具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 PCV4-Cap基因的克隆

（1）病料的采集、处理和DNA的提取

病料于2019年12月采自于江苏某猪场断奶仔猪脾脏，每1g组织加入10mL PBS研磨，于-20℃和37℃反复冻融3次，震荡15s，3000rpm离心2min，取上清于-20℃保存备用。病料DNA的提取采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司）提取制备DNA，于-20℃保存备用。

（2）引物设计和合成

根据GenBank上公布的PCV4 Cap核酸序列（GenBank N00.: MK986820）上一段保守区设计一对特异性引物F1和R687（见表1），如SEQ ID NO：6-7所示，扩增的目的DNA片段大小为687bp。

表1 引物名称、序列、退火温度及扩增片段长度

注：GGATCC为BamHI酶切位点序列，GTCGAC为Sal I酶切位点序列。

（3）PCR扩增

将步骤（1）中提取制备DNA为模板进行PCR，在PCR管中配置反应液（如表2），盖好盖子，手指轻弹5次，瞬离后进行PCR。反应程序如下：94℃预变性2min；98℃ 10s，60℃ 30s，68℃ 2min 30s，35个循环；68℃ 10min，4℃保存。

表2 PCR反应体系

结果：由图1可以看出在500-750bp标准分子量之间有扩增得到特异性的条带。

经序列测定，PCV4 Cap基因全长687bp，全长核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例2 重组PCV4-Cap蛋白及其病毒样颗粒的制备与鉴定

（1）PCV4 Cap基因和载体的酶切与纯化

PCR扩增的PCV4 Cap基因及其截短片段进行琼脂糖凝胶电泳，拍照记录电泳结果后用PCR产物清洁试剂盒纯化，再进行双酶切反应（如表3），同时将pET28a载体置于相同的反应体系中（如表4）。酶切的PCV4 Cap基因和空载体再次用PCR清洁试剂盒纯化浓缩。

表3 目的基因酶切体系

表4 载体酶切体系

（2）重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-PCV4 Cap的构建与鉴定

将步骤（1）中纯化浓缩的目的基因与载体按下列反应体系（如表5）加入PCR管中。轻弹管底，混匀。瞬时离心，确保管壁无水珠。于16℃低温连接仪中16-18h。次日，取100μL感受态细胞BL21（DE3），将连接液中的质粒转化到感受态细胞中，无抗LB培养基中培养60min，弃去部分培养基，剩的200μL混匀后分成150μL和50μL两份分别涂布于含抗生素的平板培养基上。于恒温培养箱中培养16-10h后挑取单菌落，在相同条件下扩大培养，提取质粒。将所制备的质粒分别按照下表（如表6）中的反应体系进行加样，轻弹管底6-8次将反应物混均匀，瞬时离心，于37℃低温连接仪中酶切15min。取双酶切产物各5μL与loading Buffer混匀进行琼脂糖电泳，将酶切结果为阳性的重组质粒送华大基因测序，拼接的序列用DNAStar软件进行分析。

表5 载体与纯化PCV4 CAP连接体系

表6 重组质粒双酶切鉴定体系

（3） 重组表达菌株BL21(DE3)- pET28a-PCV4-Cap的诱导表达与目的蛋白SDS-PAGE检测

小量表达：取10μL阳性重组表达菌株和对应的空载体菌株菌液接种到2mL的LB培养基中（抗生素的终浓度为100µg•mL^-1）。次日，分别将上述菌液0.8mL菌液分别接种于4mL含抗生素（以下抗生素终浓度均为100µg•mL^-1）的液体LB培养基中，置于220r•min^-1，37℃摇床培养2.5h。取1组加入IPTG（终浓度为1mmol•L^-1），剩余的培养基中不加诱导剂IPTG作为对照组，置于37℃，220r•min^-1的摇床中诱导4h。使用细菌蛋白提取试剂盒提取上述菌株的蛋白，-80℃保存。取蛋白样品各20µL的样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后取出电泳槽，弃去浓缩胶，将分离胶裁剪为合适大小，置于含有考马斯亮蓝R250的染色皿中，45r•min^-1，染色3h，染色成功后用水洗掉染液，加入脱色液，45r•min^-1，洗脱3h，期间每隔1h更换1次脱色液。直至条带清晰可见。置于胶片观察仪上，记录实验结果。

