol)用无水甲苯共沸脱水后，在氮气流下依次加入无水乙腈(4.2mL)、N,N－二异丙基乙胺(DIPEA；0.25mL，1.47mmol)和2－氰基乙基－N,N－二异丙基磷酰氯(ⁱPr₂NP(Cl)OC₂H₄CN；0.17mL，0.61mmol)，在室温搅拌2.5小时。将溶剂一部分减压蒸馏除去，将所得到的残渣用硅胶柱色谱(SiO₂，甲醇：氯仿＝0：1→1：35)精制后，通过再沉淀(戊烷：氯仿＝20：1)，作为白色固体得到化合物20(215mg，45％)。

将所得到的化合物20的物性数据表示于表11。

[表11]

(实施例5：寡核苷酸的合成和精制)

使用实施例1中制作的化合物8作为酰胺链段(amidite blocks)，如下所述地合成寡核苷酸。关于构成寡核苷酸的化合物8以外的化合物，只要没有特别说明，均从Proligo公司购入。

使用实施例1中制作的化合物8和市售的dG(iBu)、dC(Bz)和T的亚磷酰胺作为构成反义寡核苷酸的化合物。制备包含这些酰胺链段的0.1M的无水乙腈溶液，加入到GeneDesign公司制的nS－8Oligonucleotides Synthesizer中，以0.2μmol的规模，在Trityl-on的条件下进行寡核苷酸合成。活性剂使用5－乙基硫代－1H－四唑(ETT)活化剂(0.25M乙腈溶液)，按照通常的亚磷酰胺法进行合成。

合成结束后，对产物利用28％氨水溶液在室温下处理1.5小时，从柱载体洗脱，然后在55℃静置24小时，由此进行碱基部的脱保护和磷酸二酯部的脱保护。然后，利用简易反相色谱柱(Waters公司制Sep－Pak(注册商标)Plus C18 Environmental Cartridges)进行精制，再用反相HPLC进行精制。

利用MALDI－TOF－MS测定确定所精制的寡核苷酸的组成。在该测定时，首先，在将以1∶1的容量比混合3－羟基皮考啉酸水溶液(10mg/mL)和柠檬酸二铵水溶液(1mg/mL)而成的基质(1μL)干燥后的靶板(Anchorchip)上，滴加寡核苷酸水溶液(约50μM，1μL)再次使其干燥，然后进行MALDI－TOF－MS测定。分子量的测定以阴离子模式进行，使用寡胸苷酸(7mer、9mer、11mer和13mer)作为外部标准。另外，通过使用吸光度测定装置(株式会社岛津制作所制SHIMADZU UV－1800)测定260nm的紫外部吸收来进行所合成的寡核苷酸的定量。

(实施例6：双链形成能力的评价)

如实施例5所记载那样，合成和精制以下序列的寡核苷酸：

5′－d(GCGTTXTTTGCT)－3′(序列编号1～2)

(1)X＝胸苷(T)(序列编号1)

(2)X＝5′－二甲基胸苷(5′－diMe－T)(序列编号2)

合成上述(2)的序列的寡核苷酸的合成时，使用化合物8，在从寡核苷酸的序列的5′侧数第5位排列胸苷(T)且在第6位(“X”)排列5′－二甲基胸苷(5′－diMe－T)。

作为靶标链，使用单链寡RNA5′－r(AGCAAAAAACGC)－3′(序列编号3)和单链寡DNA5′－d(AGCAAAAAACGC)－3′(序列编号4)，研究各寡核苷酸的双链形成能力(结合亲合性)。

通过将各种寡核苷酸和靶标链进行退火处理使其形成双链后，测定T_m值来研究寡核苷酸的双链形成能力。更详细而言，将各寡核苷酸(终浓度4μM)和氯化钠(终浓度100mM)的磷酸缓冲液(10mM，pH7.2，130μL)的混合液在沸水中水浴，缓慢冷却到室温。然后，在氮气流下冷却到5℃，开始测定。以0.5℃/分钟升温到90℃，以0.5℃间隔绘制260nm的吸光度。通过中线法算出T_m值，取独立3次的测定的平均值。将结果表示于以下的表12。表12中，将相对于单链寡RNA的结果表示为“ssRNA”，将相对于单链寡DNA的结果表示为“ssDNA”，并且表示各寡核苷酸的T_m和每1个碱基人工修饰核酸的Tm变动温度(“ΔT_m/mod.”)。