大量表达：分别取保存的BL21(DE3)-pET28a-PCV4-Cap重组菌株菌液 50µL加入到50mL已加入50µL Kana的3瓶液体LB培养基中，放进恒温振荡器，设置参数为，37℃，230r•min^-1，过夜培养大约16-20h。次日，将活化的3瓶50mL菌液分别全部倒入200mL已加200µLKana的液体LB培养基，于37℃，230r•min^-1的恒温振荡器振荡2h。向每只锥形瓶中加入终浓度为1mmoL•L^-1的IPTG，放进恒温振荡器，设置参数为，37℃，230r•min^-1，诱导表达6h。采用离心法将750mL菌液浓缩与1个100mL的离心管中，离心参数为8000r•min^-1，10min。4℃。向管内加入30mL的灭菌PBS Buffer，使用移液枪吹打菌体，使菌体悬起，8000r•min^-1离心10min，去掉上清。往离心管中分别加入20mL的灭菌PBS Buffer，使用移液枪吹打菌体，使菌体悬起，进行冰上超声，每次超声5s，间隔5s，合计1h。将超声裂解产物10000r•min^-1，4℃，离心15min，保存一次超声上清于1个100mL的离心管中。将第一次超声后的沉淀，用20mL含终浓度为1%的TritonX-100的包涵体洗涤缓冲液，使用移液枪吹打菌体，使菌体悬起，进行冰上超声，每次超声5s，间隔5s，合计1h。将超声裂解产物10000r•min^-1，4℃，离心15min，保存二次超声上清于1个100mL的离心管中，剩下的沉淀即为要收集的包涵体蛋白。用适量包涵体溶解液将得到的包涵体蛋白溶解，为能够完全溶解借助超声10min，至液体清亮，置于-20℃保存。取蛋白样品各20µL的样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后取出电泳槽，弃去浓缩胶，将分离胶裁剪为合适大小，置于含有考马斯亮蓝R250的染色皿中，45r•min^-1，染色3h，染色成功后用水洗掉染液，加入脱色液，45r•min^-1，洗脱3h，期间每隔1h更换1次脱色液。直至条带清晰可见。置于胶片观察仪上，记录实验结果。

由图2可知，相对于空载体菌株BL21（DE3）-pET28a（泳道1和2），重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-PCV4-Cap在26-34kDa之间有明显的一条带，说明重组PCV4 Cap蛋白得到成功表达。

（4）蛋白的亲和层析纯化

本试验采用北京天恩泽基因科技有限公司《一站式His标记蛋白质微量纯化套装》试剂盒（CAT#：100102A-20）进行纯化。

（5）病毒样颗粒的鉴定

通过透射电镜（TEM）观察重组 PCV4 Cap蛋白是否形成 VLPs并拍摄照片。图3结果显示，纯化的PCV4 Cap蛋白形成了直径为10-20nm之间的病毒样颗粒，颗粒大小均一，纯度高。

实施例3 PCV4-Cap蛋白的单克隆抗体（MAb）的制备与活性鉴定

（1）免疫程序

将纯化的PCV4 Cap蛋白形成的病毒样颗粒与等体积的弗氏完全佐剂乳化，对6～8周龄BALB/c小鼠进行腹腔多点注射，免疫剂量约100μg/只；14d后将纯化的PCV4 Cap蛋白形成的病毒样颗粒蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行免疫；细胞融合前3d加强免疫，腹腔注射500μg纯化的重组蛋白PCV4 Cap。

（2）杂交瘤细胞融合

采用PEG1450将SP2/0细胞与脾细胞进行融合，按1：5～1：2比例取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞混合，离心后弃上清。缓慢加入50%PEG1400进行融合。用1%的HAT选择培养基重悬融合细胞，加至96孔细胞培养板中，置37℃、5%CO₂培养箱培养，每天观察细胞生长情况。采用间接ELISA方法进行MAb筛选，选取仅与PCV4 Cap蛋白呈阳性反应的杂交瘤细胞进行细胞克隆纯化。

（3）单克隆抗体腹水的制备

取10周龄健康BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5mL/只，7～14d后腹腔注射0.5mL杂交瘤细胞（5×10⁵～1×10⁶个/只），待小鼠腹部明显增大时抽取腹水，离心去除油脂和沉淀后即为单克隆抗体腹水，于-80℃冻存备用 。