[表12]

X＝5′-二甲基胸苷

在使用化合物8合成的含有5′－二甲基胸苷的寡核苷酸的情况(上述(2))下，单链寡DNA和单链寡RNA的两者与天然的寡核苷酸(上述(1))相比，T_m值均只是略微降低，不损害结合亲合性。

(实施例7：核酸酶耐受性的评价)

如实施例5记载那样，合成和精制以下的10mer的序列的寡核苷酸，用作被验寡核苷酸：

5′－TTTTTTTTTX－3′

(3)X＝硫代磷酸酯胸苷(ps－T)(硫代磷酸酯键合(将核苷酸间的结合部位的磷酸基硫化(S化))

(4)X＝5′－二甲基胸苷(5′－diMe－T)

在合成上述(4)的序列的寡核苷酸的合成时，使用化合物8，从寡核苷酸的序列的5′侧数第9位排列胸苷(T)且第10位(“X”)排列5′－二甲基胸苷(5′－diMe－T)。

在包含7.5μM被验寡核苷酸和10mM氯化镁的50mM Tris缓冲液(pH8.0)中加入2.5μg/mL的3′－核酸外切酶(Crotalus adamanteus venom phosphodiesterase，CAVP)，在37℃孵育。在孵育开始时(0分钟)、2.5分钟后、5分钟后、10分钟后、20分钟后、40分钟后分别各取出10μL试样，用反相HPLC进行分析，算出未切断的寡核苷酸的比例。另外，评价通过独立的3次测定导出。

将结果表示于图1。图1中，黑色菱形表示上述(3)的结果，并且黑方块表示上述(4)的结果。由图1可知，在本实施例中，在硫代磷酸酯化(PS)寡核苷酸(上述(3))中，核酸酶处理40分钟后的未切断寡核苷酸的残存率降低到约20％以下，相对于此，使用化合物8合成的含有5′－二甲基胸苷的寡核苷酸(上述(4))在核酸酶处理的40分钟后，也有约80％未切断而残留，不易被分解。由此可以确认通过5′－二甲基修饰，能够获得比硫代磷酸酯修饰高的核酸酶耐受性。

(实施例8：RNase H活性的评价)

如实施例5记载那样，合成和精制以下序列的寡核苷酸，用作被验寡核苷酸：

(5)5′－G_mC_mG_mttttttttG_mC_mU_m－3′(序列编号5)

(6)5′－G_mC_mG_mtttXtttXG_mC_mU_m－3′(序列编号6)

(7)5′－G_mC_mG_mtXttXttXG_mC_mU_m－3′(序列编号7)

(8)5′－G_mC_mG_mU_mU_mU_mU_mU_mU_mU_mU_mG_mC_mU_m－3′(序列编号8)

G_m、C_m、U_m：2′－O－甲基修饰

t＝胸苷

X＝5′－二甲基胸苷(5′－diMe－T)

在合成上述(6)和(7)的序列的寡核苷酸时，使用化合物8，在各序列中的“tX”的位置(从5′侧数序列(6)的第6位－第7位和第10位－第11位、以及序列(7)的第4位－第5位、第7位－第8位和第10位－第11位)排列胸苷(t)和5′－二甲基胸苷(5′－diMe－T)。

在包含50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)和3mM氯化镁、10mM二硫苏糖醇的混合溶液中，溶解被验寡核苷酸(60pmol)和由荧光素标记的互补链RNA(5′－FAM－r(AGCAAAAAAAACGC)－3′(序列编号9))(300pmol)。将各试样加热到65℃后，缓慢冷却到室温。在各试样中加入3.0单位的来自大肠杆菌的RNase H，在37℃孵育。40分钟后，加入试样容积的3倍量的甲酰胺/0.1M乙二胺四乙酸混合溶液(甲酰胺∶0.1M乙二胺四乙酸＝14∶1(容量比))，使反应停止。切断产物用20％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。其中，通过条带的荧光强度比，将序列(8)的残存率作为100％来算出各序列的切断率。将结果表示于以下的表13。

[表13]

将5′－二甲基胸苷隔3个导入的寡核苷酸(序列(6))显示与不含5′－二甲基胸苷的寡核苷酸(序列(5))相同程度的切断率。另一方面，将5′－二甲基胸苷隔2个导入的寡核苷酸(序列(7))显示与不含5′－二甲基胸苷的寡核苷酸(序列(5))相比略低的切断率，但观察到了切断。由此可以确认5′－二甲基修饰也能够在RNase H诱导型反义寡核苷酸中利用。

(实施例9：反义活性以及肝毒性的评价)

如实施例5所记载那样，合成和精制以下序列的寡核苷酸，用作被验寡核苷酸。作为NR3C1的反义设计了2种被验寡核苷酸的序列：

ASO1：5′－G^T^^mC^t^c^t^t^t^a^c^c^T^G^G－3′(序列编号10)

ASO2：5′－G^T^^mC^t^c^tX^t^a^c^c^T^G^G－3′(序列编号11)

ASO3：5′－A^G^G^t^g^c^t^t^t^g^g^T^^mC^T－3′(序列编号12)

ASO4：5′－A^G^G^t^g^c^t^tX^g^g^T^^mC^T－3′(序列编号13)

a、g、c和t＝DNA

A＝LNA－A、G＝LNA－G、^mC＝LNA－5－甲基胞嘧啶、T＝LNA－T

X＝5′－二甲基胸苷(5′－diMe－T)

^＝硫代磷酸酯键(将核苷酸间的结合部位的磷酸基硫化(S化))

在6周龄的小鼠(C57BL/6NCrl、雄)的尾静脉给药上述被验寡核苷酸(20mg/kg)。作为对照给药生理盐水。96小时后，在吸入麻醉下(异氟烷)进行采血，放血使其安乐死。然后，采集肝脏，进行肝脏重量的测定和RNA提取(用TRIzol匀浆后，进行苯酚、氯仿提取)。利用自动分析装置(日本电子株式会社制JCA－BM6070)测定血液中的天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的活性。另外，利用实时PCR(使用试剂盒：One Step SYBRPrimeScriptRT－PCRKit(Takara Bio株式会社制)、引物序列：NR3C1正向(actgtccagcatgccgctat)(序列编号14)、NR3C1反向(gcagtggcttgctgaattcc)(序列编号15)、GAPDH正向(gtgtgaacggatttggccgt)(序列编号16)、GAPDH反向(gacaagcttcccattctcgg)(序列编号17))测定靶标基因NR3C1以及管家基因GAPDH的mRNA表达量。

将所得到的结果表示于图2～图5。图2和图3是表示给药各被验寡核苷酸时以及生理盐水给药时的小鼠肝脏中的靶标基因NR3C1的mRNA量的图表，以将给药生理盐水时的mRNA量设为100时的相对值表示(图2：ASO1和ASO2、以及图3：ASO3和ASO4)。图4和图5是表示给药各被验寡核苷酸时以及给药生理盐水时的血液中的天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的活性的图表，以将给药不含5′－二甲基胸苷的寡核苷酸(ASO1或ASO3)时的ALT值和AST值分别设为100时的相对值表示(图4：ASO1和ASO2、以及图5：ASO3和ASO4)。

如图2和图3所示，在ASO1与ASO2之间、以及ASO3与ASO4之间，RNA表达量与给药对照的生理盐水时相比，被相同程度地抑制。因此，包含5′－二甲基胸苷的寡核苷酸与不含5′－二甲基胸苷的寡核苷酸相比，反义活性基本为相同程度。如图4和图5所示，在使用5′－二甲基胸苷的ASO2和ASO4中，与分别不使用5′－二甲基胸苷的ASO1和ASO3相比，使成为肝毒性指标的AST和ALT的值显著减少。由此可以确认通过5′－二甲基修饰，能够无损反义寡核苷酸的反义活性而减少肝毒性。

(实施例10：5′－二乙基修饰核酸的核酸酶耐受性的评价)

除了作为X的化合物使用化合物20的二乙基胸苷(5′－diEt－T)以外，如实施例5所记载的那样，合成和精制以下的10mer的序列的寡核苷酸，用作被验寡核苷酸：

5′－TTTTTTTTTX－3′

(9)X＝硫代磷酸酯胸苷(ps－T)(将硫代磷酸酯键(核苷酸间的结合部位的磷酸基硫化(S化))

(10)X＝5′－二甲基胸苷(5′－diMe－T)