（4）抗PCV4 Cap的MAb的鉴定

用小鼠单克隆抗体Ig类/亚类鉴定试剂盒（Pierce^@ Rapid ELISA Mouse mAbIsotyping Kit）鉴定单克隆抗体的免疫球蛋白类型。鉴定结果显示3E6为IgG2b亚型，其余2株单克隆抗体（4A7和6D5）均为IgG1亚型，轻链类型均为K。

（5）PCV4 Cap真核表达重组质粒的构建及表达蛋白与MAb的免疫反应

将PCV4 Cap基因克隆pcDNA3.1载体中构建重组质粒pcDNA-PCV4-Cap，转染猪肾细胞（PK15细胞），具体步骤为：

5.1 准备细胞：

贴壁猪肾细胞（PK15细胞）：转染前1天，将细胞接种于完全培养基中，使细胞充分生长，在转染时细胞密度将达到50-70%的融合。

5.2 准备转染试剂：充分旋涡振荡Xfect Polymer。

5.3 稀释质粒DNA：在灭菌的1.5mL EP管中，用Xfect Reaction Buffer将5µg质粒DNA（pcDNA-PCV4-Cap）稀释至最终体积为100µL。高速旋涡振荡5sec，以充分混匀。

注意事项：①在加入Xfect Polymer之前，一定要先把质粒加入Xfect ReactionBuffer；②溶液中Xfect Reaction Buffer体积不低于50µL；③每个6孔板的一个孔所用的质粒量不低于2.5µg，可以用到5-7.5µg。

5.4 制备质粒—聚合物混合物：在稀释好的质粒DNA中加入1.5µL XfectPolymer。高速旋涡振荡10sec。

注意：始终保持聚合物与DNA的比例不变。每1µg质粒DNA使用0.3µL XfectPolymer。

5.5 孵育：室温孵育10分钟，使纳米颗粒复合物形成。

注意：建议Xfect聚合物在水溶液中的停留时间不要超过30min。

5.6 瞬离：瞬时离心1sec，收集试管底部的物体。

5.7 转染：将100µL的纳米粒复合溶液滴加到细胞培养基中。前后轻轻地晃动培养板，混合均匀。

5.8 培养：37℃孵育4h，或过夜。

5.9 换液：用移液枪从细胞中吸去除纳米颗粒复合物，加入2mL新鲜完全培养基，将板放回37 ℃培养箱直到分析时间。蛋白表达高峰通常在48h左右。

5.10 设立空白对照：转染的过程中设空载体（pcDNA3.1）转染的细胞作为对照。

在转染后72h，弃掉培养基，用pH7.4 PBS洗涤3次，加入30%的丙酮-PBS，固定15min，弃掉固定液，真空干燥30min，加入200μL 1:200倍稀释的PCV4 Cap蛋白mAb，37℃ 1h。PBS洗涤3次。加入200μL 1：5000倍稀释的山羊抗鼠HRP-IgG酶标二抗，37℃ 1h，PBS洗涤3次，加入100μL AEC底物显色液，37℃ 15min。弃掉反应液，ddH₂O洗1次，显微镜观察结果。由图4可知，所制备的单克隆抗体与重组质粒pcDNA-PCV4-Cap转染细胞发生特异性的细胞核染色反应，而与空载体pcDNA3.1转染细胞无特异性染色反应，说明所制备的Mab具有良好的免疫原性。

实施例4 PCV4 Cap蛋白抗原表位的鉴定

（1）PCV4 Cap蛋白抗原表位的初步鉴定

间接ELISA方法检测：将覆盖PCV4 Cap蛋白氨基酸序列的截短肽段进行人工合成，将人工合成的肽段进行包被，50ng/孔包入ELISA板中，以杂交瘤细胞上清作为一抗，以山羊抗鼠HRP-IgG作为二抗，进行检测。结果鉴定出3个抗原表位，具体表位序列如下：

表位1（SEQ ID NO：3）：RRRSRWRRKNGIFHARFMREVTLSVSSFST

表位2（SEQ ID NO：4）：NAYYRIRKIKVEFLPLI

表位3（SEQ ID NO：5）：SIQNSNFVQVWTVRFTL

实施例5 单克隆抗体在PCV4病毒样颗粒（VLP）定量中的应用

利用制备的单克隆抗体，建立单分子成像酶联免疫吸附试验（iELISA）方法，用于定量检测目的蛋白质。

目的蛋白检测是分子生物学研究的关键步骤，在病原和疾病检测中也具有重要意义。目前比较成熟的蛋白质定量检测方法有Western blotting、胶体金试纸、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，现已得到广泛应用。Western blotting具有较高的灵敏度，常用于微量蛋白质的检测，然而，由于其样品预处理和测量操作复杂，往往耗时5个小时以上。

胶体金试纸条检测目标蛋白简单、快速，甚至可以用肉眼直接观察结果，但其灵敏度往往较差，因此其检测结果是定性的，而不是定量的。

依靠捕获抗体的高选择性，ELISA是另一种检测目标蛋白的工具。传统的ELISA方法通常需要很长时间在样品前准备中消耗，只能半定量地检测目标蛋白。然而，目前开发的ELISA程序相当快，甚至可以在几分钟内检测到目标蛋白，利用紧凑的检测装置和先进的检测算法，还可以实现高精度的定量检测。

为了实现不需要纳米颗粒和复杂微孔阵列的蛋白质定量检测，本发明提出了PCV4VLP的单分子成像酶联免疫吸附试验（iELISA）方法，具体操作如下：

（1）外套载玻片后，将盖板清洗和胺化，钉在玻璃表面上。

（2）在T50缓冲液中配制0.1-0.3mg/mL的链霉亲和素溶液，然后将10μL的链霉亲和素-T50混合液注入样室，室温孵育5min，使用T50缓冲液20μL洗涤2次，30sec/次，去多余的链霉亲和素。T50缓冲液由10mM Tris-HCl（pH=8.0）和50mM NaCl混合制备。

（3）加入混合10μL生物素化的山羊抗鼠二级抗体（溶液浓度为20-30ng/mL），室温孵育10min，使用T50缓冲液20μL洗涤2次，30sec/次，去除多余试剂；

（4）加入10μL抗PCV4 Cap蛋白VLP的小鼠单克隆抗体（溶液浓度为10-30ng/mL），室温孵育10min，使用T50缓冲液20μL洗涤2次，30sec/次，去除多余试剂；

（5）加入10μL PCV4 Cap蛋白VLP，室温孵育10min，使用T50缓冲液20μL洗涤2次，30sec/次，去除多余试剂；

（6）加入10μL兔抗PCV4 Cap蛋白VLP的多克隆抗体（浓度为20-30ng/mL），室温孵育10min，使用T50缓冲液20μL洗涤2次，30sec/次，去除多余试剂；

（7）加入10μL FITC-标记的山羊抗兔二级抗体溶液（浓度为0.5-2ng/mL）室温孵育10min，使用T50缓冲液20μL洗涤2次，30sec/次，去除多余试剂；

（8）最后，使用TIRF显微镜，在488nm波长的光激发FITC后，检测目标PCV4 Cap蛋白的VLP。

按照上述基本步骤进行三种单克隆抗体的有效性预实验，结果显示3E6、4A7的稳定性和敏感性均低于6D5单抗，6D5单抗使用浓度范围为：10-30ng/mL。依此确定以6D5单抗作为进一步的特异性、敏感性、稳定性试验评估。

（9）特异性试验：结果显示，6D5单抗能特异性的识别PCV4 Cap蛋白的VLP，而与猪圆环病毒（PCV）1型、2a/2b型、3型的Cap蛋白VLP以及猪细小病毒VP2的VLP无交叉反应，说明特异性良好（如图5）。

（10）敏感性试验：以传统的ELISA（为公众知晓的方法，在此不做重复性描述）作为对照，与PCV4 Cap蛋白VLP的单分子成像酶联免疫吸附试验（iELISA）进行敏感性对照试验，结果显示，PCV4 Cap蛋白VLP的单分子成像酶联免疫吸附试验（iELISA）检测极限值为5ng/mL，而传统ELISA的PCV4 Cap蛋白VLP检测极限为450ng/mL，说明本发明建立的PCV4 Cap蛋白VLP的单分子成像酶联免疫吸附试验（iELISA）的敏感性是传统ELISA方法的90倍。

（11）稳定性试验：按照操作程序配置试剂，分别置于-20℃、4℃、25℃和37℃保存，每隔7d抽样进行检测，评估其稳定性，结果显示，所有试剂在4℃及以下保存6个月、25℃保存、37℃保存4d稳定性良好。说明该方法4℃条件下保存稳定性。在实验室制备6批次，4℃保存，每隔7d对不同批次进行检测，结果显示，不同批次之间一致性良好，批间差异不明显，说明稳定性良好。