(11)X＝5′－二乙基胸苷(5′－diEt－T)

在合成上述(10)或(11)的序列的寡核苷酸时，使用化合物8或20，在从寡核苷酸的序列的5′侧数第9位排列胸苷(T)且在第10位(“X”)排列5′－二甲基胸苷(5′－diMe－T)或5′－二乙基胸苷(5′－diEt－T)。

在包含7.5μM被验寡核苷酸和10mM氯化镁的50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)中加入3.0μg/mL的3′－核酸外切酶(Crotalus adamanteus venom phosphodiesterase，CAVP)，在37℃孵育。在孵育开始时(0分钟)、2.5分钟后、5分钟后、10分钟后、20分钟后、40分钟后分别各取出10μM试样，用反相HPLC进行分析，算出未切断的寡核苷酸的比例。另外，评价通过独立的3次测定导出。

将结果表示于图6。图6中，黑圆表示上述(9)的结果(PS)，黑三角表示上述(10)的结果(5′diMeT)，并且白色菱形表示上述(11)的结果(5′diEtT)。从图6可知，在本实施例中，在硫代磷酸酯化(PS)寡聚物(上述(9))中，在核酸酶处理20分钟以后，未切断寡核苷酸的残存率降低到约20％以下，相对于此，使用化合物20合成的含5′－二乙基胸苷的寡核苷酸(上述(11))与使用化合物8合成的含有5′－二甲基胸苷的寡核苷酸(上述(10))同样，在核酸酶处理的40分钟后也有约60％未切断而残留，不易被分解。由此可以确认不仅通过5’－二甲基修饰能够获得比硫代磷酸酯修饰高的核酸酶耐受性，而且通过5′－二乙基修饰也能够获得比硫代磷酸酯修饰高的核酸酶耐受性。

(实施例11：5′－二乙基修饰核酸的双链形成能力的评价)

除了作为X的化合物使用化合物20的二乙基胸苷(5′－diEt－T)以外，如实施例5所记载那样，合成和精制以下的序列的寡核苷酸，用作被验寡核苷酸：

(12)5′－d(GCGTTTTTTGCT)－3′(序列编号1)

(13)5′－d(GCGTTXTTTGCT)－3′(序列编号18)

(14)5′－d(GCGTTXTXTGCT)－3′(序列编号19)

序列(13)和(14)中的X为5′－二乙基胸苷(5′－diEt－T)。

在合成上述(13)的序列的寡核苷酸时，使用化合物20，在从寡核苷酸的序列的5′侧数第5位排列胸苷(T)，且在第6位(“X”)排列5′－二乙基胸苷(5′－diEt－T)。关于上述(14)的序列的寡核苷酸，在从5′侧数第5位和第7位排列胸苷(T)，且在第6位和第8位(“X”)排列5′－二乙基胸苷(5′－diEt－T)。

作为靶标链使用单链寡RNA5′－r(AGCAAAAAACGC)－3′(序列编号3)和单链寡DNA5′－d(AGCAAAAAACGC)－3′(序列编号4)，研究各寡核苷酸的双链形成能力(结合亲合性)。

与上述的实施例6同样评价寡核苷酸的双链形成能力。将结果表示于以下的表14。表14中，将对于单链寡RNA的结果表示为“ssRNA”，将对于单链寡DNA的结果表示为“ssDNA”，并且表示各寡核苷酸的T_m和每1个碱基人工修饰核酸的Tm变动温度(“ΔT_m/mod.”)。

[表14]

X＝5′-二乙基胸苷

使用化合物20合成的含有5′－二乙基胸苷的寡核苷酸时(上述(13)和(14))，单链寡DNA和单链寡RNA与天然的寡核苷酸(上述(12))相比，T_m值均只是略微降低，不损害结合亲合性。在增加5′－二乙基胸苷的量时，特别是不损害对于RNA的双链形成能力。

工业上的可利用性

根据本发明，提供能够作为硫代磷酸酯修饰核酸的替代的新型的5′位修饰核苷和使用其的核苷酸。本发明的5′位修饰核苷在其制造中还不需要非对映异构体的分离工序，因此工业的生产性也优异。使用本发明的5′位修饰核苷得到的寡核苷酸例如作为核酸药物中的原材料有用。