由此可见，6D5单抗为捕获抗体的PCV4 Cap蛋白VLP的单分子成像酶联免疫吸附试验(iELISA)能够有效、快速的定量PCV4 Cap蛋白VLP，对于后期开展PCV4疫苗抗原的定量具有重要价值。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 兆丰华生物科技（南京）有限公司

<120> 猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 687

<212> DNA

<213> PCV4-Cap基因(Artificial Sequence)

<400> 1

atgccaatca gatctaggta cagcagacgg aggcggaacc ggcggaacca gcgcaggcgg 60

agactgtggc cccgggccaa taggcggaga tcccggtgga gaaggaagaa cggaattttc 120

catgcgcgct tcatgaggga ggtgactctc agcgtgtcaa gcttttccac gccctcttgg 180

aacgttggac attacgattt caaactgaag gactttatcc caaaaggacc gggaacgatc 240

gtaaaccttt acagcctccc aaatgcatat taccggatca gaaagatcaa agtcgaattt 300

ctgccactaa ttggcattaa cagtaatagg acttactcta gcactgctat acaactggat 360

ggagactatg tgggggaagg gaaaaaccaa acttatgatg tcctggcaaa ccacagcagc 420

aggcatggtt tcaccaatat tgctagacac agtcgctatt tcactccaaa accccaagac 480

ccatccgggg aaacccacac cctccacttc cagcctaaca acaaaagaaa ccaatggtgg 540

atcagcatgg cggaccagga cctagtccat catggcctcc aatacagtat acaaaattcc 600

aactttgtgc aggtgtggac agtgagattt actttgtatg tgcaattcag agaatttgat 660

cttgttaact accccaaaca gggataa 687

<210> 2

<211> 228

<212> PRT

<213> PCV4 Cap蛋白(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Pro Ile Arg Ser Arg Tyr Ser Arg Arg Arg Arg Asn Arg Arg Asn

1 5 10 15

Gln Arg Arg Arg Arg Leu Trp Pro Arg Ala Asn Arg Arg Arg Ser Arg

20 25 30

Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe His Ala Arg Phe Met Arg Glu Val

35 40 45

Thr Leu Ser Val Ser Ser Phe Ser Thr Pro Ser Trp Asn Val Gly His

50 55 60

Tyr Asp Phe Lys Leu Lys Asp Phe Ile Pro Lys Gly Pro Gly Thr Ile

65 70 75 80

Val Asn Leu Tyr Ser Leu Pro Asn Ala Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Ile

85 90 95

Lys Val Glu Phe Leu Pro Leu Ile Gly Ile Asn Ser Asn Arg Thr Tyr

100 105 110

Ser Ser Thr Ala Ile Gln Leu Asp Gly Asp Tyr Val Gly Glu Gly Lys

115 120 125

Asn Gln Thr Tyr Asp Val Leu Ala Asn His Ser Ser Arg His Gly Phe

130 135 140

Thr Asn Ile Ala Arg His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Gln Asp

145 150 155 160

Pro Ser Gly Glu Thr His Thr Leu His Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg

165 170 175

Asn Gln Trp Trp Ile Ser Met Ala Asp Gln Asp Leu Val His His Gly

180 185 190

Leu Gln Tyr Ser Ile Gln Asn Ser Asn Phe Val Gln Val Trp Thr Val

195 200 205

Arg Phe Thr Leu Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asp Leu Val Asn Tyr

210 215 220

Pro Lys Gln Gly

225

<210> 3

<211> 30

<212> PRT

<213> 抗原表位1(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Arg Arg Ser Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe His Ala Arg

1 5 10 15

Phe Met Arg Glu Val Thr Leu Ser Val Ser Ser Phe Ser Thr

20 25 30

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 抗原表位2(Artificial Sequence)

<400> 4

Asn Ala Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Ile Lys Val Glu Phe Leu Pro Leu

1 5 10 15

Ile

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 抗原表位3(Artificial Sequence)

<400> 5

Ser Ile Gln Asn Ser Asn Phe Val Gln Val Trp Thr Val Arg Phe Thr

1 5 10 15

Leu

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 引物F1(Artificial Sequence)

<400> 6

catggatcca tgccaatcag atctaggtac agca 34

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 引物R687(Artificial Sequence)

<400> 7

catgtcgact tatccctgtt tggggtagtt aac 33