序列表

<110> 国立大学法人大阪大学

<120> 5′位修饰核苷和使用其的核苷酸

<130> P2-19O07103

<150> JP 2019-23514

<151> 2019-02-13

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列(1)

<400> 1

gcgttttttg ct 12

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列(2)

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (6)..(6)

<223> t = 5'-二甲基胸苷 (5'-diMe-T)

<400> 2

gcgttttttg ct 12

<210> 3

<211> 12

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标寡RNA

<400> 3

agcaaaaaac gc 12

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标寡DNA

<400> 4

agcaaaaaac gc 12

<210> 5

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列(5)

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (1)..(3)

<223> 2'-o-甲基修饰

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (12)..(14)

<223> 2'-o-甲基修饰

<400> 5

gcgttttttt tgcu 14

<210> 6

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列(6)

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (1)..(3)

<223> 2'-o-甲基修饰

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (7)..(7)

<223> t = 5'-二甲基胸苷 (5'-diMe-T)

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (11)..(11)

<223> t = 5'-二甲基胸苷 (5'-diMe-T)

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (12)..(14)

<223> 2'-o-甲基修饰

<400> 6

gcgttttttt tgcu 14

<210> 7

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列(7)

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (1)..(3)

<223> 2'-o-甲基修饰

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (5)..(5)

<223> t = 5'-二甲基胸苷 (5'-diMe-T)

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (8)..(8)

<223> t = 5'-二甲基胸苷 (5'-diMe-T)

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (11)..(11)

<223> t = 5'-二甲基胸苷 (5'-diMe-T)

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (12)..(14)

<223> 2'-o-甲基修饰

<400> 7

gcgttttttt tgcu 14

<210> 8

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列(8)

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (1)..(14)

<223> 2'-o-甲基修饰

<400> 8

gcguuuuuuu ugcu 14

<210> 9

<211> 14

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列(5)至(8)的互补RNA

<400> 9

agcaaaaaaa acgc 14

<210> 10

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ASO1

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (1)..(1)

<223> g = LNA-g

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (2)..(2)

<223> t = LNA-t

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (3)..(3)

<223> c = LNA-5-甲基胞嘧啶

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (12)..(12)

<223> t = LNA-t

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (13)..(14)

<223> g = LNA-g

<400> 10

gtctctttac ctgg 14

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ASO2

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (1)..(1)

<223> g = LNA-g

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (2)..(2)

<223> t = LNA-t

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (3)..(3)

<223> c = LNA-5-甲基胞嘧啶

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (7)..(7)

<223> t = 5'-二甲基胸苷 (5'-diMe-T)

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (12)..(12)

<223> t = LNA-t

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (13)..(14)

<223> g = LNA-g

<400> 11

gtctctttac ctgg 14

<210> 12

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ASO3

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (1)..(1)

<223> a = LNA-a

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (2)..(3)

<223> g = LNA-g

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (12)..(12)

<223> t = LNA-t

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (13)..(13)

<223> c = LNA-5-甲基胞嘧啶

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (14)..(14)

<223> t = LNA-t

<400> 12

aggtgctttg gtct 14

<210> 13

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ASO4

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (1)..(1)

<223> a = LNA-a

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (2)..(3)

<223> g = LNA-g

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (9)..(9)

<223> t = 5'-二甲基胸苷 (5'-diMe-T)

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (12)..(12)

<223> t = LNA-t

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (13)..(13)

<223> c = LNA-5-甲基胞嘧啶

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (14)..(14)

<223> t = LNA-t

<400> 13

aggtgctttg gtct 14

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NR3C1正向

<400> 14

actgtccagc atgccgctat 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NR3C1反向

<400> 15

gcagtggctt gctgaattcc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH正向

<400> 16

gtgtgaacgg atttggccgt 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH反向

<400> 17

gacaagcttc ccattctcgg 20

<210> 18

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列(13)

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (6)..(6)

<223> t = 5'-二乙基胸苷 (5'-diEt-T)

<400> 18

gcgttttttg ct 12

<210> 19

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列(14)

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (6)..(6)

<223> t = 5'-二乙基胸苷 (5'-diEt-T)

<220>

<221> 生物学特性无法用特性表关键词描述的序列

<222> (8)..(8)

<223> t = 5'-二乙基胸苷 (5'-diEt-T)

<400> 19

gcgttttttg ct 12